新型冠状病毒肺炎的重组新城疫病毒疫苗的制作方法

1.本发明涉及针对哺乳动物新型冠状病毒的预防性疫苗组合物和方法，进一步涉及针对哺乳动物新型冠状病毒的重组新城疫病毒的预防性疫苗组合物和方法。


背景技术：

2.新型冠状病毒性疾病(covid-19)是由新型冠状病毒(severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2,sars-cov-2)引起的传播能力极强的人兽共患病。covid-19 在全球仍然持续流行，不断危害人类生命健康。而且新型冠状病毒(sars-cov-2) 的动物感染谱也较为广泛，蝙蝠、水貂、雪貂、猫科动物等高度易感。目前，欧洲和北美大量养殖场水貂发生新冠病毒感染，已出现水貂将新冠病毒传播给人类的个案，近2千万只水貂被扑杀，给欧美水貂产业带来毁灭性打击，对我国的水貂产业也构成严重威胁。随着新冠肺炎(covid-19)疫情在全球大范围人群中流行，传入易感动物的风险极大，因此迫切需要研制安全、有效的动物用新冠肺炎疫苗，阻断疫情在易感动物中传播，避免易感动物成为中间宿主或储存宿主威胁人类的卫生健康和生命安全。到目前为止仍缺少有效预防 covid-19的方法，其中间宿主和传播途径也有待进一步证实，从而加大了防控 covid-19的难度。疫苗是阻断、消除人间covid-19最有效最有潜力的途径。寻找抗原性更优的sars-cov-2病毒的抗原依然是目前研究的热点。进一步制备用于动物的covid-19的疫苗是阻断、消除covid-19在动物之间以及人畜之间传播的最有效的手段。
3.新城疫病毒为副粘病毒，可同时诱导体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫；lasota 是新城疫病毒经典弱毒疫苗株，遗传相对稳定，毒株间发生重组及毒力返强可能性极小。
4.本发明研究人员在对sars-cov-2病毒抗原研究的基础上，构建了针对哺乳动物sars-cov-2的重组新城疫病毒载体，从而完成了本发明。


技术实现要素：

5.sars-cov-2的刺突蛋白(spike protein,s)是病毒受体结合蛋白和主要毒力因子之一，决定着病毒的感染谱和致病力，同时也是一个有效的免疫原，是抗 sars-cov-2感染过程中诱导宿主免疫反应的主要免疫原。本发明人通过专注研究冠状病毒s蛋白部分位点氨基酸的改变对s蛋白三聚体的空间构象的影响，以及furin裂解位点的突变缺失对s蛋白空间构象的稳定性影响的研究构建了改造的sars-cov-2的刺突蛋白。
6.因此，本发明首先提供了一种包含改造的sars-cov-2的刺突蛋白(sa)的疫苗组合物，该改造的sars-cov-2的刺突蛋白(sa)包含组织型纤溶酶原激活因子信号肽(tpa)。
7.进一步，本发明改造的sars-cov-2的刺突蛋白(sa)是将s蛋白基因信号肽替换为组织型纤溶酶原激活因子信号肽(tpa)。
8.进一步的，该改造的sars-cov-2的刺突蛋白(sa)还进一步将如下6个位点氨基酸残基均突变为脯氨酸：f817p、a892p、a899p、a942p、k986p、v987p，获得改造的sars-cov-2的刺突蛋白(s6pa)。
9.在一个具体实施方案中，本发明的疫苗组合物包含改造的sars-cov-2的刺突蛋白(sa)，该改造的sars-cov-2的刺突蛋白(sa)选自命名为sa-tpa-1 (seq id no：1)的刺突蛋白,进一步sa蛋白furin裂解位点删除，获得改造的 sars-cov-2的刺突蛋白(sb)选自命名为sb-tpa-1(seq id no：2)的刺突蛋白。
10.在一个具体实施方案中，该疫苗组合物包含改造的sars-cov-2的刺突蛋白 (s6pa)，该改造的sars-cov-2的刺突蛋白(s6pa)选自命名为s6pa-tpa-1 (seq id no：3)的刺突蛋白,进一步s6pa蛋白furin裂解位点突变缺失，获得改造的sars-cov-2的刺突蛋白(s6pb)选自命名为s6pb-tpa-1(seq id no： 4)的刺突蛋白。
11.在一个实施方案中，该改造的sars-cov-2的刺突蛋白(sa)或其免疫原性衍生物包含来自seq id no：1的氨基酸序列。
12.在一个实施方案中，该改造的sars-cov-2的刺突蛋白(sb)或其免疫原性衍生物包含来自seq id no：2的氨基酸序列。
13.在一个实施方案中，该改造的sars-cov-2的刺突蛋白(s6pa)或其免疫原性衍生物包含来自seq id no：3的氨基酸序列。
14.在一个实施方案中，该改造的sars-cov-2的刺突蛋白(s6pb)或其免疫原性衍生物包含来自seq id no：4的氨基酸序列。
15.进一步的，该改造的sars-cov-2的刺突蛋白(sa/sb)或(s6pa/s6pb)或其免疫原性衍生物由病毒载体编码，所述病毒载体优选新城疫病毒载体，进一步优选新城疫病毒lasota弱毒株为载体。
16.其次，本发明提供一种重组新城疫病毒疫苗组合物，所述疫苗组合物包括由病毒载体编码改造的sars-cov-2的刺突蛋白(sa/sb)或(s6pa/s6pb)，所述病毒载体优选新城疫病毒载体，进一步优选新城疫病毒lasota弱毒株为载体。
17.进一步，重组新城疫病毒被命名为重组rla-tpa-sa或
18.rla-tpa-sb，或rla-tpa-s6pa或rla-tpa-s6pb。
19.在一个具体实施方案中，本发明的疫苗组合物是口服疫苗，在另一个具体的实施方案中，本发明的疫苗组合物是亚单位疫苗.
20.在一个方面，本发明的疫苗组合物还包含佐剂。在一个实施方案中，佐剂选自：水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素e 佐剂及其组合。在一个具体实施方案中，佐剂包含油乳剂，该油乳剂包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、角鲨烷、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯和缓冲盐溶液(sp
‑ꢀ
油)。在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物还包含药学上可接受的载体。
21.在另一个实施方案中，本发明的疫苗组合物还可以包含至少一种额外的抗原。在某些实施方案中，至少一种额外的抗原保护性地抵御可以引起哺乳动物疾病的微生物。
22.第三方面，本发明提供一种嵌合核酸分子，其包含编码新城疫病毒lasota 弱毒株的核酸分子和编码改造的sars-cov-2的刺突蛋白(sa/sb)或(s6pa/s6pb) 的核酸分子(seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7、seq id no： 8)。
23.第四方面，本发明还提供了保护哺乳动物免受新型冠状病毒sars-cov-2感染的方法。该方法包括向哺乳动物施用免疫有效量的本发明公开的疫苗组合物、嵌合核酸分子。在多种实施方案中，该方法包括通过选自经口服、胃肠道外、经鼻、皮内和经皮的一种或多于
一种途径向哺乳动物施用疫苗组合物、嵌合核酸分子。在另一个实施方案中，疫苗组合物、嵌合核酸分子以单剂量施用。在另一个实施方案中，组合物与至少一种额外的抗原联合施用，该额外的抗原保护性地抵御可以引起哺乳动物疾病的微生物。
附图说明
24.图1：sars-cov-2s蛋白突变体tpas6pb基因的设计
25.图2：间接免疫荧光检测tpas6pb蛋白基因在重组新城疫病毒感染bhk细胞中的表达 (分别用重组病毒rla-tpas6pb和亲本株lasota感染bhk细胞，24h后以抗sars-cov-2s 蛋白鼠血清和抗ndv鸡血清为一抗，绿色荧光素(fitc)标记的山羊抗鼠igg和tritc 标记的兔抗鸡igg为二抗，进行荧光染色。)
26.图3:western blot分析sars-cov-2s蛋白在重组新城疫病毒感染bhk细胞中的表达 (1：蛋白质maker；2：亲本株lasota感染的bhk细胞；3：重组病毒rla-tpas6pb感染的 bhk细胞。)
27.图4：重组病毒rla-tpas6pbb对小鼠的免疫效力 (分别用重组病毒rla-tpa6pb和亲本病毒rlasota，按108eid
50
/只的剂量，间隔3周经肌肉接种途径两次免疫balb/c小鼠。在免疫前和免疫后的不同时间点采集、分离血清用于检测sars-cov-2中和抗体滴度。)
28.图5：重组病毒rla-tpas6pb免疫小鼠攻毒前的中和抗体滴度 (分别随机选取6只重组病毒rla-tpas6pb免疫小鼠(mouse 1～mouse 6)和rlasota免疫小鼠(mouse 7～mouse 12)，用于sars-cov-2攻击试验。于sars-cov-2攻击前采集、分离血清并检测sars-cov-2中和抗体滴度)。
29.图6:重组病毒rla-tpas6pb免疫小鼠攻毒结果 (按10
3.6
pfu/50μl/只的剂量，用sars-cov-2hrb26m株病毒经滴鼻途径攻击重组病毒 rla-tpas6pb免疫小鼠(mouse 1、mouse 2、mouse 3、mouse 4、mouse 5和mouse 6)和亲本株病毒lasota免疫小鼠(mouse 7、mouse 8、mouse9、mouse 10、mouse 11和mouse 12)。攻毒后第3天和第5天，每组分别剖杀3只小鼠，用于检测小鼠鼻甲和肺脏中的sars-cov-2 复制、增殖情况。)
具体实施方式
30.虽然下面详细讨论了本发明各种实施方案的进行和使用，但应该理解，本发明提供了许多可以在各种特定情况下使用的可适用的发明概念。这里讨论的具体实施方案仅说明进行和使用本发明的具体方式，并不限制本发明的范围。
31.s蛋白单体情况下，rbd区存在关闭沉降和上升开放两种状态。rbd的关闭沉降状态覆盖了s2亚基部分氨基酸，削弱s蛋白的免疫原性；rbd上升开放状态则是解离s2亚基，可充分发挥其免疫原性。相较野生型s蛋白，k986p、v987p 这两个联合突变可使具有高免疫原性和可移动特性的rbd处于稳定的上升开放状态，提高表达s蛋白的免疫原性；f817p、a892p、a899p、a942p突变则可使s 蛋白的表达量增高约10倍，并具有耐热、室温贮藏和3次冻融循环的能力； sars-cov-2s蛋白基因的furin裂解位点突变缺失可保留了sb蛋白的预融合构像，不裂解成s1和s2亚基，提高了sb和s6pb蛋白的抗原性。
32.本发明通过例举性的实施在新型冠状病毒s蛋白基因密码子优化的基础上，用组织型纤溶酶原激活因子信号肽(tissue plasminogen activator signal sequence, tpa)
基因序列替换s蛋白信号肽基因序列，同时将6个位点氨基酸残基均突变为脯氨酸(f817p、a892p、a899p、a942p、k986p、v987p)，再将s蛋白furin 裂解位点突变缺失，人工合成新型冠状病毒s蛋白变体s6pb基因。以新城疫病毒lasota弱毒疫苗株为疫苗载体，构建了表达新型冠状病毒s蛋白变体s6pb 基因的重组新城疫病毒lasota弱毒疫苗株rla-tpas6pb。间接免疫荧光和westernblot试验结果证实：s蛋白突变体s6pb基因在重组新城疫病毒rla-tpas6pb感染的细胞中获得正确表达，表达的s6pb蛋白具有良好的反应原性。。
33.为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。本发明定义的术语具有本发明相关领域中普通技术人员通常理解的含义。
34.如本发明所用术语“包含”、“包括”、“含有”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。
35.术语“抗原”是指可以在动物中刺激抗体或t细胞应答或两者的产生的化合物、组合物或免疫原性物质，其包括口服、注射或吸收到动物体内的组合物。可以对整个分子或分子的一部分(例如表位或半抗原)产生免疫应答。
36.如本发明所定义的，“免疫原性组合物或免疫组合物”是指包含至少一种抗原的物质的组合物，该抗原在宿主中引发对感兴趣的组合物或疫苗的细胞的免疫应答和/或抗体介导的免疫应答。
37.本发明所用的“佐剂”是指由一种或多于一种增强对抗原的免疫应答的物质组成的组合物。佐剂如何起作用的机制尚不完全清楚。一些佐剂被认为通过缓慢释放抗原来增强免疫应答，而其他佐剂本身具有强免疫原性并被认为起到协同作用。
38.本发明所用的术语“哺乳动物”是指包括人、及对新型冠状病毒易感的哺乳动物，例如人、蝙蝠、狮子、老虎、恒河猴、食蟹猴、水貂、雪貂、猫、狗等。
39.如本文所用术语“药学上可接受的载体”是指用于包含可以口服或注射到宿主中且没有副作用的疫苗抗原的流体载体。本领域已知的合适的药学上可接受的载体包括但不限于无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖或缓冲溶液等。载体可包括助剂包括但不限于稀释剂、稳定剂(糖和氨基酸)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、ph 缓冲剂、黏度增强添加剂、着色剂等。
40.如本文所用术语“疫苗组合物”包括在药学上可接受的载体中的至少一种抗原或免疫原，其可用于在宿主中诱导免疫应答。疫苗组合物可以按剂量施用并通过医学或兽医领域技术人员熟知的技术施用，同时考虑例如接受体动物的年龄、性别、体重、物种和状况、以及给药途径等因素。给药途径可以是经皮(通过皮内、经皮、皮下、肌内途径而穿过皮肤或通过口腔、鼻腔、肛门、阴道而穿过黏膜)或通过肠胃外途径(静脉内或腹膜内)。疫苗组合物可以单独施用，或者可以与其他治疗或疗法共同施用或按顺序施用。给药形式可包括混悬剂、糖浆剂或酏剂，以及用于肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内给药(例如注射给药)的制剂，例如无菌混悬剂或乳剂。疫苗组合物可以以喷雾形式给药或混合于食物和/或水中或与合适的载体、稀释剂、或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖等混合递送。该组合物可含有辅助物质，如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂、佐剂、凝胶化或黏度增强添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等，这取决于给药途径和所需制剂。
41.为了公开的完整性，包括了以下实施例以说明制备本发明组合物和复合物的方法以及呈现组合物的某些特征。这些实施例决不旨在限制本公开的范围或教导。
42.实施例1：材料与方法
43.1.1病毒株
44.新城疫病毒lasota弱毒疫苗株反向遗传操作系统由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所重要人兽共患病与烈性外来病创新团队建立并保存；sars-cov-2小鼠适应株hrb26m是由中国农业科学院国家动物疫病防控高级别生物安全实验室保存。
45.1.2细胞
46.bhk细胞(atcc no.ccl-10)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所重要人兽共患病与烈性外来病创新团队保存、培养。bhk细胞培养液为含10％胎牛血清的dmem。
47.1.3质粒与试剂
48.ndv lasota全基因组克隆质粒pbrn-fl及辅助质粒pbs-np、pbs-p、pbs-l 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所重要人兽共患病与烈性外来病创新团队构建、保存。高保真dna聚合酶(phanta max super-fidelity dna polymerase)、快速克隆试剂盒(clonexpress ultra one step cloning kit)购自南京诺维赞生物科技股份有限公司。x-tremegene
tm
9dna转染试剂购自merck公司。抗 sars-cov-2s蛋白多克隆抗体、抗sars-cov-2s蛋白单克隆抗体由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所重要人兽共患病与烈性外来病创新团队制备。绿色荧光素(fitc)标记的山羊抗鼠igg购自北京中杉金桥生物技术有限公司。红外荧光标记的驴抗鼠igg购自life technologies公司。胎牛血清，opti-mem均购自 gbico公司；fitc标记的兔抗鸡igg抗体、tritc标记的山羊抗鼠igg抗体、辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗小鼠igg和hrp标记兔抗鸡igg均购自 sigma公司。
49.按人工合成的方法合成sars-cov-2s蛋白突变体tpas6pb(s6pb)基因，并将其克隆至pbluescript ii( /-)(clontech)的ecor v位点，命名为pblue-tpas6pb。 s6pb基因是在sars-cov-2s蛋白基因按哺乳动物密码子偏嗜性进行优化的基础上，将该蛋白基因2449-2451位、2674-2676位、2695-2697位、2824-2826位、 2956-2958位和2959-2961位碱基均突变为“ccc”，由此将上述碱基编码的第817 位苯丙氨酸(phenylalanine,phe,f)、第892位丙氨酸(alanine,ala,a)、第899 位丙氨酸(alanine,ala,a)、第942位丙氨酸(alanine,ala,a)、第986位赖氨酸(lysine,lys,k)和第987位缬氨酸(valine,val,v)均突变为脯氨酸(proline, pro,p)；将sars-cov-2s蛋白裂解位点基因2044-2055位碱基突变为“ggctccgcctcc”，由此裂解位点氨基酸由“rrar”突变为“gsas”[精氨酸 (arginine,arg,r)，甘氨酸(glycine,gly,g)丝氨酸(serine,ser,s)]；同时用组织型纤溶酶原激活因子(tissue plasminogen activator,tpa)的信号肽基因替代sars-cov-2s蛋白信号肽基因构成s6p基因(图1)；在s6p基因的起始密码子atg前插入kozak序列“gccgccacc”。
[0050]
1.4引物设计与合成
[0051]
根据tpas6pb蛋白基因序列、以ndv病毒lasota基因组插入位点pmei序列为同源臂，设计了构建表达tpas6pb蛋白基因的重组ndv全长质粒的同源重组引物(表2)。
[0052]
表2表达sars-cov-2 tpas6pb基因重组ndv全基因组质粒所用引物
[0053]
[0054]
1.5表达tpas6pb蛋白基因重组新城疫病毒的构建
[0055]
用限制性内切酶pmeⅰ酶切、线性化pbrn-fl，胶回收纯化线性载体。采用pcr方法，以pblue-tpas6pb为模板，用引物ndv-tpaos6pb-pf和 ndv-opts-tpa-pr扩增tpas6pb基因，胶回收纯化tpas6pb基因。利用快速克隆试剂盒，将tpas6pb蛋白基因顺序克隆至载体pbrn-fl的pmeⅰ位点，构成含有tpas6pb蛋白基因的重组全基因组克隆质粒pbrn-fl-tpas6pb。
[0056]
bhk细胞接种于35mm六孔板中，待过夜生长至80％～90％单层时，分别用稳定表达t7聚合酶的重组痘病毒vtf-3，按m.o.i约0.01的剂量，感染过bhk 细胞，5％co2、37℃环境感作1小时后，更换新鲜的完全培养基。重组质粒 pbrn-fl-tpas6pb及辅助质粒pbs-np、pbs-p、pbs-l，采用脂质体转染的方法共转染bhk细胞。转染8～12h后，换成新鲜的完全培养基，然后每孔加入阿拉伯糖苷(10μg/ml)，37℃孵育24h后换成opti-mem，并加入阿拉伯糖苷和tpck(1μg/ml)。37℃继续孵育72h后，收获培养物上清，接种于9～ 10日龄spf鸡胚尿囊腔中。5d后，取尿囊液进行新城疫病毒的血凝试验(ha) 和血凝抑制试验(hi)。收获ha和hi均呈阳性结果的尿囊液，分装后-70℃冻存，重组病毒命名为rla-tpas6pb。
[0057]
1.6间接免疫荧光检测
[0058]
重组病毒rla-tpas6pb按照m.o.i为0.01的量感染生长于24孔板中的bhk 细胞，并接种亲本株lasota做为对照。细胞培养24h后用冰冷3％多聚甲醛固定，分别以1:100倍稀释抗sars-cov-2s蛋白小鼠血清和鸡抗ndv高免血清为一抗，以spf鸡阴性血清为阴性对照；以荧光素(fitc)标记的山羊抗鼠igg 和荧光素(tritc)标记的兔抗鸡igg(sigma)为二抗，共聚焦法进行ifa检测。
[0059]
1.7western bloting
[0060]
取重组病毒rla-tpas6pb，过量感染bhk细胞，72h后收集细胞，裂解细胞产物进行sds-page，再转印至nc膜上。nc膜用含3％bsa的pbs溶液于4℃封闭过夜。分别以1：100稀释的鸡抗ndv多抗和1：100倍稀释的抗sars-cov-2 s蛋白小鼠血清为一抗，红外荧光标记的驴抗鼠igg和山羊抗鸡igg为二抗，通过odyssey infrared成像系统成像并分析各重组新城疫病毒的蛋白表达情况。
[0061]
1.8重组病毒rla-tpas6pb对balb/c小鼠的免疫试验
[0062]
为了评估表达sars-cov-2s蛋白的重组病毒rla-tpas6pb在小鼠上的免疫效力，取6周龄雌性balb/c小鼠10只，用重组病毒rla-tpas6pb按3
×
10
8 eid
50
/100μl/只的剂量经肌肉注射途径免疫小鼠，间隔3周免疫接种两次，以亲本株lasota免疫小鼠作为对照组。在小鼠免疫前、初次免疫后第3周和第5周经眶下静脉丛采血，分离血清，同组小鼠同一时间点的血清混合后，在56℃水浴灭活30min，用病毒中和实验法检测sars-cov-2中和抗体。
[0063]
1.9重组新城疫病毒rla-tpas6pb对balb/c小鼠的攻毒保护效力试验
[0064]
初次免疫后第6周，重组疫苗免疫小鼠和对照小鼠经眶下静脉丛采血，分离血清，用于sars-cov-2中和抗体检测。同时，按10
3.6
pfu/50μl/只的剂量，用 sars-cov-2hrb26m株病毒经滴鼻途径接种。攻毒后第3天和第5天，每组各剖解3只小鼠，采集鼻甲和肺脏，用实时荧光定量pcr的方法进行病毒载量检测。
[0065]
1.10中和试验
[0066]
检测血清中sars-cov-2中和抗体的中和试验在96孔板上进行，步骤如下：首先将血清样品置于56℃水浴30min进行灭活，再将血清样品分别以不完全 dmem连续倍比稀释，
每稀释度体积为50μl，与50μl约含100pfu的 sars-cov-2hrb25株病毒液混合，37℃感作1h后，每孔加入约105vero e6 细胞，5％co2、37℃培养48h后，置于显微镜下观察sars-cov-2hrb25株病毒感染形成的蚀斑情况。每个血清稀释度做4个重复。血清中sars-cov-2中和抗体滴度被定义为能抑制50％蚀斑产生的最高血清稀释倍数。
[0067]
1.11实时荧光定量pcr
[0068]
采用实时荧光定量pcr方法测定组织样品中的病毒载量。针对 sars-cov-2n基因的实时荧光定量pcr特异性引物和荧光探针均参照中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所发布的信息(http://nmdc.cn/ncov)，具体如下：上游引物：5
’‑
ggg gaa ctt ctc ctg cta gaa t-3’；下游引物,5
’‑
cag acattt tgc tct caa gct g-3’，荧光探针为：5
’‑
fam-ttg ctg ctg ctt gacaga tt-tamra-3’。利用病毒rna提取试剂盒qiaampvrnaminikit(qiagen) 提取病毒rna后，应用hiscript ii q rt supermix for qpcr(vazyme)试剂盒进行反转录，再应用dna聚合酶premix ex taq for probe qpcr(taraka,china)，在实时荧光定量pcr仪(applied biosystemsquantstudio 5real-time pcr system, thermo scientific)上进行qpcr。sars-cov-2rna的拷贝数是通过利用质粒 pbluescript ii sk-n(将全长的sars-cov-2n基因克隆到pbluescript ii sk上构成)绘制的标准曲线进行计算、校正。该qpcr方法的检测下限为1000拷贝/ml。
[0069]
实施例2：实验结果
[0070]
2.1表达s6pb蛋白基因重组新城疫病毒的构建
[0071]
根据成基因tpas6pb序列信息，利用引物在tpas6pb基因末端引入酶切位点和基因调控序列。用同源重组引物合成基因片段，与同样经pme i处理的载体 pbrn-fl-pmei进行同源重组克隆，获得表达tpas6pb基因重组新城疫病毒全长cdna克隆pbrn-fl-tpas6pb。
[0072]
将pbrn-fl-tpas6pb与辅助质粒pbs-np、pbs-p、pbs-l共转染bhk细胞，获得血凝试验(ha)和血凝抑制试验(hi)阳性的重组病毒rla-tpas6pb。以特异性引物对重组病毒进行rt-pcr检测并测序，结果所获pcr产物序列与预期目的片段相符，证明tpas6pb基因成功插入重组病毒基因组。
[0073]
2.2间接免疫荧光检测救获的重组病毒
[0074]
拯救的重组病毒rla-tpas6pb以moi为0.01感染bhk细胞，同时设定lasota接种细胞作为阴性对照。接种细胞37℃培养24h后共聚焦法进行间接免疫荧光检测，结果显示重组病毒组呈现sars-cov-2s蛋白和ndv蛋白的共表达，lasota对照细胞仅呈现针对ndv抗体的阳性结果(图2)。
[0075]
2.3western bloting
[0076]
蛋白样品经电泳转印后，重组病毒rla-tpas6pb接种的细胞样品以鼠抗 sars-cov-2和鸡抗ndv高免血清为一抗进行wb检测。结果相比较lasota对照细胞样品，rla-tpas6pb接种的细胞样品出现特异性条带，与相应外源蛋白预期大小相符。以鸡抗ndv为一抗的wb检测结果中，两个样品泳道上均出现 ndv特异性条带(图3)。western blot检测结果说明tpas6pb蛋白在重组病毒中得到了正确表达，并具有良好的反应原性。
[0077]
2.4重组病毒对小鼠的免疫效力
[0078]
为了评估重组新城疫病毒rla-tpas6pb对小鼠的免疫原性，用重组病毒 rla-tpas6pb经肌肉注射途径免疫小鼠10只，并间隔3周进行加强免疫。结果显示：初次免疫后3
周，即可在重组病毒rla-tpas6pb免疫接种的小鼠血清中能检测到sars-cov-2中和抗体，抗体滴度为32。而免疫对照小鼠血清中则检测不到sars-cov-2中和抗体。第二次免疫后2周，rmva-tpas6pb免疫小鼠血清中sars-cov-2中和抗体滴度上升至512。结果表明，重组病毒rla-tpas6pb具备成为动物用新冠肺炎活载体疫苗的潜力(图4)。
[0079]
2.5重组病毒对小鼠的攻毒保护效力
[0080]
为了评估表达sars-cov-2s蛋白基因的重组新城疫病毒rla-tpas6pb对小鼠的保护效力，初次免疫后15周，随机各选取6只重组病毒rla-tpas6pb免疫接种小鼠和rlasota免疫接种小鼠，用于sars-cov-2攻击试验。攻毒前对rlasota 免疫接种小鼠血清中仍然检测不到sars-cov-2中和抗体，而小鼠血清中 sars-cov-2中和抗体进行检测(图5)。rla-tpas6pb免疫接种小鼠血清中可检测到高水平的sars-cov-2中和抗体，滴度分别为128，256，64，32，128和 64。
[0081]
rla-tpas6pb免疫小鼠和亲本株rlasota免疫接种小鼠用sars-cov-2 hrb26m株病毒经滴鼻途径攻击。攻毒后第3天，亲本株rlasota接种小鼠的鼻甲和肺脏均能检测到高拷贝的病毒核酸和高滴度的sars-cov-2活病毒；而3只 rla-tpas6pb免疫小鼠中有1只的鼻夹和肺脏均可检测到病毒核酸，但其鼻甲病毒分离滴定的结果仍低于对照组小鼠，肺部病毒分离结果为阴性；另外2只其中 1只鼻甲检测到病毒核酸，拷贝数稍低于对照组小鼠的检测结果，另外1只肺检测到病毒核酸，但拷贝数显著低于亲本株rlasota接种对照组小鼠，这2只小鼠的鼻甲和肺均分离不到活病毒。攻毒后第5天，亲本株rlasota接种小鼠的鼻甲和肺脏仍能检测到高拷贝的病毒核酸和高滴度的活病毒；而3只rla-tpas6pb免疫小鼠鼻甲和肺脏均检测不到病毒核酸，活病毒分离结果也全部为阴性(图6)。结果表明，重组病毒rla-tpas6pb免疫小鼠诱导产生了良好的中和抗体反应，并效清除了小鼠体内的sars-cov-2活病毒。
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以上结果表明，重组新城疫病毒rla-tpas6pb具有良好的免疫原性和攻毒保护效力，能够成为动物用新型冠状病毒肺炎疫苗而且重组新城疫病毒rla-tpas6pb具有良好的安全性、口服免疫原性和攻毒保护效力。