脂肪酶变体及其组合物
1.序列表的引用
2.本技术含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
3.发明背景
技术领域
4.本发明涉及脂肪酶变体、编码所述脂肪酶变体的多核苷酸、包含脂肪酶变体的组合物、以及产生所述脂肪酶变体的方法和脂肪酶变体或其组合物的用途。
背景技术：
5.脂肪酶是重要的生物催化剂，其已经示出对于不同应用是有用的。脂肪酶作为洗涤剂组合物中的活性成分已被商业化，用于通过水解甘油三酯以产生脂肪酸来去除脂质污渍。当前的清洁和/或织物护理组合物包含许多成分，这些成分干扰脂肪酶的性能并且因此干扰脂肪酶去除脂质污渍的能力。
6.wo 1996/013578涉及包含衍生自犁头霉属(absidia)菌株的脂肪分解酶的洗涤剂组合物。
7.wo 1997/027276涉及编码具有犁头霉属脂肪酶活性的多肽的核酸序列。
8.wo 2017/005816涉及具有改善的稳定性的犁头霉属脂肪酶变体。
9.wo 2017/005798涉及在去除脂质污渍期间减少气味产生的犁头霉属脂肪酶变体。
10.因此，需要可以在用于清洁的组合物的严苛环境中起作用的犁头霉属脂肪酶。
11.对于具有改善的洗涤性能的脂肪酶和脂肪酶变体存在需要和期望。
技术实现要素：
12.本发明提供了与其亲本相比具有改善的特性的脂肪酶变体，优选地如seq id no:2所示的脂肪酶。所述改善的特性可以是选自以下中的一种或多种：热稳定性增加；洗涤剂中热稳定性增加；洗涤剂中水解活性增加；和洗涤剂中稳定性增加。本发明提供了脂肪酶变体，这些变体包括但不限于在不同清洁应用中特别有用的变体。本发明还提供了使用了本发明的脂肪酶变体的清洁方法。
13.本发明的脂肪酶变体可用于清洁。通过向亲本脂肪酶(特别是如seq id no:2所示的亲本脂肪酶)中引入修饰(例如取代)来获得变体。
14.本发明涉及改善的脂肪酶变体和包含本发明的脂肪酶变体的组合物。
15.在第一方面，本发明涉及如seq id no:2所示的多肽的亲本脂肪酶的变体，其中：
16.i)所述变体是具有脂肪酶活性的多肽；
17.ii)所述变体是与如seq id no:2所示的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％、但小于100％序列同一性的多肽；
18.iii)所述变体是由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与如seq id no:1所
示的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列同一性；
19.iv)所述变体是具有脂肪酶活性的ii)或iii)的多肽的片段；
20.其中所述变体包含：
21.(a)对应于以下的取代：
22.d4a；i7d；k14e；t17s；g34d；r36e；r36m；r36v；r36q；s38d；s38e；g43d；g43h；n47d；n47e；n47g；n47h；q49t；q49v；l57s；d60g；d60v；g68i；e69m；e69t；k70d；k70h；k70q；a89y；v94d；v94l；n102m；g109r；q118s；k120a；k120d；k120e；k120n；k120m；k120g；k120p；k120q；k120s；k120v；a123e；k136g；h158e；h158q；h161d；h161e；a162s；n163e；n163h；i174a；p177g；p177i；p177k；p177l；a178i；a178l；a178t；a178v；n181k；n181l；n181t；n181w；y182w；v183m；i184v；g185a；g185i；g185k；g185r；g185t；g185w；g185y；k187g；k187l；p189a；p189l；p189m；p189n；p189q；p189r；p189t；p189v；p189w；i199t；i199v；e196m；s206g；s206v；a207n；l211c；r223a；r223e；r223g；r223h；r223k；r223n；r223q；s224t；i232p；232q；t234s；d235a；i248l；s252n；l260f；和/或
23.(b)对应于以下的取代：n163e r223n；k70e s206g；r101v s206v；a15e k120q；d130r s206g；d130r s206v；t2s a15e；和/或
24.(c)对应于以下的取代：
25.r36v v183m r223n；n47h k70e s206g；n163e r223n s252n；n47d k120g r223n；g43d n47d k120g；k70e h195s s206g；k70e l156f s206g；a178y p189v r223n；r36e g43d n47d；k70d n163e s252n；n47d k120g n163e；k70e p189q s206g；r36t k70e s206g；r36i k70e s206g；q49t k70e s206g；g43d k70e s206g；r36k k70e s206g；k70e p189m s206g；k52a k70e s206g；r36m k70e s206g；r36e k70e s206g；r101v s206v r223s；r36v n47d k120g；k14a k70e s206g；d4c s206g n236c；k70e g185l s206g；r36y k70e s206g；r36l k70e s206g；k70e p189l s206g；r36a k70e s206g；r101v d130r s206g；d4c s206g n236c；d4c s206v n236c；r36f k70e s206g；k70e k120p s206g；和/或
26.(d)对应于以下的取代：
27.n163e g185h r223n s252n；n163e n181w r223n s252n；k70d n163e r223n s252n；d4c s206g n236c s252n；d4c s206g r223n n236c；a178y v183m p189v r223n；和/或
28.(e)对应于以下的取代：
29.d4c p189v s206g r223n n236c；d4c n163e s206g n236c s252n；d4c n163e s206g r223n n236c；d4c a178y s206g r223n n236c；d4c k108a d130r s206v n236c；和/或
30.(f)对应于以下的取代：s1c a8c t17c l225r n230c l254c；s1c a8c t17c l225r n230c l254c；d4c n97d r101v d130r s206v n236c；和/或
31.(g)对应于以下的取代：
32.s1c a8c t17c i184n l225c n230c l254c；s1c a8c t17c y75f l225c n230c l254c；s1c a8c t17c q49l l225c n230c l254c；s1c a8c t17c y167f l225c n230c
l254c；s1c a8c t17c y190f l225c n230c l254c；s1c a8c t17c q49i l225c n230c l254c；s1c a8c t17c l225c n230c f244n l254c；s1c a8c a15e t17c l225c n230c l254c；s1c a8c t17c a162s l225c n230c l254c；s1c a8c t17c v183s l225c n230c l254c；s1c a8c t17c i164l l225c n230c l254c；s1c a8c t17c y19f l225c n230c l254c；s1c a8c t17c e165s l225c n230c l254c；s1c a8c t17c q49s l225c n230c l254c；s1c a8c t17c k187n l225c n230c l254c；s1c a8c a15r t17c l225c n230c l254c；和/或
33.(h)对应于以下的取代：
34.r101v a131r a152s n176t s206g r223s f247v g255d；s1c d4n r6s a8c t17c l225c n230c l254c；r101v a131r a152s n176t s206g r223s f247v g255d；s1c a8c t17c k136n v138s l225c n230c l254c；a26c i32c a45v q49k n97d d130r h159k s224r；s1c a8c t17c k70e i184n l225c n230c l254cs1c a8c t17c v76i l225c n230c l254c；和/或
35.(i)对应于以下的取代：
36.s1c a8c t17c h159k h161n n163s l225c n230c l254c；s1c a8c t17c v76i v138l i164l l225c n230c l254c；和/或
37.(j)对应于以下的取代：
38.s1c a8c t17c s38t v76i v138l i164l l225c n230c l254c；和/或
39.(k)对应于以下的取代：
40.a8c t17c r36n g43d q49t k70n k72s k120g s206v r223n l225c l254c；和/或
41.(l)对应于以下的取代：
42.a8c t17c r36v s38d g43d n47d q49n k70n k72s k120g t148v e165s n181w s206v r223h l225c l254c。
43.在一个实施例中，与亲本脂肪酶相比，本发明的脂肪酶变体具有改善的洗涤性能。可以将改善的洗涤性能确定为洗涤性能评分(wps)。在一个优选的实施例中，与亲本脂肪酶(特别是seq id no:2的亲本脂肪酶)相比，本发明的脂肪酶变体的洗涤性能评分(wps)(如在实例3中定义)为“ ”，优选地“ ”，更优选地“ ”，甚至更优选地“ ”。
44.所述亲本脂肪酶可以包含如seq id no:2所示的多肽序列或由其组成，或可以是与如seq id no:2所示的脂肪酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽。
45.在一方面，本发明涉及包含本发明变体的组合物。本发明的组合物可以进一步包含表面活性剂或表面活性剂系统，其中所述表面活性剂选自下组：非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂及其混合物。在一个实施例中，本发明的组合物包含阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂。在一个实施例中，所述组合物包含阴离子表面活性剂，特别是直链烷基苯磺酸酯(las)，和非离子表面活性剂。在一个实施例中，所述组合物包含阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，特别地醇乙氧基化物(aeo)。在一个实施例中，所述组合物包含阴离子表面活性剂las和非离子表面活性剂aeo。在一个优选的实施例中，本发明的组合物包含
下文实例3中披露的标准洗涤剂x中的一种或多种(优选地所有)组分或由其组成。
46.本发明还涉及用于清洁表面的方法，所述方法包括使所述表面与本发明的脂肪酶变体或本发明的组合物接触。
47.在另一方面，本发明涉及水解脂肪酶底物的方法，所述方法包括用本发明的脂肪酶变体或本发明的组合物处理所述脂肪酶底物。
48.本发明还涉及编码本发明脂肪酶变体的多核苷酸。
49.在另一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，所述一个或多个控制序列指导本发明的脂肪酶变体在重组宿主细胞中的产生。
50.在一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸或本发明的核酸构建体的表达载体。
51.本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、本发明的核酸构建体或本发明的表达载体的宿主细胞。
52.最后，本发明涉及产生本发明的脂肪酶变体的方法，所述方法包括：
53.a)在适合于表达所述脂肪酶变体的条件下培养本发明的宿主细胞；以及
54.b)回收所述脂肪酶变体。
55.定义
56.脂肪酶：术语“脂肪酶(lipase)”、“脂肪酶(lipase enzyme)”、“脂解酶”、“脂质酯酶”、“脂解多肽”以及“脂解蛋白”是指如酶命名法所定义的ec3.1.1类中的酶。它可以具有脂肪酶活性(三酰基甘油脂肪酶，ec3.1.1.3)、角质酶活性(ec3.1.1.74)、固醇酯酶活性(ec3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(ec3.1.1.50)。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定脂肪酶活性。在一方面，本发明的变体具有seq id no:2的多肽的脂肪酶活性的至少20％，例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％。
57.等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
58.cdna：术语“cdna”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mrna分子进行反转录而制备的dna分子。cdna缺乏可以存在于对应基因组dna中的内含子序列。初始的初级rna转录物是mrna的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mrna。
59.编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，所述多核苷酸直接规定了脂肪酶变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，所述可读框以起始密码子(例如atg、gtg或ttg)开始并且以终止密码子(例如taa、tag或tga)结束。编码序列可以为基因组dna、cdna、合成dna或其组合。
60.控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的脂肪酶变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码所述脂肪酶变体的多核苷酸来说可以是原生的
(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码本发明的脂肪酶变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。
61.表达：术语“表达”包括涉及脂肪酶变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
62.表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状dna分子，所述分子包含编码本发明的脂肪酶变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
63.片段：术语“片段”意指在多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有脂肪酶活性。在一方面，片段含有seq id no:2的氨基酸1至262的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％。
64.宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。
65.改善的特性：术语“改善的特性”意指与相对于亲本脂肪酶有所改善的脂肪酶变体相关的特征。此类改善的特性包括但不限于洗涤性能、洗涤剂稳定性、蛋白酶存在的洗涤剂中的稳定性、蛋白酶稳定性、化学稳定性、氧化稳定性、ph稳定性、储存条件下的稳定性、以及热稳定性。
66.分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其本质相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
67.成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如n-末端加工、c-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，所述成熟多肽是seq id no:2的氨基酸1至262。本领域中已知，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同的c-末端和/或n-末端氨基酸)的混合物。
68.成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有脂肪酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，所述成熟多肽编码序列是seq id no:1的核苷酸1-786。
69.突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
70.核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
71.可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在所述构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得所述控制序列指导所述编码序列的表
达。
72.亲本或亲本脂肪酶：术语“亲本”或“亲本脂肪酶”意指进行改变以产生本发明的脂肪酶变体的脂肪酶。所述亲本脂肪酶可以是天然存在的(野生型)多肽(例如，seq id no:3)或其变体(例如，seq id no:2)或片段或者可以是合成产生的。
73.序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
74.出于本发明的目的，使用如在emboss软件包(emboss：欧洲分子生物学开放软件包(the european molecular biology open software suite),rice等人,2000,trends genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(needleman-wunsch algorithm)(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
[0075]
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
[0076]
出于本发明的目的，使用如在emboss包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的needle程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，同上)来测定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及ednafull(ncbi nuc4.4的emboss版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用-非简化选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
[0077]
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
[0078]
稳定性：本发明的脂肪酶变体的稳定性可以表示为在暴露于不同测试条件(例如像，储存在洗涤剂组合物中、在不同温度、在不同ph、在不同组分(如蛋白酶、化学品、和/或氧化物质(压力条件)的存在下)期间或之后，或在洗涤过程使用期间，所述脂肪酶的残余活性或残余性能。可以相对于亲本脂肪酶(例如，如seq id no:2所示的亲本脂肪酶)的已知活性或性能，或可替代地，相对于当初始添加至任选地冷藏或冷冻储存的洗涤剂组合物时的脂肪酶变体的已知活性或性能，或相对于冷藏或冷冻储存的(无压力条件)脂肪酶变体，测量脂肪酶变体的稳定性。
[0079]
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，几个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有脂肪酶活性的片段。在一方面，子序列含有seq id no:1的核苷酸1至786的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％、但小于100％。
[0080]
变体：术语“变体”意指具有脂肪酶活性的、在一个或多个(例如，几个)位置处包含改变(即取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。本发明的这些变体具有seq id no:2的多肽的脂肪酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。
[0081]
野生型脂肪酶：术语“野生型”脂肪酶意指由见于自然界中的天然存在的微生物(如细菌、酵母或丝状真菌)表达的脂肪酶。“野生型”脂肪酶的实例是如seq id no:3所示的脂肪酶。
[0082]
变体命名惯例
[0083]
出于本发明的目的，使用如seq id no:2披露的多肽来确定另一种脂肪酶中相应的氨基酸残基。将另一种脂肪酶的氨基酸序列与seq id no:2进行比对，并且基于比对，使用如在emboss软件包(emboss：欧洲分子生物学开放软件包，rice等人,2000,trends genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与seq id no:2中披露的多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。
[0084]
另一种脂肪酶中的对应的氨基酸残基的鉴别可以通过使用几种计算机程序使用其对应默认参数将多个多肽序列进行比对来确定，这些计算机程序包括但不限于muscle(通过对数-期望进行的多序列比较；3.5版本或更新版本；edgar,2004,nucleic acids research[核酸研究]32:1792-1797)、mafft(6.857版本或更新版本；katoh和kuma,2002,nucleic acids research[核酸研究]30:3059-3066；katoh等人,2005,nucleic acids research[核酸研究]33:511-518；katoh和toh,2007,bioinformatics[生物信息学]23:372-374；katoh等人,2009,methods in molecular biology[分子生物学方法]537:_39-64；katoh和toh,2010,bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)、以及采用clustalw的emboss emma(1.83或更新版本；thompson等人,1994,nucleic acids research[核酸研究]22:4673-4680)。
[0085]
当其他酶与seq id no:2的多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(lindahl和elofsson,2000,j.mol.biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，psi-blast程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(atschul等人,1997,nucleic acids res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序例如genthreader(jones,1999,j.mol.biol.[分子生物学杂志]287:797-815；mcguffin和jones,2003,bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(psi-blast、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，gough等人，2000，j.mol.biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于scop数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。
[0086]
对于已知结构的蛋白质，几工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的scop超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(holm和sander,1998,proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(shindyalov和bourne,1998,protein engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或
更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣的结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，holm和park,2000,bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。
[0087]
在描述本发明的变体时，为了便于参考，以下描述的命名法经过了调整。采用了已接受的iupac单字母或三字母的氨基酸缩写。
[0088]
取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。相应地，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“thr226ala”或“t226a”。多个突变通过加号(“ ”)分开，例如“gly205arg ser411phe”或“g205r s411f”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(g)和丝氨酸(s)分别被精氨酸(r)和苯丙氨酸(f)取代。多个突变还可以通过空格(
“”
)分开，例如“g205r s411f”或逗号“,”分开，例如“g205r,s411f”代表在位置205和位置411处甘氨酸(g)和丝氨酸(s)分别被精氨酸(r)和苯丙氨酸(f)取代。
[0089]
缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、
*
。相应地，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“gly195*”或“g195*”。多个缺失由加号(“ ”)分隔，例如，“gly195* ser411*”或“g195* s411*”。
[0090]
插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。相应地，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“gly195glylys”或“g195gk”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“gly195glylysala”或“g195gka”。
[0091]
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，所述序列因此会是：
[0092]
亲本：变体：195195 195a 195bgg-k-a
[0093]
多个改变。包括多种改变的变体由加号(“ ”)分开，例如“arg170tyr gly195glu”或者“r170y g195e”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
[0094]
不同改变.可以在一个位置上引入不同的变化时，这些不同的变化由一个逗号分开，例如“arg170tyr,glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“tyr167gly,ala arg170gly,ala”表示以下变体：
[0095]“tyr167gly arg170gly”、“tyr167gly arg170ala”、“tyr167ala arg170gly”、和“tyr167ala arg170ala”。
具体实施方式
[0096]
本发明涉及与亲本脂肪酶相比已得到改善的脂肪酶变体。特别地，与亲本脂肪酶相比，本发明的脂肪酶变体具有改善的洗涤性能。更确切地说，本发明涉及与亲本脂肪酶(特别是如seq id no:2所示的亲本脂肪酶)相比，具有改善的洗涤性能评分(wps)的脂肪酶变体。
[0097]
根据本发明，使用自动机械应力测定(amsa)测试洗涤性能。在一个优选的实施例中，用标准x洗涤剂(如实例3中所述)使用amsa测试洗涤性能，所述标准x洗涤剂包含阴离子表面活性剂直链烷基苯磺酸酯(las)和非离子表面活性剂醇乙氧基化物(aeo)两者。
[0098]
将所述洗涤性能确定为在相同条件下，所讨论的脂肪酶变体的洗涤性能和如seq id no:2所示的脂肪酶的洗涤性能之间的差异(即，相对洗涤性能)。因此，相对洗涤性能》(即，高于)0.00意指所述脂肪酶变体具有改善的洗涤性能。
[0099]
本发明的脂肪酶变体
[0100]
在第一方面，本发明涉及如seq id no:2所示的多肽的亲本脂肪酶的变体，其中：
[0101]
i)所述变体是具有脂肪酶活性的多肽；并且
[0102]
ii)所述变体是与如seq id no:2所示的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％、但小于100％序列同一性的多肽；
[0103]
iii)所述变体是由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与如seq id no:1所示的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列同一性；
[0104]
iv)所述变体是具有脂肪酶活性的ii)或iii)的多肽的片段；
[0105]
其中所述变体包含：
[0106]
(a)对应于以下的取代：
[0107]
d4a；i7d；k14e；t17s；g34d；r36e；r36m；r36v；r36q；s38d；s38e；g43d；g43h；n47d；n47e；n47g；n47h；q49t；q49v；l57s；d60g；d60v；g68i；e69m；e69t；k70d；k70h；k70q；a89y；v94d；v94l；n102m；g109r；q118s；k120a；k120d；k120e；k120n；k120m；k120g；k120p；k120q；k120s；k120v；a123e；k136g；h158e；h158q；h161d；h161e；a162s；n163e；n163h；i174a；p177g；p177i；p177k；p177l；a178i；a178l；a178t；a178v；n181k；n181l；n181t；n181w；y182w；v183m；i184v；g185a；g185i；g185k；g185r；g185t；g185w；g185y；k187g；k187l；p189a；p189l；p189m；p189n；p189q；p189r；p189t；p189v；p189w；i199t；i199v；e196m；s206g；s206v；a207n；l211c；r223a；r223e；r223g；r223h；r223k；r223n；r223q；s224t；i232p；232q；t234s；d235a；i248l；s252n；l260f；和/或
[0108]
(b)对应于以下的取代：
[0109]
n163e r223n；k70e s206g；r101v s206v；a15e k120q；d130r s206g；d130r s206v；t2s a15e；和/或
[0110]
(c)对应于以下的取代：r36v v183m r223n；n47h k70e s206g；n163e r223n s252n；n47d k120g r223n；g43d n47d k120g；k70e h195s s206g；k70e l156f s206g；a178y p189v r223n；r36e g43d n47d；k70d n163e s252n；n47d k120g n163e；k70e p189q s206g；r36t k70e s206g；r36i k70e s206g；q49t k70e s206g；g43d k70e s206g；r36k k70e s206g；k70e p189m s206g；k52a k70e s206g；r36m k70e s206g；r36e k70e s206g；r101v s206v r223s；r36v n47d k120g；k14a k70e s206g；d4c s206g n236c；k70e g185l s206g；r36y k70e s206g；r36l k70e s206g；k70e p189l s206g；r36a k70e s206g；r101v d130r s206g；d4c s206g n236c；d4c s206v n236c；r36f k70e s206g；k70e k120p s206g；
和/或
[0111]
(d)对应于以下的取代：
[0112]
n163e g185h r223n s252n；n163e n181w r223n s252n；k70d n163e r223n s252n；d4c s206g n236c s252n；d4c s206g r223n n236c；a178y v183m p189v r223n；和/或
[0113]
(e)对应于以下的取代：
[0114]
d4c p189v s206g r223n n236c；d4c n163e s206g n236c s252n；d4c n163e s206g r223n n236c；d4c a178y s206g r223n n236c；d4c k108a d130r s206v n236c；和/或
[0115]
(f)对应于以下的取代：
[0116]
s1c a8c t17c l225r n230c l254c；s1c a8c t17c l225r n230c l254c；d4c n97d r101v d130r s206v n236c；和/或
[0117]
(g)对应于以下的取代：
[0118]
s1c a8c t17c i184n l225c n230c l254c；s1c a8c t17c y75f l225c n230c l254c；s1c a8c t17c q49l l225c n230c l254c；s1c a8c t17c y167f l225c n230c l254c；s1c a8c t17c y190f l225c n230c l254c；s1c a8c t17c q49i l225c n230c l254c；s1c a8c t17c l225c n230c f244n l254c；s1c a8c a15e t17c l225c n230c l254c；s1c a8c t17c a162s l225c n230c l254c；s1c a8c t17c v183s l225c n230c l254c；s1c a8c t17c i164l l225c n230c l254c；s1c a8c t17c y19f l225c n230c l254c；s1c a8c t17c e165s l225c n230c l254c；s1c a8c t17c q49s l225c n230c l254c；s1c a8c t17c k187n l225c n230c l254c；s1c a8c a15r t17c l225c n230c l254c；和/或
[0119]
(h)对应于以下的取代：
[0120]
r101v a131r a152s n176t s206g r223s f247v g255d；s1c d4n r6s a8c t17c l225c n230c l254c；r101v a131r a152s n176t s206g r223s f247v g255d；s1c a8c t17c k136n v138s l225c n230c l254c；a26c i32c a45v q49k n97d d130r h159k s224r；s1c a8c t17c k70e i184n l225c n230c l254cs1c a8c t17c v76i l225c n230c l254c；和/或
[0121]
(i)对应于以下的取代：
[0122]
s1c a8c t17c h159k h161n n163s l225c n230c l254c；s1c a8c t17c v76i v138l i164l l225c n230c l254c；和/或
[0123]
(j)对应于以下的取代：
[0124]
s1c a8c t17c s38t v76i v138l i164l l225c n230c l254c；和/或
[0125]
(k)对应于以下的取代：
[0126]
a8c t17c r36n g43d q49t k70n k72s k120g s206v r223n l225c l254c；和/或
[0127]
(l)对应于以下的取代：
[0128]
a8c t17c r36v s38d g43d n47d q49n k70n k72s k120g t148v e165s n181w s206v r223h l225c l254c。
[0129]
根据本发明，与亲本脂肪酶相比，本发明的脂肪酶变体具有改善的洗涤性能。在一
个优选的实施例中，与例如亲本脂肪酶(特别是如seq id no:2所述的亲本脂肪酶)相比，本发明的脂肪酶变体具有改善的洗涤性能(确定为相对洗涤性能)。
[0130]
在一个优选的实施例中，与seq id no:2的脂肪酶相比，本发明的脂肪酶变体的洗涤性能评分(wps)(如在实例3中定义)为“ ”，优选地“ ”，更优选地“ ”，甚至更优选地“ ”。
[0131]
在一个优选的实施例中，与seq id no:2的脂肪酶相比，本发明的脂肪酶变体的相对洗涤性能(如在实例3中定义)高于0.00至5.00，优选地高于5.00至10.00，更优选地高于10.00至15.00，甚至更优选地高于15.00。
[0132]
与如seq id no:2所示的参照脂肪酶相比，本发明的脂肪酶变体具有改善的洗涤性能，即，相对洗涤性能》0.00(即，大于0.00)。实例3中的表3示出了洗涤性能，示出为变体的洗涤性能评分(wps)：“ ”、“ ”、“ ”或“ ”。
[0133]
实例3和下表列出了优选的本发明的脂肪酶变体(使用seq id no:2进行编号)。本发明还涵盖在其他亲本脂肪酶中具有相应突变的脂肪酶变体。
[0134]
[0135]
[0136]
[0137]
[0138]
[0139]
[0140]
[0141][0142]
在一个实施例中，与seq id no:2相比，取代的数目是1-20个，例如1-15个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个。
[0143]
本发明的脂肪酶变体可进一步包含在一个或多个(例如几个)其他位置处的一个或多个另外的取代。
[0144]
所述氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1至30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
[0145]
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由h.neurath和r.l.hill,1979,于the proteins[蛋白质],academic press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu和asp/gly。
[0146]
可替代地，所述氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适ph等。
[0147]
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(cunningham和wells,1989,science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后种技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的脂肪酶活性以鉴别对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，hilton等人,1996,j.biol.chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见例如,de vos等人,1992,science[科学]255:306-312；smith等人,1992,j.mol.biol.[分子生物学杂志]224:899-904；wlodaver等人,1992,febs lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
[0148]
本发明的脂肪酶变体可以与如seq id no:2所示的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少
australeinsis)、粪梭孢壳(thielavia fimeti)、小孢梭孢壳(thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(thielavia peruviana)、毛梭孢壳(thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(thielavia spededonium)、耐热梭孢壳(thielavia subthermophila)、土生梭孢壳(thielavia terrestris)、哈茨木霉(trichoderma harzianum)、康宁木霉(trichoderma koningii)、长枝木霉(trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(trichoderma reesei)、或绿色木霉(trichoderma viride)脂肪酶。
[0158]
应理解的是对于前述的种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect and imperfect states)，和其他分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。
[0159]
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，例如美国典型培养物保藏中心(atcc)、德国微生物菌种保藏中心(deutsche sammlung von mikroorganismen und zellkulturen gmbh，dsmz)、荷兰菌种保藏中心(centraalbureau voor schimmelcultures，cbs)和美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(agricultural research service patent culture collection,northern regional research center，nrrl)。
[0160]
可以使用以上探针，鉴定亲本脂肪酶并从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物获得所述亲本，或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)直接获得dna样品。用于从天然生境中直接分离微生物和dna的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物或混合dna样品的基因组dna或cdna文库来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一个或多个探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的多种技术来分离或克隆该多核苷酸(参见，例如萨拉布鲁克(sambrook)等人，1989，见上文)。
[0161]
所述亲本脂肪酶可以具有如seq id no:2所示的氨基酸序列，或可以是与如seq id no:2所示的脂肪酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽。
[0162]
所述亲本脂肪酶可以具有如seq id no:3所示的氨基酸序列，或可以是与如seq id no:3所示的脂肪酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽。
[0163]
变体的制备
[0164]
可以使用本领域已知的任何诱变程序(例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等)来制备本发明的脂肪酶变体。
[0165]
定点诱变是在编码所述亲本脂肪酶的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，几个)突变的技术。
[0166]
通过涉及使用包含所希望的突变的寡核苷酸引物的pcr可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本脂肪酶的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。
通常，消化质粒和寡核苷酸的限制酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，scherer和davis,1979,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和barton等人,1990,nucleic acids res.[核酸研究]18:7349-4966。
[0167]
还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参加例如，us2004/0171154；storici等人,2001,nature biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；kren等人,1998,nat.med.[自然医学]4:285-290；以及calissano和macino,1996,fungal genet.newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16。
[0168]
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
[0169]
合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，例如由tian等人(2004，nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
[0170]
使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由reidhaar-olson和sauer,1988,science[科学]241:53-57；bowie和sauer,1989,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；wo 95/17413；或wo 95/22625披露的那些。可以使用的其他方法包括易错pcr、噬菌体展示(例如lowman等人,1991,biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；wo 92/06204)以及区域定向诱变(derbyshire等人,1986,gene[基因]46:145；ner等人,1988,dna7:127)。
[0171]
诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(ness等人，1999，nature biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的dna分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
[0172]
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合pcr技术。因此，基因的限定区域可以重新合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错pcr或非易错pcr扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
[0173]
多核苷酸
[0174]
本发明还涉及编码本发明的脂肪酶变体的分离的多核苷酸。
[0175]
在某些方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体。
[0176]
在某些方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的表达载体。在某些方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的宿主细胞。
[0177]
在某些方面，本发明涉及产生脂肪酶变体的方法，所述方法包括：(a)在适合于表达所述脂肪酶变体的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)回收所述脂肪酶变体。
[0178]
核酸构建体
[0179]
本发明还涉及核酸构建体，所述核酸构建体包含编码本发明的脂肪酶变体的多核苷酸。所述核酸构建体可操作地连接至一个或多个控制序列，所述控制序列在与这些控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。
[0180]
可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供脂肪酶变体的表达。取决于表达载体，在
多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组dna方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
[0181]
控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达所述多核苷酸的多核苷酸。启动子含有介导脂肪酶变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。
[0182]
用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyq)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyl)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penp)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amym)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacb)、枯草芽孢杆菌xyla和xylb基因、苏云金芽孢杆菌cryllla基因(agaisse和lereclus,1994,molecular microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(egon等人,1988,gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(daga)和原核β-内酰胺酶基因(villa-kamaroff等人,1978,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(deboer等人,1983,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]80:21-25)。另外的启动子描述于gilbert等人,1980,scientific american[科学美国人]242:74-94中的“useful proteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和sambrook等人,1989，见上文中。串联启动子的实例披露于wo 99/43835中。
[0183]
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合启动子的实例是从以下的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaa)、米曲霉taka淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(wo 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(wo00/56900)、镶片镰孢daria(fusarium venenatum daria)(wo 00/56900)、镶片镰孢quinn(fusarium venenatum quinn)(wo 00/56900)、米黑根毛霉(rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶i、里氏木霉纤维二糖水解酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶i、里氏木霉内切葡聚糖酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶iii、里氏木霉内切葡聚糖酶iv、里氏木霉内切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉β-木糖苷酶，以及na2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由来自曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。
[0184]
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(eno-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(gal1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3磷酸脱氢酶(adh1、adh2/gap)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(tpi)、酿酒酵母金属硫蛋白(cup1)、以及酿酒酵母3磷酸甘油酸激酶。romanos等人,1992,yeast[酵母]8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
[0185]
控制序列也可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子序列可操作地连接至编码脂肪酶变体的多核苷酸的3
’‑
末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
[0186]
细菌宿主细胞的优选终止子从以下基因中获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprh)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyl)、和大肠杆菌核糖体rna(rrnb)。
[0187]
丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自以下的基因：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶、以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
[0188]
酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素c(cyc1)以及酿酒酵母甘油醛-3磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其他有用的终止子由romanos等人,1992，见上文描述。
[0189]
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mrna稳定子区，其提高该基因的表达。
[0190]
适合的mrna稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryllla基因(wo 94/25612)和枯草芽孢杆菌sp82基因(hue等人,1995,journal of bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
[0191]
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mrna的非翻译区域。前导序列可操作地连接至编码脂肪酶变体的多核苷酸的5
’‑
末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
[0192]
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉taka淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
[0193]
酵母宿主细胞的适合的前导序列从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(eno-1)、酿酒酵母3磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3磷酸脱氢酶(adh2/gap)。
[0194]
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即可操作地连接至所述脂肪酶变体编码序列的3
’‑
末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加至所转录的mrna上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
[0195]
丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶、以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
[0196]
酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由guo和sherman,1995,mol.cellular biol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
[0197]
控制序列还可以是信号肽编码区域，所述编码区域编码与脂肪酶变体的n-末端连接的信号肽，并且指导所述脂肪酶变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5'-端可以固有地包含信号肽编码序列，所述信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码所述脂肪酶变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5'-端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强脂肪酶变体的分泌。然而，可以使用指导表达的脂肪酶变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
[0198]
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌ncib 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌
β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprt、nprs、nprm)和枯草芽孢杆菌prsa。另外的信号肽由simonen和palva,1993,microbiological reviews[微生物评论]57:109-137描述。
[0199]
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉taka淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶v、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0200]
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他有用的信号肽编码序列由romanos等人,1992，见上文描述。
[0201]
控制序列还可以是编码位于脂肪酶变体的n-末端处的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(apre)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprt)、嗜热毁丝霉漆酶(wo 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。
[0202]
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，所述前肽序列定位成紧邻脂肪酶变体的n-末端并且所述信号肽序列定位成紧邻所述前肽序列的n-末端。
[0203]
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节脂肪酶变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用adh2系统或gal1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉takaα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码脂肪酶变体的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
[0204]
表达载体
[0205]
本发明还涉及包含编码本发明的脂肪酶变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码脂肪酶变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达所述多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
[0206]
重组表达载体可以是可以方便地经受重组dna程序并且可以引起该多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
[0207]
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样一种载体，当被引入宿主细胞中时，它被整合到基因组中并与其整合的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总dna，或可以使用转座
子。
[0208]
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
[0209]
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ade2、his3、leu2、lys2、met3、trp1和ura3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amds(乙酰胺酶)、argb(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niad(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrg(乳清酸核苷-5
’‑
磷酸脱羧酶)(orotidine-5
’‑
phosphate decarboxylase)、sc(硫酸腺苷酰转移酶)和trpc(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amds和pyrg基因以及吸水链霉菌(streptomyces hygroscopicus)bar基因。
[0210]
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
[0211]
为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码脂肪酶变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。可替代地，所述载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，所述核酸与相应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
[0212]
为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，所述复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
[0213]
细菌复制起点的例子是允许在大肠杆菌中复制的质粒pbr322，puc19，pacyc177和pacyc184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的pub110，pe194，pta1060和pamβ1的复制起点。
[0214]
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ars1、ars4、ars1与cen3的组合、及ars4与cen6的组合。
[0215]
适用于丝状真菌细胞的复制起点的实例是ama1和ans1(格姆斯(gems)等人，1991，基因(gene)98:61-67；cullen等人,1987,nucleic acids res.[核酸研究]15:9163-9175；wo 00/24883)。可以根据wo 00/24883中披露的方法完成ama1基因的分离和包含所述基因的质粒或载体的构建。
[0216]
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加脂肪酶变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与所述多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得所述多核苷酸的增加的拷贝数目，其中
通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此所述多核苷酸的另外的拷贝。
[0217]
用于连接以上描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，sambrook等人,1989，见上文)。
[0218]
宿主细胞
[0219]
本发明还涉及重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码本发明的脂肪酶变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，所述一个或多个控制序列指导本发明的脂肪酶变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得所述构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码脂肪酶变体的基因及其来源。
[0220]
宿主细胞可以是在脂肪酶变体的重组生产中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
[0221]
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及脲原体属。
[0222]
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
[0223]
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌(streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽疫亚种(streptococcus equi subsp.zooepidemicus)细胞。
[0224]
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌(streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(streptomyces griseus)和浅青紫链霉菌(streptomyces lividans)细胞。
[0225]
可以通过如下方法实现将dna引入芽孢杆菌属细胞中：原生质体转化(参见例如，chang和cohen,1979,mol.gen.genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，young和spizizen,1961,j.bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829，或dubnau和davidoff-abelson,1971,j.mol.biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，shigekawa和dower,1988,biotechniques[生物技术]6:742-751)、或接合(参见例如，koehler和thorne,1987,j.bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将dna引入大肠杆菌细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，hanahan,1983,j.mol.biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，dower等人,1988，nucleic acids res.[核酸研究]16:6127-6145)。将dna引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，gong等人,2004，folia microbiol.(praha)[叶线形微生物学
(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，mazodier等人,1989，j.bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)或转导(参见例如，burke等人,2001，proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将dna引入假单孢菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，choi等人,2006,j.microbiol.methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，pinedo和smets,2005,appl.environ.microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将dna引入链球菌属细胞中可以通过以下来实现：天然感受态(natural competence)(参见例如，perry和kuramitsu,1981,infect.immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，catt和jollick，1991，microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，buckley等人,1999,appl.environ.microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或共轭(参见例如，clewell,1981,microbiol.rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将dna引入宿主细胞中的任何方法。
[0226]
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
[0227]
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文使用的“真菌”包括子囊菌门(ascomycota)、担子菌门(basidiomycota)、壶菌门(chytridiomycota)、和接合菌门(zygomycota)以及卵菌门(oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由hawksworth等人,在ainsworth and bisby’s dictionary of the fung[安斯沃思和拜斯比真菌词典]，第8版，1995，cab international[国际应用生物科学中心],university press[大学出版社],cambridge，uk[英国剑桥]中定义的)。
[0228]
真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如本文使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(fungi imperfecti)(芽孢纲(blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，出于本发明的目的，酵母应如biology and activities of yeast[酵母的生物学与活性](skinner、passmore和davenport编，soc.app.bacteriol.symposium series no.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所描述的那样定义。
[0229]
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(candida)、汉逊酵母属(hansenula)、克鲁维酵母菌属(kluyveromyces)、毕赤酵母属(pichia)、酵母菌属(saccharomyces)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(saccharomyces norbensis)、卵形酵母(saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)细胞。
[0230]
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(eumycota)和卵菌门的亚门(如由hawksworth等人,1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由甲壳素、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
[0231]
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属(aureobasidium)、烟管霉属(bjerkandera)、拟腊菌属(ceriporiopsis)、金孢子菌属(chrysosporium)、鬼伞属
(coprinus)、革盖菌属(coriolus)、隐球菌属(cryptococcus)、线黑粉菌科(fili basidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属(magnaporthe)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属(neocallimastix)、链孢菌属(neurospora)、拟青霉属(paecilomyces)、青霉属、平革菌属(phanerochaete)、射脉菌属(phlebia)、瘤胃壶菌属(piromyces)、侧耳属(pleurotus)、裂褶菌属(schizophyllum)、篮状菌属、嗜热子囊菌属(thermoascus)、梭孢壳属(thielavia)、弯颈霉属(tolypocladium)、栓菌属(trametes)或木霉属细胞。
[0232]
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(coprinus cinereus)、毛革盖菌(coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌(phlebia radiata)、刺芹侧耳(pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(trametes villosa)、变色栓菌(trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
[0233]
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、和细胞壁重建的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在ep 238023和yelton等人,1984,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]81:1470-1474、以及christensen等人,1988,bio/technology[生物/技术]6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由malardier等人,1989,gene[基因]78:147-156，以及wo 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：becker和guarente在abelson,j.n.和simon,m.i.编辑，guide to yeast genetics and molecular biology[酵母遗传学与分子生物学指南],methods in enzymology[酶学方法],第194卷，第182-187页，academic press,inc.(学术出版社有限公司),纽约；ito等人,1983,j.bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及hinnen等人,1978,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]75:1920。
[0234]
产生方法
[0235]
本发明还涉及产生本发明的脂肪酶变体的方法，所述方法包括：(a)在适合于表达所述脂肪酶变体的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)回收所述脂肪酶变体。
[0236]
使用本领域已知的方法在适合于产生脂肪酶变体的营养介质中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许脂肪酶或变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成
(例如，在美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)的目录中)制备。如果脂肪酶变体被分泌到营养介质中，则所述脂肪酶变体可以直接从培养基中回收。如果脂肪酶变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
[0237]
可以使用本领域已知的对脂肪酶变体特异的方法检测脂肪酶变体。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定脂肪酶变体的活性(如实例中所述的那些)。
[0238]
可以使用本领域已知的方法回收脂肪酶变体。例如，可以通过常规程序从营养介质中回收脂肪酶变体，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
[0239]
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化脂肪酶变体以获得基本上纯的脂肪酶变体，所述程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、sds-page或萃取(参见例如，protein purification[蛋白质纯化]，janson和ryden编辑,纽约vch出版社(vch publishers),1989)。
[0240]
在可替代的方面，没有回收脂肪酶变体，而是将表达脂肪酶变体的本发明的宿主细胞用作所述脂肪酶变体的来源。
[0241]
组合物
[0242]
本发明还包括组合物，所述组合物包含本发明的脂肪酶变体。
[0243]
下文阐述的组合物组分的非限制性列表适合用于所述组合物中，并且本文的方法可以理想地掺入本发明的某些实施例中，例如用以辅助或增强清洁性能，用于处理有待清洁的底物，或用以在与香料、着色剂、染料等一起的情况下修饰所述组合物的美感。掺入任何组合物中的任何此类组分的水平是除了先前引用的用于掺入的任何材料之外的。这些另外的组分的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在其中使用组合物的清洁操作的性质。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，组分可以包含另外的功能性。
[0244]
除非另外表明，否则以百分比计的量是按所述组合物的重量计(wt％)。适合的组分材料包括但不限于表面活性剂、助洗剂、螯合试剂、染料转移抑制试剂、分散剂、酶、以及酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、调色染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物软化剂、载体、水溶助剂、加工助剂、溶剂和/或颜料。除了以下披露内容，此类其他组分的适合的实例以及使用水平发现于us 5576282、us 6306812和us 6326348中，将其通过引用特此结合。
[0245]
因此，在某些实施例中，本发明不含有以下附属材料的一种或多种：表面活性剂、皂、助洗剂、螯合试剂、染料转移抑制剂、分散剂、另外的酶、酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物软化剂、载体、水溶助剂、加工助剂、溶剂和/或颜料。然而，当一种或多种组分存在时，这样的一种或多种组分可以如下文详述的那样存在：
[0246]
表面活性剂-根据本发明的组合物可以包含表面活性剂或表面活性剂系统，其中
所述表面活性剂可以选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂、及其混合物。当存在时，表面活性剂典型地以从0.1wt％至60wt％、从0.2wt％到40wt％、从0.5wt％至30wt％、从1wt％至50wt％、从1wt％至40wt％、从1wt％至30wt％、从1wt％至20wt％、从3wt％至10wt％、从3wt％至5wt％、从5wt％至40wt％、从5wt％至30wt％、从5wt％至15wt％、从3wt％至20wt％、从3wt％至10wt％、从8wt％至12wt％、从10wt％至12wt％、从20wt％至25wt％或从25wt％-60wt％的水平存在。
[0247]
适合的阴离子去污表面活性剂包括硫酸盐和磺酸盐去污表面活性剂。
[0248]
适合的磺酸盐去污表面活性剂包括烷基苯磺酸盐，在一方面为c
10-13
烷基苯磺酸盐。适合的烷基苯磺酸盐(las)可以通过使可商购的直链烷基苯(lab)磺化而得到；适合的lab包括低2-苯基lab，例如或其他适合的lab包括高2-苯基lab，例如适合的阴离子去污表面活性剂是通过detal催化工艺获得的烷基苯磺酸盐，但其他合成路线(例如hf)也可以是适合的。在一方面，使用las的镁盐。
[0249]
适合的硫酸盐去污表面活性剂包括烷基硫酸盐，在一方面为c
8-18
烷基硫酸盐，或主要为c
12
烷基硫酸盐。
[0250]
另外的适合的硫酸盐去污表面活性剂是烷基烷氧基化硫酸盐，在一方面为烷基乙氧基化硫酸盐，在一方面为c
8-18
烷基烷氧基化硫酸盐，在另一方面为c
8-18
烷基乙氧基化硫酸盐，典型地烷基烷氧基化硫酸盐具有从0.5至20或从0.5至10的平均烷氧基化度，典型地烷基烷氧基化硫酸盐是c
8-18
烷基乙氧基化硫酸盐，具有0.5至10、从0.5至7、从0.5至5或从0.5至3的平均乙氧基化度。
[0251]
烷基硫酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐和烷基苯磺酸盐可以是直链或支链的、取代或未取代的。
[0252]
去污表面活性剂可以是中链分支的去污表面活性剂，在一方面为中链分支的阴离子去污表面活性剂，在一方面为中链分支的烷基硫酸盐和/或中链分支的烷基苯磺酸盐，例如中链分支的烷基硫酸盐。在一方面，中链分支是c
1-4
烷基基团，典型地为甲基和/或乙基基团。
[0253]
阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，特别是直链烷基苯磺酸盐(las)、las的异构体、支链烷基苯磺酸盐(babs)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(aos)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(as)(例如十二烷基硫酸钠(sds))、脂肪醇硫酸盐(fas)、伯醇硫酸盐(pas)、醇醚硫酸盐(aes或aeos或fes，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(sas)、石蜡烃磺酸盐(ps)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-sfme或ses)(包括磺酸甲酯(mes))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(dtsa)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
[0254]
适合的非离子去污表面活性剂选自由以下组成的组：c
8-c
18
烷基乙氧基化物，例如c
6-c
12
烷基苯酚烷氧基化物，其中所述烷氧基化物单元可以是乙烯氧基单元，丙烯氧基单元或其混合物；c
12-c
18
醇和c
6-c
12
烷基苯酚与环氧乙烷/环氧丙烷嵌段聚合物的缩合物，例如c
14-c
22
中链分支的醇；c
14-c
22
中链分支的烷基烷氧基化物，典
型地具有从1至30的平均烷氧基化度；烷基多糖，在一方面为烷基多糖苷；多羟基脂肪酸酰胺；醚封端的聚(烷氧基化)醇表面活性剂；及其混合物。
[0255]
适合的非离子去污表面活性剂包括烷基多糖苷和/或烷基烷氧基化醇。
[0256]
在一方面，非离子去污表面活性剂包括烷基烷氧基化醇，在一方面为c
8-18
烷基烷氧基化醇，例如c
8-18
烷基乙氧基化醇，所述烷基烷氧基化醇可以具有从1至50、从1至30、从1至20、或从1至10的平均烷氧基化度。在一方面，烷基烷氧基化醇可以是c
8-18
烷基乙氧基化醇，具有从1至10、从1至7，更多是从1至5或从3至7的平均乙氧基化度。烷基烷氧基化醇可以是直链或支链的、以及取代或未取代的。适合的非离子表面活性剂包括
[0257]
非离子表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(ae或aeo)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(pfa)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(ape)、壬基酚乙氧基化物(npe)、烷基多糖苷(apg)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(fam)、脂肪酸二乙醇酰胺(fada)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(efam)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(pfam)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的n-酰基n-烷基衍生物(葡糖酰胺(ga)、或脂肪酸葡糖酰胺(faga))、以及以span和tween商品名可获得的产品、及其组合。
[0258]
适合的阳离子去污表面活性剂包括烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三锍化合物及其混合物。
[0259]
适合的阳离子去污表面活性剂是具有以下通式的季铵化合物：(r)(r1)(r2)(r3)n
x-，其中r是直链或支链的、取代或未取代的c
6-18
烷基或烯基部分，r1和r2独立地选自甲基或乙基部分，r3是羟基、羟甲基或羟乙基部分，x是提供电荷中性的阴离子，适合的阴离子包括卤化物，例如氯化物；硫酸盐；以及磺酸盐。适合的阳离子去污表面活性剂是单-c
6-18
烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。高度适合的阳离子去污表面活性剂是单-c
8-10
烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物、单-c
10-12
烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物以及单-c
10
烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。
[0260]
阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(admeaq)、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、二甲基二硬脂酰氯化铵(dsdmac)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(aqa)化合物、酯季铵及其组合。
[0261]
适合的两性表面活性剂/兼性离子表面活性剂包括氧化胺和甜菜碱(例如烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱)、或其组合。本发明的胺中和的阴离子表面活性剂-阴离子表面活性剂以及辅助阴离子助表面活性剂可以按酸形式存在，并且所述酸形式可以被中和以形成希望用于本发明的洗涤剂组合物的表面活性剂盐。典型的用于中和的试剂包括金属反离子碱，例如氢氧化物，例如naoh或koh。用于中和本发明的阴离子表面活性剂和处于其酸形式的辅助阴离子表面活性剂或助表面活性剂的另外优选的试剂包括氨、胺或烷醇胺。优选烷醇胺。适合的非限制性实例包括单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、以及其他本领域中已知的直链或支链的烷醇胺；例如，高度优选的烷醇胺包括2-氨基-1-丙醇、1-氨基丙醇、单异丙醇胺、或1-氨基-3-丙醇。胺中和可以进行到完全或部分的程度，例如，阴离子表面活性剂混合物的部分可以被钠或钾中和，并且阴离子表面活性剂混合物的部分可以被胺或烷醇胺中和。
[0262]
半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(ao)，例如烷基二甲胺氧化物
[0263]
包含一种或多种阴离子表面活性剂、和另外一种或多种非离子表面活性剂、以及任选的例如阳离子表面活性剂的另外表面活性剂的混合物的表面活性剂系统可能是优选的。优选的阴离子与非离子表面活性剂的重量比是至少2:1、或至少1:1至1:10。
[0264]
在一方面，表面活性剂系统可以包括由式a以及式b代表的类异戊二烯表面活性剂的混合物：
[0265][0266]
其中y是ch2或无，并且z可以如此选择以使得所得的表面活性剂是选自以下表面活性剂：烷基羧酸酯表面活性剂、烷基多烷氧基表面活性剂、烷基阴离子多烷氧基硫酸酯表面活性剂、烷基甘油酯磺酸酯表面活性剂、烷基二甲基氧化胺表面活性剂、基于烷基多羟基的表面活性剂、烷基磷酸酯表面活性剂、烷基甘油磺酸酯表面活性剂、烷基多葡糖酸酯表面活性剂、烷基多磷酸酯表面活性剂、烷基膦酸酯表面活性剂、烷基多糖苷表面活性剂、烷基单糖苷表面活性剂、烷基二糖苷表面活性剂、烷基磺基琥珀酸酯表面活性剂、烷基二硫酸酯表面活性剂、烷基二磺酸酯表面活性剂、烷基磺化琥珀酰胺酸酯表面活性剂、烷基葡萄糖酰胺表面活性剂、烷基牛磺酸酯表面活性剂、烷基肌氨酸酯表面活性剂、烷基甘氨酸酯表面活性剂、烷基羟乙基磺酸酯表面活性剂、烷基二链烷醇酰胺表面活性剂、烷基单链烷醇酰胺表面活性剂、烷基单链烷醇酰胺硫酸酯表面活性剂、烷基二羟基乙酰胺表面活性剂、烷基二羟基乙酰胺硫酸酯表面活性剂、烷基甘油酯表面活性剂、烷基甘油酯硫酸酯表面活性剂、烷基甘油醚表面活性剂、烷基甘油醚硫酸酯表面活性剂、烷基甲基酯磺酸酯表面活性剂、烷基多甘油醚表面活性剂、烷基多甘油醚硫酸酯表面活性剂、烷基山梨聚糖酯表面活性剂、烷基氨基烷烃磺酸酯表面活性剂、烷基酰胺丙基甜菜碱表面活性剂、基于烷基烯丙基化季铵盐的表面活性剂、基于烷基单羟基烷基-二-烷基化季铵盐的表面活性剂、基于烷基二-羟基烷基单烷基季铵盐的表面活性剂、烷基化季铵盐表面活性剂、烷基三甲基铵季铵盐表面活性剂、基于烷基多羟基烷基氧基丙基季铵盐的表面活性剂、烷基甘油酯季铵盐表面活性剂、烷基乙二醇胺季铵盐表面活性剂、烷基单甲基二羟基乙基季铵表面活性剂、烷基二甲基单羟基乙基季铵表面活性剂、烷基三甲基铵表面活性剂、基于烷基咪唑啉的表面活性剂、烯烃-2-基-琥珀酸酯表面活性剂、烷基a-磺化羧酸表面活性剂、烷基a-磺化羧酸烷基酯表面活性剂、α烯烃磺酸酯表面活性剂、烷基苯酚乙氧基化物表面活性剂、烷基苯磺酸酯表面活性剂、烷基磺基甜菜碱表面活性剂、烷基羟基磺基甜菜碱表面活性剂、烷基铵基羧酸甜菜碱表面活性剂、烷基蔗糖酯表面活性剂、烷基烷醇酰胺表面活性剂、烷基二(聚氧化乙烯)单烷基铵表面活性剂、烷基单(聚氧化乙烯)二烷基铵表面活性剂、烷基苄基二甲基铵表面活性剂、烷基氨基丙酸酯表面活性剂、烷基酰胺丙基二甲胺表面活性剂、或其混合物；并且如果z是带电部分，则z通过适合的金属或有机反离子被电荷平衡。适合的反离子包括金属反离子、胺、或烷醇胺，例如c1-c6烷醇铵。更确切地说，适合的反离子包括na 、ca 、li 、k 、mg ，例如单乙醇胺(mea)、二乙醇胺(dea)、三乙醇胺(tea)、2-氨基-l-丙醇、1-氨基丙醇、甲基二乙醇胺、二甲基乙醇胺、单异丙醇胺、三异丙醇胺、l-氨基-3-丙醇、或其混合物。在一个实施例中，所述组合物含有从5％至97％的一种或多种非类异戊二烯表面活性剂，以及一种或多种附属清洁添加剂，其中具有式a的表面活性剂与具有式b的表面活性剂的重量比是50:50至95:5。
[0267]
皂-本文的组合物可以含有皂。不受理论的限制，可令人希望的是包括皂，因为它部分充当表面活性剂并且部分充当助洗剂，并且可用于抑制泡沫，并且此外，可以有利地与组合物的多种阳离子化合物相互作用以增强用本发明组合物处理的纺织品织物的柔软性。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何皂。在一个实施例中，所述组合物含有从0wt％至20wt％、从0.5wt％至20wt％、从4wt％至10wt％、或从4wt％至7wt％的皂。
[0268]
本文有用的皂的实例包括油酸皂、棕榈酸皂、棕榈仁脂肪酸皂及其混合物。典型的皂处于具有不同链长和取代度的脂肪酸皂混合物的形式。一种这样的混合物是拔顶棕榈仁脂肪酸。
[0269]
在一个实施例中，所述皂选自游离脂肪酸。适合的脂肪酸是饱和的和/或不饱和的并且可以从天然来源如植物或动物酯(例如，棕榈仁油、棕榈油、椰子油、巴巴苏油、红花油、妥尔油、蓖麻油、牛油和鱼油、油脂、及其混合物)中获得，或合成地制备(例如，经由石油的氧化或者经由费托法(fisher tropsch process)氢化一氧化碳)。
[0270]
用于在本发明组合物中使用的适合的饱和脂肪酸的实例包括癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸和山萮酸。适合的不饱和脂肪酸种类包括：棕榈油酸、油酸、亚麻油酸、亚麻酸和蓖麻油酸。优选的脂肪酸的实例是饱和cn脂肪酸、饱和ci
2-ci4脂肪酸、和饱和或不饱和的cn至ci8脂肪酸及其混合物。
[0271]
当存在时，织物软化阳离子助表面活性剂与脂肪酸的重量比优选地是从约1:3至约3:1，更优选地从约1:1.5至约1.5:1，最优选地约1:1。
[0272]
本文的皂和非皂阴离子表面活性剂的水平是以酸式基础指定的按洗涤剂组合物的重量计的百分比。然而，正如本领域中通常理解的，在实践中使用钠、钾或链烷醇铵碱例如氢氧化钠或单乙醇胺中和阴离子表面活性剂和皂。
[0273]
水溶助剂-本发明的组合物可以包含一种或多种水溶助剂。水溶助剂是如下化合物，所述化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中溶解极性物质)。典型地，水溶助剂具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲性质，如由表面活性剂已知的)；然而，水溶助剂的分子结构一般不利于自发性自聚集，参见例如通过hodgdon和kaler(2007),current opinion in colloid&interface science[胶体和界面科学新见]12:121-128的综述。水溶助剂并不显示临界浓度，高于所述浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多水溶助剂显示连续类型的聚集过程，在所述过程中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，许多水溶助剂改变了含有极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。水溶助剂常规地在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。水溶助剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高粘度。
[0274]
洗涤剂可以含有从0wt％至10wt％，例如从0wt％至5wt％、0.5wt％至5wt％、或从3wt％至5wt％的水溶助剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何水溶助剂。水溶助剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(sts)、二甲苯磺酸钠(sxs)、枯烯磺酸钠(scs)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。
[0275]
助洗剂-本发明的组合物可以包含一种或多种助洗剂、共助洗剂、助洗剂系统或其
混合物。当使用助洗剂时，清洁组合物将典型地包含从0wt％至65wt％、至少1wt％、从2wt％至60wt％或从5wt％至10wt％的助洗剂。在餐具洗涤清洁组合物中，助洗剂的水平典型地是40wt％至65wt％或50wt％至65wt％。所述组合物可以是基本上不含助洗剂；基本上不含意指“没有有意添加的”沸石和/或磷酸盐。典型的沸石助洗剂包括沸石a、沸石p和沸石map。典型的磷酸盐助洗剂是三聚磷酸钠。
[0276]
在一个优选的实施例中，本发明的洗涤剂组合物具有大于7.5的储备碱度；并且包含高达15wt-％总量的铝硅酸盐(无水基底)和/或磷酸盐助洗剂(无水基底)(参见ep 1,712,611-a，将其通过引用特此结合)。
[0277]
在另一个优选的实施例中，本发明的洗涤剂组合物具有大于4的储备碱度；并且包含高达10wt％的铝硅酸盐(无水基底)和/或磷酸盐助洗剂(无水基底)(参见ep 1,712,610-a，将其通过引用特此结合)。
[0278]
助洗剂和/或共助洗剂可以特别是与ca和mg形成水溶性络合物的螯合试剂。可以使用本领域中已知用于在洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(stp或stpp)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司的sks-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(mea)、亚氨基二乙醇(dea)和2,2',2
”‑
次氮基三乙醇(tea)、以及羧甲基菊粉(cmi)、及其组合。
[0279]
清洁组合物可以单独地包括共助洗剂，或与助洗剂(例如沸石助洗剂)组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(paa)或共聚(丙烯酸/马来酸)(paa/pma)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐)、以及烷基琥珀酸或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2',2
”‑
次氨基三乙酸(nta)、乙二胺四乙酸(edta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、亚氨二琥珀酸(ids)、乙二胺-n,n'-二琥珀酸(edds)、甲基甘氨酸二乙酸(mgda)、谷氨酸-n,n-二乙酸(glda)、1-羟基乙烷-1,1-二基双(膦酸)(hedp)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(edtmpa)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(dtpmpa)、n-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(edg)、天冬氨酸-n-单乙酸(asma)、天冬氨酸-n,n-二乙酸(asda)、天冬氨酸-n-单丙酸(asmp)、亚氨二琥珀酸(ida)、n-(2-磺甲基)天冬氨酸(smas)、n-(2-磺乙基)天冬氨酸(seas)、n-(2-磺甲基)谷氨酸(smgl)、n-(2-磺乙基)谷氨酸(segl)、n-甲基亚氨基二乙酸(mida)、α-丙氨酸-n,n-二乙酸(α-alda)、丝氨酸-n,n-二乙酸(seda)、异丝氨酸-n,n-二乙酸(isda)、苯丙氨酸-n,n-二乙酸(phda)、邻氨基苯甲酸-n,n-二乙酸(anda)、对氨基苯磺酸-n、n-二乙酸(slda)、牛磺酸-n,n-二乙酸(tuda)和磺甲基-n,n-二乙酸(smda)、n-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸(hedta)、二乙醇甘氨酸(deg)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(dtpmp)、氨基三(亚甲基膦酸)(atmp)、及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如wo09/102854、us 5977053中。
[0280]
螯合试剂和晶体生长抑制剂-本文的组合物可以含有螯合试剂和/或晶体生长抑制剂。适合的分子包括铜、离子和/或锰螯合试剂及其混合物。适合的分子包括dtpa(二亚乙基三胺五乙酸)、hedp(羟基乙烷二膦酸)、dtpmp(二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸))、1,2-二羟基苯-3,5-二磺酸二钠盐水合物、乙二胺、二亚乙基三胺、乙二胺二琥珀酸(edds)、n-羟基乙基乙二胺三乙酸(hedta)、三亚乙基四胺六乙酸(ttha)、n-羟基乙基亚氨基二乙酸(heida)、
二羟基乙基甘氨酸(dheg)、亚乙基二胺四丙酸(edtp)、羧甲基菊粉以及2-膦酰基丁烷1,2,4-三羧酸(am)及其衍生物。典型地，所述组合物可以包含从0.005wt％至15wt％，或从3.0wt％至10wt％的螯合试剂或晶体生长抑制剂。
[0281]
漂白组分-适合用于掺入本发明的方法和组合物中的漂白组分包括多于一种漂白组分中的一种或混合物。适合的漂白组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸及其混合物。通常，当使用漂白组分时，本发明的组合物可以包含从0wt％至30wt％、从0.00001wt％至90wt％、0.0001wt％至50wt％、从0.001wt％至25wt％或从1wt％至20wt％。适合的漂白组分的实例包括：
[0282]
(1)预形成的过酸：适合的预形成的过酸包括但不限于选自由以下组成的组的化合物：预形成的过氧酸或其盐，典型地是过氧羧酸或其盐、或过氧硫酸或其盐。
[0283]
预形成的过氧酸或其盐优选是过氧羧酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：
[0284][0285]
其中：r
14
选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；r
14
基团可以是直链或支链的、取代或未取代的；且y是实现电荷中性的任何适合的反离子，优选地，y选自氢、钠或钾。优选地，r
14
是直链或支链的、取代或未取代的c
6-9
烷基。优选地，过氧酸或其盐选自过氧己酸、过氧庚酸、过氧辛酸、过氧壬酸、过氧癸酸、及其盐，或其任何组合。特别优选的过氧酸是邻苯二甲酰亚胺基-过氧基-链烷酸，特别是ε-邻苯二甲酰亚胺基过氧基己酸(pap)。优选地，过氧酸或其盐具有处于从30℃至60℃的范围内的熔点。
[0286]
预成形的过氧酸或其盐还可以是过氧硫酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：
[0287][0288]
其中：r
15
选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；r
15
基团可以是直链或支链的、取代或未取代的；并且z是达到电荷中性的任何适合的反离子，优选地，z选自氢、钠或钾。优选地，r
15
是直链或支链的、取代或未取代的c
6-9
烷基。优选地，此类漂白组分可以按从0.01wt％至50wt％、或从0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。
[0289]
(2)过氧化氢源包括例如无机过氧化氢合物盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是一水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐及其混合物。在本发明的一方面，无机过氧化氢合物盐是例如选自由以下组成的组的那些：过硼酸盐、过碳酸盐的钠盐及其混合物。当使用时，无机过氧化氢合物盐典型地以整体组合物的0.05wt％至40wt％或1wt％至30wt％的量存在并且典型地被掺入进此类组合物中作为可以被包衣的结晶固体。适合的包衣包括：无机盐，例如碱金属硅酸盐、碳酸盐或硼酸盐或其混合物，或有机材料，例如水溶性或水分散性聚合物、蜡、油或脂肪皂。优选地，此类漂白组分
可以按0.01wt％至50wt％、或0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。
[0290]
(3)术语漂白活化剂在本文意指与过氧化氢反应以经由过水解反应形成过酸的化合物。由此形成的过酸构成活化的漂白剂。本文有待使用的适合的漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的漂白活化剂是具有r-(c＝o)-l的那些，其中r是烷基基团(优选是支链的)，当所述漂白活化剂是疏水的时候，具有从6个至14个碳原子，或从8个至12个碳原子，并且当所述漂白活化剂是亲水的时，具有小于6个碳原子或小于4个碳原子；并且l为离去基团。适合的离去基团的实例是苯甲酸及其衍生物-尤其是苯磺酸盐。适合的漂白活化剂包括十二酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺(taed)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(isonobs)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸盐(lobs)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(dobs或doba)、4-(壬酰基氧基)苯-1-磺酸盐(nobs))、和/或披露于wo 98/17767中的那些。漂白活化剂的家族披露于ep 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(atc)。atc或短链甘油三酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是有效的漂白活化剂。最后，atc是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。可替代地，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜类型的过氧酸。漂白系统还可以包含过酸，例如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(pap)。适合的漂白活化剂还披露于wo 98/17767中。尽管可采用任何适合的漂白活化剂，但在本发明的一方面，本主题清洁组合物可以包含nobs、taed或其混合物。当存在时，基于织物及家居护理组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以0.1wt％至60wt％、0.5wt％至40wt％或0.6wt％至10wt％的量存在于组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。优选地，此类漂白组分可以按0.01wt％至50wt％、或0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。
[0291]
可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或甚至2:1至10:1。
[0292]
(4)二酰基过氧化物
–
优选的二酰基过氧化物漂白种类包括选自具有以下通式的二酰基过氧化物的那些：r
1-c(o)-oo-(o)c-r2，其中r1表示c
6-c
18
烷基，优选地是含有具有至少5个碳原子的直链并且任选地含有一个或多个取代基(例如
–n
(ch3)3、-cooh或-cn)和/或在烷基的相邻碳原子之间插入的一个或多个中断部分(例如-conh-或-ch＝ch-)的c
6-c
12
烷基基团，并且r2表示与过氧化物部分可相容的脂肪族基团，以使得r1和r2一起含有总共8至30个碳原子。在一个优选方面，r1和r2是直链的未取代的c
6-c
12
烷基链。最优选地，r1和r2是相同的。二酰基过氧化物(其中r1和r2均是c
6-c
12
烷基基团)是特别优选的。优选地，r基团(r1或r2)中的至少一个、最优选地仅有一个在α位不含有分支环或侧基环，或优选在α位或β位都不含有分支环或侧基环，或最优选在α位或β位或γ位都不含有分支环或侧基环。在一个另外优选的实施例中，dap可以是不对称的，这样使得r1酰基基团优选地迅速水解以产生过酸，但是r2酰基基团的水解缓慢。
[0293]
四酰基过氧化物漂白种类优选地选自以下通式的四酰基过氧化物：r
3-c(o)-oo-c(o)-(ch2)n-c(o)-oo-c(o)-r3，其中r3表示c
1-c9烷基或c
3-c7基团，并且n表示从2至12或4至10(包括端值)的整数。
[0294]
优选地，二酰基和/或四酰基过氧化物漂白种类以足够提供按重量计至少0.5ppm、至少10ppm、或至少50ppm的洗涤液的量存在。在一个优选的实施例中，漂白种类以足够提供按洗涤液重量计从0.5至300ppm、从30ppm至150ppm的量存在。
[0295]
优选地，漂白组分包括漂白催化剂(5和6)。
[0296]
(5)优选的是有机(非金属)漂白催化剂，包括能够接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子并且将所述氧原子转移至可氧化的底物的漂白催化剂。适合的漂白催化剂包括但不限于：亚胺阳离子和聚离子；亚胺兼性离子；修饰的胺；修饰的氧化胺；n-磺酰基亚胺；n-磷酰基亚胺；n-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮及其混合物。
[0297]
适合的亚胺阳离子和聚离子包括但不限于，n-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓四氟硼酸盐，如tetrahedron[四面体](1992),49(2),423-38中所述的进行制备(例如化合物4，第433页)；n-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓对甲苯磺酸盐，如us 5360569中所述的进行制备(例如第11栏，实例1)；以及正辛基-3,4-二氢异喹啉鎓对-甲苯磺酸盐，如us 5360568所述的进行制备(例如第10栏，实例3)。
[0298]
适合的亚胺兼性离子包括但不限于，n-(3-磺丙基)-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如us 5576282中所述的进行制备(例如第31栏，实例ii)；n-[2-(磺氧基)十二烷基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如us 5817614中所述的进行制备(例如，第32栏，实例v)；2-[3-[(2-乙基己基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如wo 05/047264中所述的进行制备(例如，第18页，实例8)，以及2-[3-[(2-丁基辛基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐。
[0299]
适合的修饰的胺氧转移催化剂包括但不限于1,2,3,4-四氢-2-甲基-1-异喹啉醇，其可根据tetrahedron letters[四面体通讯](1987),28(48),6061-6064中描述的程序制备。适合的修饰的氧化胺氧气转移催化剂包括但不限于1-羟基-n-氧代-n-[2-(磺氧基)癸基]-1,2,3,4-四氢异喹啉钠。
[0300]
适合的n-磺酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于3-甲基-1,2-苯并异噻唑1,1-二氧化物，其可根据journal of organic chemistry[有机化学杂志](1990),55(4),1254-61中描述的程序制备。
[0301]
适合的n-膦酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于[r-(e)]-n-[(2-氯-5-硝基苯基)亚甲基]-对苯基-对-(2,4,6-三甲基苯基)次膦酸酰胺，其可根据journal of the chemical society[化学学会杂志],chemical communications[化学通讯](1994),(22),2569-70中描述的程序制备。
[0302]
适合的n-酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于可以[n(e)]-n-(苯基亚甲基)乙酰胺，其可根据polish journal of chemistry[波兰化学杂志](2003),77(5),577-590中描述的程序制备。
[0303]
适合的噻二唑二氧化物氧转移催化剂包括但不限于3-甲基-4-苯基-1,2,5-噻二唑1,1-二氧化物，其可根据us 5753599(第9栏，实例2)中描述的程序制备。
[0304]
适合的全氟亚胺氧转移催化剂包括但不限于(z)-2,2,3,3,4,4,4-七氟-n-(壬氟丁基)丁酰亚胺氟化物，其可根据tetrahedron letters[四面体通讯](1994),35(34),6329-30中描述的程序制备。
[0305]
适合的环状糖酮氧传递催化剂包括但不限于如在us 6649085(第12栏，实例1)中
制备的1,2:4,5-二-o-异亚丙基-d-赤-2,3-己二酮(hexodiuro)-2,6-吡喃糖。
[0306]
优选地，漂白催化剂包含亚胺离子和/或羰基官能团，并且典型地能够在接受氧原子，尤其是从过氧酸和/或其盐接受氧原子后形成过氧亚胺正离子(oxaziridinium)和/或双环氧乙烷官能团。优选地，漂白催化剂包含过氧亚胺正离子官能团和/或在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成过氧亚胺正离子官能团。优选地，漂白催化剂包含环状亚胺离子官能团，优选其中所述环状部分具有从五个至八个原子(包括氮原子)、优选六个原子的环大小。优选地，漂白催化剂包含芳基亚胺离子官能团，优选二环芳基亚胺官能团，优选是3,4-二氢异喹啉鎓官能团。典型地，亚胺官能团是季亚胺官能团并且典型地在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成季过氧亚胺正离子官能团。在另一方面，所述洗涤剂组合物包括具有不大于0、不大于-0.5、不大于-1.0、不大于-1.5、不大于-2.0、不大于-2.5、不大于-3.0、或不大于-3.5的logp
o/w
的漂白组分。下面更加详细地描述用于确定logp
o/w
的方法。
[0307]
典型地，漂白成分能够产生具有从0.01至0.30、从0.05至0.25或从0.10至0.20的x
so
的漂白种类。下面更加详细地描述用于确定xso的方法。例如，具有异喹啉鎓结构的漂白成分能够产生具有过氧亚胺正离子结构的漂白种类。在此实例中，xso是过氧亚胺正离子漂白种类的xso。
[0308]
优选地，漂白催化剂具有对应于以下化学式的化学结构：
[0309][0310]
其中：n和m独立地为0至4，优选n和m均为0；每个r1独立地选自取代的或未取代的基团，所述基团选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、芳基、稠合芳基、杂环、稠合杂环、硝基、卤基、氰基、磺酸根、烷氧基、酮基、羧基以及烷氧羰基；并且任何两个连位的r1取代基可以合并以形成稠合芳基、稠合碳环或稠合杂环；每个r2独立地选自取代的或未取代的基团，所述基团独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、烷基、环烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、亚烷基、杂环、烷氧基、芳基羰基、羧基烷基以及酰胺基团；任何r2可以与任何其他的r2结合在一起以形成常见环的一部分；任何偕r2可以合并以形成羰基；并且任何两个r2可以合并以形成取代的或未取代的稠合的不饱和部分；r3是c1至c
20
取代的或未取代的烷基；r4为氢或所述q
t-a部分，其中：q是分支或未分支的亚烷基，t＝0或1，并且a是选自由以下组成的组的阴离子基团：oso
3-、so
3-、co
2-、oco
2-、opo
32-、opo3h-和opo
2-；r5是氢或部分-cr
11r12-y-g
b-y
c-[(cr9r
10
)
y-o]
k-r8，其中：每个y独立地选自由以下组成的组：o、s、n-h或n-r8；并且每个r8独立地选自由以下组成的组：烷基、芳基和杂芳基，所述部分是取代或未取代的，并且无论是取代的还是未取代的，所述部分具有少于21个碳；每个g独立地选自由以下组成的组：co、so2、so、po和po2；r9和r
10
独立地选自由以下组成的组：h和c
1-c4烷基；r
11
和r
12
独立地选自由以下组成的组：h和烷基，或者当放一起时可以结合形成羰基；b＝0或1；c可以＝0或1，但是如果b＝0，c必须＝0；y是从1至6的整数；k是从0至20的整数；r6是h，或是烷基、芳基或杂芳
基部分；所述部分是取代或未取代的；并且如果x存在的话，它是适合的电荷平衡反离子，当r4为氢时x优选存在，适合的x包括但不限于：氯化物、溴化物、硫酸盐、甲硫酸盐、磺酸盐、对甲苯磺酸盐、四氟化硼以及磷酸盐。
[0311]
在本发明的一个实施例中，漂白催化剂具有对应于以下通式的结构：
[0312][0313]
其中r
13
是含有从三个至24个碳原子(包括分支的碳原子)的支链烷基基团或含有从一个至24个碳原子的直链烷基基团；优选地，r
13
是含有从八个至18个碳原子的支链烷基基团或含有从八个至十八个碳原子的直链烷基基团；优选地，r
13
选自由以下组成的组：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基和异十五烷基；优选地，r
13
选自由以下组成的组：2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、异十三烷基和异十五烷基。
[0314]
优选地，除了漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂以外，漂白组分还包含过酸源。过酸源可以选自(a)预形成的过酸；(b)过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐(过氧化氢源)，优选与漂白活化剂组合；和(c)过水解酶以及酯，用于在纺织品或硬表面处理步骤中在水的存在下原位形成过酸。
[0315]
当存在时，基于该组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以从0.1wt％至60wt％、从0.5wt％至40wt％或从0.6wt％至10wt％的量存在于该组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。
[0316]
可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1、或2:1至10:1。
[0317]
(6)包含金属的漂白催化剂-可以由催化金属络合物提供漂白组分。一种类型的含有金属的漂白催化剂是以下催化系统，所述催化系统包含具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，具有很少或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，以及对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的隔离物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐。此类催化剂披露于us 4430243中。优选的催化剂描述于wo 09/839406、us 6218351和wo 00/012667中。特别优选的是过渡金属催化剂或因此作为交联桥多齿n-供体配体的配体。
[0318]
如果希望的话，可以借助锰化合物催化本文的组合物。此类化合物以及使用水平在本领域中是熟知的并且包括例如披露于us 5576282中的基于锰的催化剂。
[0319]
本文有用的钴漂白催化剂是已知的并且例如描述于us 5597936；us 5595967中。通过已知的程序可容易地制备此类钴催化剂，像例如us 5597936和us 5595967中传授的程序。
[0320]
本文的组合物还可以适合地包括配体的过渡金属络合物，例如双哌啶酮(bispidone)(us 7501389)和/或大多环刚性配体-缩写为“mrl”。作为一个实际问题而并不作为限制之用，可以调整本文的组合物和方法，以在水性洗涤介质中提供大约至少一亿分之一的活性mrl种类，并且将典型地在洗涤液中提供从0.005ppm至25ppm、从0.05ppm至10ppm或从0.1ppm至5ppm的mrl。
[0321]
本发明的过渡金属漂白催化剂中的适合的过渡金属包括例如锰、铁和铬。适合的mrl包括5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷。通过已知的程序可容易地制备适合的过渡金属mrl，像例如us 6225464和wo 00/32601中传授的程序。
[0322]
(7)光漂白剂-适合的光漂白剂包括例如磺化的酞菁锌、磺化的酞菁铝、呫吨染料及其混合物。用于在本发明的组合物中使用的优选漂白组分包含过氧化氢源、漂白活化剂和/或有机过氧酸，任选地通过过氧化氢源和漂白活化剂与漂白催化剂相组合的反应而原位产生。优选的漂白组分包含漂白催化剂，优选如上文所述的有机漂白催化剂。
[0323]
特别优选的漂白组分是漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂。
[0324]
示例性漂白系统还描述于例如wo 2007/087258、wo 2007/087244、wo 2007/087259以及wo 2007/087242中。
[0325]
织物调色剂-组合物可以包含织物调色剂。适合的织物调色剂包括染料、染料-粘土共轭物、以及颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自由属于以下比色指数(c.i.)分类的染料组成的组的小分子染料：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物。
[0326]
在另一方面，适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由以下各项组成：比色指数(染工和着色师学会(society of dyers and colorists)，布拉德福德，英国)编号直接紫9、直接紫35、直接紫48、直接紫51、直接紫66、直接紫99、直接蓝1、直接蓝71、直接蓝80、直接蓝279、酸性红17、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性紫15、酸性紫17、酸性紫24、酸性紫43、酸性红52、酸性紫49、酸性紫50、酸性蓝15、酸性蓝17、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝40、酸性蓝45、酸性蓝75、酸性蓝80、酸性蓝83、酸性蓝90和酸性蓝113、酸性黑1、碱性紫1、碱性紫3、碱性紫4、碱性紫10、碱性紫35、碱性蓝3、碱性蓝16、碱性蓝22、碱性蓝47、碱性蓝66、碱性蓝75、碱性蓝159及其混合物。在另一方面，适合的小分子染料包括选自由以下组成的组的小分子染料：比色指数(染工和着色师学会，布拉德福德，英国)编号酸性紫17、酸性紫43、酸性红52、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝45、酸性蓝113、酸性黑1、直接蓝1、直接蓝71、直接紫51及其混合物。在另一方面，适合的小分子染料包括选自由以下组成的组的小分子染料：比色指数(染工和着色师学会，布拉德福德，英国)编号酸性紫17、直接蓝71、直接紫51、直接蓝1、酸性红88、酸性红150、酸性蓝29、酸性蓝113或其混合物。
[0327]
适合的聚合物染料包括选自由以下组成的组的聚合物染料：含有共轭色原体的聚合物(染料-聚合物共轭物)以及色原体共聚到聚合物主链中的聚合物，及其混合物。
[0328]
在另一方面，适合的聚合物染料包括选自由以下组成的组的聚合物染料：在(美利肯(milliken))名称之下出售的织物实质性着色剂，从至少一种反应性染料和选自由以下组成的组的聚合物形成的染料-聚合物共轭物：包含选自由羟基部分、一级胺部分、二级胺部分、硫醇部分及其混合物组成的组的部分的聚合物。在仍另一方面，适合的聚合物染料包括选自由以下组成的组的聚合物染料：紫色ct，与活性蓝、活性紫或活性红染料共轭的羧甲基纤维素(cmc)(例如与c.i.活性蓝19(由麦格酶公司(megazyme)，威克洛，爱尔兰，在生产名azo-cm-cellulose生产代码s-acmc下售卖)共轭的cmc)，烷氧基化的三苯基-甲烷聚合物着色剂，烷氧基化的噻吩聚合物着色剂，及其混合物。
[0329]
优选的调色染料包括发现于wo 08/87497中的增白剂。这些增白剂可以由以下结
构(i)表征：
[0330][0331]
其中r1和r2可以独立地选自：
[0332]
a)[(ch2cr’ho)
x
(ch2cr”ho)yh]
[0333]
其中r’选自由以下组成的组：h、ch3、ch2o(ch2ch2o)zh、及其混合物；其中r”选自由以下组成的组：h、ch2o(ch2ch2o)zh、及其混合物；其中x y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5；
[0334]
b)r1＝烷基、芳基、或芳基烷基，并且r2＝[(ch2cr’ho)
x
(ch2cr”ho)yh]
[0335]
其中r’选自由以下组成的组：h、ch3、ch2o(ch2ch2o)zh、及其混合物；其中r”选自由以下组成的组：h、ch2o(ch2ch2o)zh、及其混合物；其中x y≤10；其中y≥1；并且其中z＝0至5；
[0336]
c)r1＝[ch2ch2(or3)ch2or4]并且r2＝[ch2ch2(o r3)ch2o r4]
[0337]
其中r3选自由以下组成的组：h、(ch2ch2o)zh及其混合物；并且其中z＝0至10；
[0338]
其中r4选自由以下组成的组：(c
1-c
16
)烷基、芳基基团、及其混合物；以及
[0339]
d)其中r1和r2可以独立地选自氧化苯乙烯、缩水甘油甲醚、异丁基缩水甘油醚、异丙基缩水甘油醚、叔丁基缩水甘油醚、2-乙基己基缩水甘油醚、以及缩水甘油十六烷基醚的氨基加成产物，随后为从1至10个环氧烷单位的加成。
[0340]
本发明的优选增白剂可以由以下结构(ii)表征：
[0341][0342]
其中r’选自由以下组成的组：h、ch3、ch2o(ch2ch2o)zh、及其混合物；其中r”选自由以下组成的组：h、ch2o(ch2ch2o)zh、及其混合物；其中x y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5。
[0343]
本发明的另外优选的增白剂可以由以下结构(iii)表征：
[0344][0345]
典型地包含具有一共5个eo基团的混合物。适合的优选分子是在结构i中的具有在上文中“部分a”中的以下侧基的那些。
[0346]
表1
[0347] r1
ꢀꢀꢀ
r2
ꢀꢀꢀꢀ
r’r”xyr’r”xyahh31hh01bhh21hh11c＝bhh11hh21d＝ahh01hh31
[0348]
使用的另外的增白剂包括描述于us 2008/34511(联合利华(unilever))中的那些。优选的试剂是“紫色13”。
[0349]
适合的染料粘土共轭物包括选自下组的染料粘土共轭物，所述组包含至少一种阳离子/碱性染料和绿土及其混合物。在另一方面，适合的染料粘土共轭物包括选自由一种阳离子/碱性染料和粘土组成的组的染料粘土共轭物，所述阳离子/碱性染料选自由以下组成的组：c.i.碱性黄1至108、c.i.碱性橙1至69、c.i.碱性红1至118、c.i.碱性紫1至51、c.i.碱性蓝1至164、c.i.碱性绿1至14、c.i.碱性棕色1至23、ci碱性黑1至11，并且所述粘土选自由以下组成的组：蒙脱石粘土、水辉石粘土、皂石粘土及其混合物。在仍另一方面，适合的染料粘土共轭物包括选自由以下组成的组的染料粘土轭合物：蒙脱石碱性蓝b7 c.i.42595共轭物，蒙脱石碱性蓝b9 c.i.52015共轭物，蒙脱石碱性紫v3 c.i.42555共轭物，蒙脱石碱性绿g1 c.i.42040共轭物，蒙脱石碱性红r1 c.i.45160共轭物，蒙脱石c.i.碱性黑2共轭物，锂蒙脱石碱性蓝b7 c.i.42595共轭物，锂蒙脱石碱性蓝b9 c.i.52015共轭物，锂蒙脱石碱性紫v3 c.i.42555共轭物，锂蒙脱石碱性绿g1 c.i.42040共轭物，锂蒙脱石碱性红r1 c.i.45160共轭物，锂蒙脱石c.i.碱性黑2共轭物，皂石碱性蓝b7 c.i.42595共轭物，皂石碱性蓝b9 c.i.52015共轭物，皂石碱性紫v3c.i.42555共轭物，皂石碱性绿g1 c.i.42040共轭物，皂石碱性红r1 c.i.45160共轭物，皂石c.i.碱性黑2共轭物及其混合物。
[0350]
适合的颜料包括选自由以下组成的组的颜料：黄士酮、阴丹酮、含有从1至4个氯原子的含氯阴丹酮、皮蒽酮、二氯皮蒽酮、单溴二氯皮蒽酮、二溴二氯皮蒽酮、四溴皮蒽酮、二萘嵌苯-3,4,9,10-四羧酸二酰亚胺(其中所述酰亚胺基团可以是未取代的或被c1-c3-烷基或苯基或杂环基团取代的，并且其中所述苯基和杂环基团可以另外地带有不赋予在水中的溶解度的取代基)、蒽素嘧啶羧酸酰胺、蒽酮紫、异蒽酮紫、二噁嗪颜料、每个分子可以含有高达2个氯原子的酞菁铜、多氯-酞菁铜或每个分子含有高达14个溴原子的多溴氯-酞菁铜，及其混合物。
[0351]
在另一方面，适合的颜料包括选自由以下组成的组的颜料：群青蓝(c.i.颜料蓝29)、群青紫罗兰(c.i.颜料紫罗兰15)以及其混合物。
[0352]
上述织物调色剂可以组合使用(可以使用织物调色剂的任何混合物)。适合的调色剂更详细地描述于us 7208459中。染料在本发明的组合物中的优选水平是0.00001至0.5wt％、或0.0001至0.25wt％。用于处理和/或清洁步骤的水中优选的染料浓度为从1ppb至5ppm、10ppb至5ppm或20ppb至5ppm。在优选的组合物中，表面活性剂的浓度将是从0.2g/l至3g/l。
[0353]
胶囊化物-组合物可以包含胶囊化物。在一方面，胶囊化物包含核心、具有内表面和外表面的包壳，所述包壳封装所述核心。
[0354]
在所述胶囊化物的一方面，所述核心可以包含选自由以下组成的组的材料：香料增亮剂；染料；驱虫剂；硅酮；蜡；调味剂；维生素；织物软化剂；护肤剂；在一方面，石蜡；酶；抗细菌剂；漂白剂；感受剂(sensate)；及其混合物；并且所述包壳可以包含选自由以下组成的组的材料：聚乙烯；聚酰胺；聚乙烯醇，任选地含有其他共聚单体；聚苯乙烯；聚异戊二烯；聚碳酸酯；聚酯；聚丙烯酸酯；氨基塑料，在一方面，所述氨基塑料可以包含聚脲、聚氨酯和/或聚脲聚氨酯，在一方面，所述聚脲可以包含聚氧基亚甲基脲和/或三聚氰胺甲醛；聚烯烃；多糖，在一方面，所述多糖可以包含藻朊酸盐和/或壳聚糖；明胶；虫胶；环氧树脂；乙烯基聚合物水不溶性无机物；硅酮；及其混合物。
[0355]
在所述胶囊化物的一方面，所述核心可以包含香料。
[0356]
在所述胶囊化物的一方面，所述包壳可以包含三聚氰胺甲醛和/或交联的三聚氰胺甲醛。
[0357]
在一方面，披露了适合的胶囊化物可以包含核心材料和包壳，所述包壳至少部分地包围所述核心材料。所述胶囊化物的至少75％、85％或90％可以具有从0.2mpa至10mpa、从0.4mpa至5mpa、从0.6mpa至3.5mpa或从0.7mpa至3mpa的抗断强度；并且具有从0％至30％、从0％至20％或从0％至5％的有益试剂泄露。
[0358]
在一方面，所述胶囊化物的至少75％、85％或90％可以具有从1微米至80微米、从5微米至60微米、从10微米至50微米或从15微米至40微米的粒度。
[0359]
在一方面，所述胶囊化物的至少75％、85％或90％可以具有从30nm至250nm、从80nm至180nm或从100nm至160nm的颗粒壁厚。
[0360]
在一方面，所述胶囊化物的核心材料可以包括一种选自由香料原材料组成的组的材料，和/或任选地包括一种选自由以下组成的组的材料：植物油，包括纯净植物油和/或共混植物油，包括蓖麻油、椰子油、棉籽油、葡萄籽油、油菜籽、大豆油、玉米油、棕榈油、亚麻籽油、红花油、橄榄油、花生油、椰子油、棕榈仁油、蓖麻油、柠檬油及其混合物；植物油的酯，酯，包括己二酸二丁酯、酞酸二丁酯、己二酸丁基苄酯、己二酸辛基苄酯、磷酸三甲苯酯、磷酸三辛酯及其混合物；直链或支链烃，包括具有高于约80℃的沸点的那些直链或支链烃；部分氢化的三联苯、二烷基邻苯二甲酸酯、烷基联苯(包括单异丙基联苯)、烷基化的萘(包括二丙基萘)、石油精(包括煤油)、矿物油及其混合物；芳香族溶剂，包括苯、甲苯及其混合物；硅酮油；及其混合物。
[0361]
在一方面，所述胶囊化物的壁材料可以包括适合的树脂，所述树脂包括醛和胺的反应产物，适合的醛包括甲醛。适合的胺包括三聚氰胺、脲、苯并胍胺、甘脲及其混合物。适
合的三聚氰胺包括羟甲基三聚氰胺、甲基化的羟甲基三聚氰胺、亚氨基三聚氰胺及其混合物。适合的脲包括二羟甲基脲、甲基化的二羟甲基脲、脲-间苯二酚及其混合物。
[0362]
在一方面，在将胶囊化物添加至组合物之前、期间或之后，适合的甲醛清除剂可以与例如处于胶囊浆料中的胶囊化物一起使用和/或添加至这种组合物中。适合的胶囊可以通过us 2008/0305982、和/或us 2009/0247449的以下教导来制成。
[0363]
在一个优选方面，所述组合物还可以包含沉积助剂，优选由下组组成的沉积助剂，所述组包含阳离子或非离子聚合物。适合的聚合物包括阳离子淀粉、阳离子羟基乙基纤维素、聚乙烯甲醛、槐树豆胶、甘露聚糖、木葡聚糖、罗望子胶、聚乙二醇对苯二甲酸酯，以及含有甲基丙烯酸二甲胺乙酯的聚合物，任选地具有一种或选自包含丙烯酸和丙烯酰胺的组的单体。
[0364]
香料-在一方面，组合物包含香料，所述香料包含选自由以下组成的组的一种或多种香料原材料：1,1
’‑
氧基双-2-丙醇；1,4-环己烷二甲酸二乙酯；(乙氧基甲氧基)环十二烷；1,3-壬二醇单乙酸酯；(3-甲基丁氧基)乙酸2-丙烯基酯；β-甲基环十二烷乙醇；2-甲基-3-[(1,7,7-三甲基双环[2.2.1]庚-2-基)氧]-1-丙醇；氧杂环十六烷-2-酮；α-甲基-苯甲醇酯；反式-3-乙氧基-1,1,5-三甲基环己烷；4-(1,1-二甲基乙基)环己醇乙酸酯；十二氢-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,1-b]呋喃；β-甲基苯丙醛；β-甲基-3-(1-甲基乙基)苯丙醛；4-苯基-2-丁酮；2-甲基丁酸乙酯；苯甲醛；2-甲基丁酸1-甲基乙酯；二氢-5-戊基-2(3h)呋喃酮；(2e)-1-(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；十二醛；十一醛；2-乙基-α,α-二甲基苯丙醛；癸醛；α,α-二甲基苯乙醇乙酸酯；2-(苯基亚甲基)辛醛；2-[[3-[4-(1,1-二甲基乙基)苯基]-2-甲基亚丙基]氨基]苯甲酸甲酯；1-(2,6,6-三甲基-3-环己烯-1-即)-2-丁烯-1-酮；2-戊基环戊酮；3-氧代-2-戊基环戊乙酸甲酯；4-羟基-3-甲氧基苯甲醛；3-乙氧基-4-羟基苯甲醛；2-庚基环戊酮；1-(4-甲基苯基)乙酮；(3e)-4-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮；(3e)-4-(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮；苯乙醇；2h-1-苯并吡喃-2-酮；4-甲氧基苯甲醛；10-十一烯醛；丙酸苯甲酯；β-甲基苯戊醇；1,1-二乙氧基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯；α,α-二甲基苯乙醇；(2e)-1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；乙酸苯甲酯；环己基丙酸-2-丙烯酯；己酸-2-丙烯酯；1,2-二甲氧基-4-(2-丙烯基)苯；1,5-二甲基-二环[3.2.1]辛烷-8-酮肟；4-(4-羟基-4-甲基戊基)-3-环己烯-1-甲醛；3-丁烯-2-醇；2-[[[2,4(或3,5)-二甲基-3-环己烯-1-基]亚甲基]氨基]苯甲酸甲酯；8-环十六烯-1-酮；甲基紫罗兰酮；2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇；2-甲氧基-4-(2-丙烯基)苯酚；(2e)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇；2-羟基-苯甲酸(3z)-3-己烯酯；2-十三碳烯腈；4-(2,2-二甲基-6-亚甲基环己基)-3-甲基-3-丁烯-2-酮；四氢-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2h-吡喃；乙酸(2-甲基丁氧基)-2-丙烯基酯；苯甲酸2-羟基-3-甲基丁酯；(z)-1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；2-己基-3-氧代环戊烷甲酸甲酯；4-乙基-α,α-二甲基-苯丙醛；3-(4-羟基-4-甲基戊基)-3-环己烯-1-甲醛；1-(2,3,4,7,8,8a-六氢-3,6,8,8-四甲基-1h-3a,7-桥亚甲基薁-5-基)-[3r-(3α,3aβ,7β,8aα)]-乙酮；2-甲基-2h-吡喃-2-酮6-丁基四氢-十一醛；4-(1,1-二甲基乙基)-α-甲基-苯丙醛；5-庚基二氢-2(3h)-呋喃酮；2-[(7-羟基-3,7-二甲基亚辛基)氨基]苯甲酸甲酯；2-羟基-苯甲酸苯甲酯；2-甲氧基萘；2-己基-2-环戊烯-1-酮；5-己基二氢-2(3h)-呋喃酮；3-甲基-3-苯基-环氧乙烷羧酸乙酯；1,3,3-三甲基-2-氧杂二环[2.2.2]辛烷；苯戊醇，.γ.-甲基-；3,7-二甲基-3-辛醇；
3,7-二甲基-2,6-辛二烯腈；3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇；萜品醇乙酸酯；2-甲基-6-亚甲基-7-辛烯-2-醇二氢衍生物；3a,4,5,6,7,7a-六氢-4,7-桥亚甲基-1h-茚-6-醇丙酸酯；3-甲基-2-丁烯-1-醇乙酸酯；(z)-3-己烯-1-醇乙酸酯；2-乙基-4-(2,2,3-三甲基-3-环戊烯-1-基)-2-丁烯-1-醇；4-(八氢-4,7-桥亚甲基-5h-茚-5-亚基)-丁醛；3-2,4-二甲基-环己烯-1-甲醛；1-(1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-2,3,8,8-四甲基-2-萘)-乙酮；2-羟基-苯甲酸甲酯；2-羟基-苯甲酸己酯；2-苯氧基-乙醇；2-羟基-苯甲酸戊酯；2,3-庚二酮；2-己烯-1-醇；2,6-二甲基-6-辛烯-2-醇；大马酮(damascene)(α、β、γ或δ或其混合物)，3a,4,5,6,7,7a-六氢-4,7-桥亚甲基-1h-茚-6-醇乙酸酯；9-十一烯醛；8-十一烯醛；异环柠檬醛；1-(1,2,3,5,6,7,8,8a-八氢-2,3,8,8-四甲基-2-萘)-乙酮；3,5-二甲基-3-环己烯-1-甲醛；2,4-二甲基-3-环己烯-1-甲醛；3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇；3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇乙酸酯；铃兰醛(p-t-bucinal)、和2-[2-(4-甲基-3-环己烯-1-基)丙基]-环戊酮和1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯及其混合物。
[0365]
在一方面，所述组合物可以包含胶囊化的香料颗粒，所述颗粒包含水溶性羟基化合物或三聚氰胺-甲醛或改性的聚乙烯醇。在一方面，胶囊化物包含(a)至少部分水溶的固体基质，所述基质包含一种或多种水溶性羟基化合物，优选淀粉；以及(b)由所述固体基质包封的香料油。
[0366]
在另一方面，所述香料可以是与多胺(优选聚乙烯亚胺)预复合的，以形成席夫碱(schiff base)。
[0367]
聚合物-组合物可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-n-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯(例如聚丙烯酸酯)、马来酸/丙烯酸共聚物、以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
[0368]
组合物可以包含一种或多种两亲清洁聚合物，例如具有以下一般结构的化合物：双((c2h5o)(c2h4o)n)(ch3)-n
-c
xh2x-n
-(ch3)-bis((c2h5o)(c2h4o)n)，其中n＝从20至30，并且x＝从3至8，或其硫酸化的或磺化的变体。
[0369]
组合物可以包含两亲烷氧基化油脂清洁聚合物，所述聚合物具有平衡的亲水和疏水特性，这样使得它们从织物和表面去除油脂颗粒。本发明的两亲烷氧基化油脂清洁聚合物的具体实施例包含一个核心结构和与那个核心结构连接的多个烷氧基化基团。这些可以包含烷氧基化的聚烯属烃亚胺(polyalkylenimine)，优选具有内聚环氧乙烷嵌段和外聚环氧丙烷嵌段。
[0370]
烷氧基化的聚羧酸酯(例如从聚丙烯酸酯制备的那些)可在本文用于提供另外的油脂去除性能。此类材料描述于wo 91/08281和pct 90/01815中。在化学上，这些材料包括每7-8个丙烯酸酯单元具有一条乙氧基侧链的聚丙烯酸酯。侧链具有式-(ch2ch2o)m(ch2)nch3，其中m是2-3并且n是6-12。侧链是酯连接至聚丙烯酸酯“主链”，以提供“梳子状”聚合物类型结构。分子量可以不同，但典型地处于2000至50,000的范围内。此类烷氧基化的聚羧酸酯可以包含本文的组合物的从0.05wt％至10wt％。
[0371]
本发明的类异戊二烯衍生的表面活性剂，以及与其他助表面活性剂和其他辅助剂成分一起形成的混合物特别适合与两亲接枝共聚物使用，优选地所述两亲接枝共聚物包含(i)聚乙二醇主链；以及(ii)和至少一个侧基部分，所述侧基部分选自聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇及其混合物。优选的两亲接枝共聚物是由巴斯夫公司(basf)供应的sokalan hp22。适
合的聚合物包括随机接枝共聚物，优选聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，具有聚环氧乙烷主链和多重聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量优选是6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比是40比60，并且每50个环氧乙烷单位有不多于1个接枝点。
[0372]
羧酸酯聚合物-本发明的组合物还可以包括一种或多种羧酸酯聚合物，例如马来酸酯/丙烯酸酯随机共聚物或聚丙烯酸酯均聚物。在一方面，羧酸酯聚合物是具有从4,000da至9,000da或从6,000da至9,000da的分子量的聚丙烯酸酯均聚物。
[0373]
去污聚合物-本发明的组合物还可以包括一种或多种去污聚合物，所述聚合物具有如由以下结构(i)、(ii)或(iii)之一所定义的结构：
[0374]
(i)-[(ochr
1-chr2)
a-o-oc-ar-co-]d[0375]
(ii)-[(ochr
3-chr4)
b-o-oc-sar-co-]e[0376]
(iii)-[(ochr
5-chr6)
c-or7]f[0377]
其中：
[0378]
a、b和c是从1至200；
[0379]
d、e和f是从1至50；
[0380]
ar是1,4-取代的亚苯基；
[0381]
sar是1,3-取代的亚苯基，所述亚苯基在5位上被sc3me取代；
[0382]
me是li、k、mg/2、ca/2、al/3、铵、单烷基铵、二烷基铵、三烷基铵或四烷基铵，其中烷基基团是c
1-c
18
烷基或c
2-c
10
羟基烷基，或其混合物；
[0383]
r1、r2、r3、r4、r5和r6独立地选自h或c
1-c
18
正烷基或异烷基；并且r7是直链或支链的c
1-c
18
烷基，或直链或支链的c
2-c
30
烯基，或具有5至9个碳原子的环烷基，或c
8-c
30
芳基，或c
6-c
30
芳基烷基。
[0384]
适合的去污聚合物是聚酯去污聚合物，例如repel-o-tex聚合物，包括repel-o-tex、sf-2和srp6，由罗地亚(rhodia)供应。其他适合的去污聚合物包括texcare聚合物，包括texcare sra100、sra300、srn100、srn170、srn240、srn300和srn325，由科莱恩(clariant)供应。其他适合的去污聚合物是marloquest聚合物，例如marloquest sl，由萨索尔公司(sasol)供应。
[0385]
纤维素聚合物-本发明的组合物还可以包含一种或多种纤维素聚合物，包括选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧基烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素的那些。在一方面，纤维素聚合物选自包含以下的组：羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素及其混合物。在一方面，该羧甲基纤维素具有从0.5至0.9的羧甲基取代度以及从100,000da至300,000da的分子量。
[0386]
酶-组合物可以包含提供清洁性能和/或织物护理益处的一种或多种酶。适合的酶的实例包括但不限于半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、聚戊糖酶、马拉纳酶(malanase)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、叶绿素酶、淀粉酶(包括α-淀粉酶)、磷酸二酯酶(pde)、优选地dna酶和/或rna酶、或其混合物。典型的组合是酶混合物，可以包含例如蛋白酶和脂肪酶连同淀粉酶。当存在于组合物中时，前述另外的酶可以按组合物的重量计以从0.00001wt％至2wt％、从0.0001wt％至1wt％或从0.001wt％至0.5wt％酶蛋白的水平存在。
98/20115、wo 98/20116、wo 99/011768、wo 01/44452、wo 03/006602、wo 04/03186、wo 04/041979、wo 07/006305、wo 11/036263、wo 11/036264，尤其是在以下位置中的一个或多个处具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用bpn’进行编号。更优选地，枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：s3t、v4i、s9r、a15t、k27r、*36d、v68a、n76d、n87s,r、*97e、a98s、s99g,d,a、s99ad、s101g,m,r s103a、v104i,y,n、s106a、g118v,r、h120d,n、n123s、s128l、p129q、s130a、g160d、y167a、r170s、a194p、g195e、v199m、v205i、l217d、n218d、m222s、a232v、k235l、q236h、q245r、n252k、t274a(使用bpn’进行编号)。
[0397]
适合的可商购蛋白酶包括以商品名duralase
tm
、durazyrn
tm
、ultra、ultra、ultra、ultra、ultra、ultra、以及出售的那些，所有这些能以或(诺维信公司(novozymes a/s))出售；以下列商品名出售的那些：purafectpreferenz
tm
、purafectpurafectpurafectpurafecteffectenz
tm
、、以及(丹尼斯克/杜邦公司(danisco/dupont))、axapem
tm
(吉斯特布罗卡德斯公司(gist-brocases n.v.))、blap(序列示于us 5352604的图29中)及其变体(汉高股份(henkel ag))以及来自花王株式会社(kao)的kap(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。
[0398]
在一方面，优选的酶将包括淀粉酶。适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如gb1296839中更详细描述的地衣芽孢杆菌特定菌株的α-淀粉酶。
[0399]
适合的淀粉酶包括具有wo 95/10603中的seq id no:3的淀粉酶或其与seq id no:3具有90％序列同一性的变体。优选变体描述于wo 94/02597、wo 94/18314、wo 97/43424以及wo 99/019467的seq id no:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。
[0400]
不同的适合的淀粉酶包括具有wo 02/010355中的seq id no:6的淀粉酶或其与seq id no:6具有90％序列同一性的变体。wo 02/010355中的seq id no:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
[0401]
其他适合的淀粉酶是包含示于wo 2006/066594的seq id no:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于wo 2006/066594的seq id no:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。此杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：g48、t49、g107、
no:12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在wo 01/66712中的seq id no:12中的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：r28、r118、n174；r181、g182、d183、g184、g186、w189、n195、m202、y298、n299、k302、s303、n306、r310、n314；r320、h324、e345、y396、r400、w439、r444、n445、k446、q449、r458、n471、n484。特别优选的淀粉酶包括具有d183和g184的缺失并且具有取代r118k、n195f、r320k和r458k的变体，以及另外在一个或多个选自下组的位置中具有取代的变体：m9、g149、g182、g186、m202、t257、y295、n299、m323、e345和a339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。
[0414]
其他实例是淀粉酶变体，如在wo 2011/098531、wo 2013/001078和wo 2013/001087中描述的那些。
[0415]
可商购的淀粉酶是duramyl
tm
、termamyl
tm
、termamyl ultra
tm
、fungamyl
tm
、ban
tm
、stainzyme
tm
、stainzyme ultra
tm
、stainzyme plus
tm
、prime、supramyl
tm
、natalase
tm
、x和ban
tm
(来自诺维信公司(novozymes a/s))、at 9000百因美生物技术贸易有限公司(biozym biotech trading gmbh)(奥地利维也纳威利斯塔斯(wehlistrasse)27b a-1200维也纳，奥地利(wien austria)、和rapidase
tm
、purastar
tm
/effectenz
tm
、powerase、preferenz s100、preferenx s110、optisize ht以及purastar(丹尼斯克/杜邦公司(danisco/dupont))和(花王株式会社(kao))。
[0416]
在一方面，其他优选的酶包括微生物起源的展现出内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的内切葡聚糖酶(ec3.2.1.4)，包括对于芽孢杆菌属的成员而言内源的细菌多肽(所述多肽具有与us 7141403中的氨基酸序列seq id no:2至少90％、94％、97％或99％同一性的序列)以及其混合物。适合的内切葡聚糖酶是在商标名和(诺维信公司)下售卖的。
[0417]
其他优选的酶包括在商标名下售卖的果胶裂解酶，以及在商标名下售卖的甘露聚糖酶(诺维信公司)，以及(丹尼斯克/杜邦公司(danisco/dupont))。
[0418]
可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加含有所有这些酶的组合添加剂而将一种或多种洗涤剂酶包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂配制品为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。
[0419]
无粉尘颗粒可以例如us 4106991和us 4661452中所披露来制造，并且可以任选地通过本领域中已知的方法来包衣。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，peg)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中所述醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在gb 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据ep 238216中披露的方法来制备。
[0420]
染料转移抑制剂-本发明的组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺n-氧化物聚合物、n-乙烯吡咯烷酮与n-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于组合物中时，染料转移抑制剂可以按从0.0001wt％至10wt％、从0.01wt％至5wt％或从0.1wt％至3wt％的水平存在。
[0421]
增亮剂-本发明的组合物还可以包含可以给正在清洁的物品着色的另外的组分，例如荧光增亮剂。
[0422]
所述组合物可以包含具有以下结构的呈α-晶体形式的c.i.荧光增亮剂260：
[0423][0424]
在一方面，增亮剂是冷水可溶性增亮剂，如呈α-晶体形式的c.i.荧光增亮剂260。在一方面，增亮剂主要处于α-晶体形式，这意味着典型地至少50wt％、至少75wt％、至少90wt％、至少99wt％、或甚至基本上全部的c.i.荧光增亮剂260是处于α-晶体形式。
[0425]
增亮剂典型地是处于微粒化微粒形式，具有从3至30微米、从3微米至20微米、或从3至10微米的加权平均初级粒度。
[0426]
所述组合物可以包含呈β-晶体形式的c.i.荧光增亮剂260，并且(i)呈α-晶体形式的c.i.荧光增亮剂260与(ii)呈β-晶体形式的c.i.荧光增亮剂260的重量比可以是至少0.1或至少0.6。be 680847涉及用于制得呈α-晶体形式的c.i.荧光增亮剂260的方法。
[0427]
可以用于本发明中的商业光学增亮剂可以划分为多个亚组，所述亚组包括但不必限制于：二苯乙烯、吡唑啉、香豆素、羧酸、次甲基菁、二苯并噻吩-5,5-二氧化物、唑类、5元和6元环杂环的衍生物以及其他混杂剂。此类增亮剂的实例披露于“the production and application of fluorescent brightening agents”[荧光增亮剂的产生和应用],m.zahradnik,由纽约john wiley&sons[约翰威利父子公司]出版(1982)。可以用于本发明组合物的光学增亮剂的具体非限制性实例是在us 4790856和us 3646015中鉴定的那些。
[0428]
另外适合的增亮剂具有以下结构：
[0429]
[0430]
适合的荧光增亮剂水平包括从0.01wt％、从0.05wt％、从0.1wt％或从0.2wt％的较低水平至0.5wt％或0.75wt％的较高水平。
[0431]
在一方面，增亮剂可以装载在粘土上以形成颗粒。硅酸盐-本发明的组合物还可以含有硅酸盐，如硅酸钠或硅酸钾。所述组合物可以包含从0wt％至小于10wt％硅酸盐，至9wt％、或至8wt％、或至7wt％、或至6wt％、或至5wt％、或至4wt％、或至3wt％、或甚至至2wt％，并且从高于0wt％、或从0.5wt％、或从1wt％起的硅酸盐。适合的硅酸盐是硅酸钠。
[0432]
分散剂-本发明的组合物还可以含有分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。
[0433]
酶稳定剂-用于组合物中的酶可以通过各种技术来稳定。本文使用的酶可以通过钙和/或镁离子的水溶性来源的存在来稳定。常规稳定试剂的实例是例如多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、肽醛、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如wo 92/19709和wo 92/19708中所述来配制所述组合物。在包含蛋白酶的水性组合物的情况下，可以添加可逆蛋白酶抑制剂来进一步改善稳定性，所述可逆蛋白酶抑制剂例如是硼化合物，包括硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸、苯基硼酸及其衍生物；或化合物，例如甲酸钙、甲酸钠和1,2-丙二醇。肽醛可以具有式b
2-b
1-b
0-r，其中：r是氢、ch3、cx3、chx2或ch2x，其中x是卤素原子；b0是在对位处和/或在间位处具有oh取代基的苯丙氨酸残基；b1是单个氨基酸残基；并且b2由一个或多个氨基酸残基组成，任选地包含n-末端保护基团。优选的肽醛包括但不限于：z-ray-h、ac-gay-h、z-gay-h、z-gal-h、z-gaf-h、z-gav-h、z-rvy-h、z-lvy-h、ac-lgay-h、ac-fgay-h、ac-ygay-h、ac-fgvy-h或ac-wlvy-h，其中z是苄氧基羰基，而ac是乙酰基。
[0434]
溶剂-适合的溶剂包括水和其他溶剂，例如亲脂性流体。适合的亲脂性流体的实例包括硅氧烷、其他硅酮、烃、乙二醇醚、甘油衍生物(例如甘油醚)、全氟化的胺、全氟化的和氢氟醚溶剂、低挥发性非氟化的有机溶剂、二醇溶剂、其他环境友好型溶剂及其混合物。
[0435]
结构化剂/增稠剂-结构化液体可以从内部结构化，由此结构由初级成分(例如，表面活性剂材料)形成，和/或通过使用次级成分(例如，聚合物、粘土和/或硅酸盐材料)提供三维基质结构而从外部结构化。所述组合物可以包含从0.01wt％至5wt％、或从0.1wt％至2.0wt％的结构化剂。所述结构化剂典型地选自由以下组成的组：甘油二酯和甘油三酯、硬脂酸乙二醇双酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、微纤维纤维素、疏水修饰的碱性可膨胀的乳液(例如polygel w30(3v西格玛(sigma)))、生物聚合物，黄原胶、吉兰糖胶及其混合物。适合的结构化剂包括氢化的蓖麻油及其非乙氧基化的衍生物。适合的结构化剂披露于us 6855680中。此类结构化剂具有螺纹样结构化系统，所述系统具有一定范围的纵横比。其他适合的结构化剂和用于制得它们的方法描述于wo 10/034736中。
[0436]
调节剂-本发明的组合物可以包括高熔点脂肪化合物。本文有用的高熔点脂肪化合物具有25℃或更高的熔点，并且选自由以下组成的组：脂肪醇、脂肪酸、脂肪醇衍生物、脂肪酸衍生物及其混合物。此类具有低熔点的化合物并非旨在被包括在此部分中。高熔点化合物的非限制性实例发现于international cosmetic ingredient dictionary[国际化妆品成分词典]，第五版，1993，以及ctfa cosmetic ingredient handbook[ctfa化妆品成分手册]，第二版，1992中。
[0437]
鉴于提供改善的调节益处(如在施加至湿发的过程中的湿滑感、柔软度以及对干
发的保湿感)，高熔点脂肪化合物以从0.1wt％至40wt％、从1wt％至30wt％、从1.5wt％至16wt％、从1.5wt％至8wt％的水平包括在所述组合物中。
[0438]
本发明的组合物可以含有阳离子聚合物。在组合物中阳离子聚合物的浓度典型地范围为从0.05wt％至3wt％、从0.075wt％至2.0wt％、或从0.1wt％至1.0wt％。在预期使用组合物的ph下，适合的阳离子聚合物将具有至少0.5meq/gm、至少0.9meq/gm、至少1.2meq/gm、至少1.5meq/gm、或小于7meq/gm、以及小于5meq/gm的阳离子电荷密度，ph的范围将大体上是从ph 3至ph 9、或在ph 4与ph 8之间。本文，聚合物的“阳离子电荷密度”是指聚合物上的正电荷数目与聚合物的分子量之比。此类适合的阳离子聚合物的平均分子量将大体上是在10,000与10,000,000之间、在50,000与5,000,000之间或在100,000与3,000,000之间。
[0439]
用于在本发明的组合物中使用的适合的阳离子聚合物含有阳离子含氮部分，如季铵或阳离子质子化的氨基部分。可以将任何阴离子反离子与阳离子聚合物关联使用，只要聚合物保持溶解于水中、组合物中、或组合物的凝聚相中，并且只要反离子在物理和化学上与组合物的主要成分相容或以另外的方式不会不适当地损害组合物性能、稳定性或美感。此类反离子的非限制性实例包括卤化物(例如，氯化物、氟化物、溴化物、碘化物)、硫酸盐和甲基硫酸盐。
[0440]
此类聚合物的非限制性实例描述于ctfa cosmetic ingredient dictionary[ctfa化妆品成分词典]，第3版，由estrin、crosley、和haynes编著(the cosmetic,toiletry,and fragrance association,inc.[化妆品、化妆用具以及香水联合公司]，washington,d.c.[华盛顿特区](1982))。
[0441]
用于在所述组合物中使用的其他适合的阳离子聚合物包括多糖聚合物，阳离子瓜尔胶衍生物，含四价氮的纤维素醚，合成聚合物，醚化纤维素、瓜尔胶和淀粉的共聚物。当使用的时候，本文的阳离子聚合物可溶解于组合物中或可溶解于组合物中的复合凝聚相中，所述凝聚相是由上文所述的阳离子聚合物和阴离子、两性和/或兼性离子表面活性剂组分形成。阳离子聚合物的复合凝聚物还可以与组合物中其他带电荷的材料形成。适合的阳离子聚合物描述于us 3962418；us 3958581；和us 2007/0207109中。
[0442]
本发明的组合物可以包含作为调节剂的非离子聚合物。具有大于1000的分子量的聚亚烷基乙二醇(polyalkylene glycol)在本文是有用的。具有以下通式的那些是有用的：
[0443][0444]
其中r
95
选自由以下组成的组：h、甲基及其混合物。调节剂，并且特别是硅酮，可以被包括在组合物中。用于本发明的组合物中的调节剂典型地包含形成乳化液体颗粒的水不溶性、水分散性、非挥发性的液体。用于在所述组合物中使用的适合的调节剂是通常表征为以下的那些调节剂：硅酮(例如，硅酮油、阳离子硅酮、硅酮胶、高折射性硅酮、以及硅酮树脂)、有机调节油(例如，烃油、聚烯烃、以及脂肪酯)或其组合，或者以另外方式于本文的水性表面活性剂基质中形成液体分散颗粒的那些调节剂。此类调节剂应该在物理和化学上是与组合物的主要组分相容的，并且不应该以另外的方式不适当地损害组合物稳定性、美感或性能。
[0445]
在组合物中调节剂的浓度应该足以提供所希望的调节益处。这种浓度可以随着调节剂、所希望的调节性能、调节剂颗粒的平均大小、其他组分的类型和浓度以及其他类似因
素而变化。
[0446]
硅酮调节剂的浓度范围典型地是从0.01wt％至10wt％。适合的硅酮调节剂以及对于硅酮的任选的悬浮剂的非限制性实例描述于美国再公告专利号34,584；us 5104646；us 5106609；us 4152416；us 2826551；us 3964500；us 4364837；us 6607717；us 6482969；us 5807956；us 5981681；us 6207782；us 7465439；us 7041767；us 7217777；us 2007/0286837 a1；us 2005/0048549 a1；us 2007/0041929 a1；gb 849433；de 10036533，将所有文献通过引用并入本文；chemistry and technology of silicones[硅酮的化学与技术]，纽约：academic press[学术出版社](1968)；通用电气硅酮橡胶产品数据列表se 30、se 33、se 54和se 76；硅酮化合物，彼特拉克系统公司(petrarch systems,inc.)(1984)；以及encyclopedia of polymer science and engineering[聚合物科学与工程化百科全书],第15卷,第2版,第204-308页john wiley&sons,inc.[约翰威利父子公司](1989)中。
[0447]
本发明的组合物还可以包含从0.05wt％至3wt％的至少一种有机调节油作为调节剂，单独或与其他调节剂例如(本文所述的)硅酮组合。适合的调节油包括烃油、聚烯烃、以及脂肪酯。还适合用于本文的组合物中的是在us 5674478和us 5750122或在us 4529586；us4507280；us 4663158；us 4197865；us 4217914；us 4381919；以及us 4422853中所述的调节剂。
[0448]
卫生与恶臭味-本发明的组合物还可以包含蓖麻酸锌、百里酚、季铵盐(如)、聚乙烯亚胺(例如来自巴斯夫公司(basf)的)及其锌络合物、银和银化合物(尤其是被设计为缓慢释放ag
或纳米银分散体的那些)中的一种或多种。
[0449]
益生素-组合物可以包含益生素，如wo 09/043709中所述的那些。
[0450]
增泡剂-如果高的起泡是希望的，增泡剂(例如c
10-c
16
烷醇酰胺或c
10-c
14
烷基硫酸酯)可以典型地以1wt％至10wt％的水平掺入组合物中。c
10-c
14
单乙醇和二乙醇酰胺阐述了此类增泡剂的典型的类别。此类增泡剂与高的起泡辅助表面活性剂(如，以上提及的氧化胺、甜菜碱、以及磺基甜菜碱(sultaine))一起使用也是有利的。如果希望的话，水溶性镁和/或钙盐(例如mgcl2、mgso4、cacl2、caso4等)可以典型地以0.1wt％至2wt％的水平添加，以提供另外的泡沫并且以增强油脂去除性能。
[0451]
泡沫抑制剂-用于减少或抑制泡沫形成的化合物可以掺入本发明的组合物中。泡沫抑制在如在us 4489455和us 4489574中描述的所谓“高浓度清洁工艺”中以及在前载式(front-loading-style)洗涤机中可能是特别重要的。多种多样的材料可以用作泡沫抑制剂，并且泡沫抑制剂对于本领域的技术人员而言是熟知的。参见，例如kirk othmer encyclopedia of chemical technology[柯克
·
奥思默化工百科全书]，第三版，第7卷，第430-447页(john wiley&sons,inc.[约翰威利父子公司]，1979)。泡沫抑制剂的实例包括单羧基脂肪酸以及其中的可溶盐，高分子量烃例如石蜡，脂肪酸酯(例如，脂肪酸甘油三酯)，单价醇的脂肪酸酯，脂肪族c
18-c
40
酮(例如，硬脂酮)，n-烷基化的氨基三嗪，优选具有约100℃之下的熔点的蜡烃，硅酮泡沫抑制剂，以及二级醇。泡沫抑制剂描述于us 2954347；us 4265779；us 4265779；us 3455839；us 3933672；us 4652392；us 4978471；us 4983316；us 5288431；us 4639489；us 4749740；us 4798679；us 4075118；ep 89307851.9；ep 150872；和dos 2,124,526中。
[0452]
对于有待用于自动洗衣机中的任何洗涤剂组合物，泡沫不应该形成到它们溢出洗
涤机的程度。当使用时，泡沫抑制剂优选以“泡沫抑制量”存在。“泡沫抑制量”意指组合物的配制者可以选择这种泡沫控制剂的量，这个量将充分地控制泡沫以导致用于自动洗衣机中的低起泡衣物洗涤剂。
[0453]
在此的组合物将通常包含从0wt％至10wt％的泡沫抑制剂。当用作泡沫抑制剂时，单羧基脂肪酸以及其中的盐将典型地以高达5wt％的量存在。优选地，使用从0.5wt％至3wt％的脂肪单羧酸酯泡沫抑制剂。典型地以高至2.0wt％的量使用硅酮泡沫抑制剂，虽然可以使用更高的量。通常以从0.1wt％至2wt％的范围的量使用单硬脂酰磷酸酯泡沫抑制剂。典型地以从0.01wt％至5.0wt％的范围的量使用烃泡沫抑制剂，虽然可以使用更高的水平。典型地以0.2wt％至3wt％使用醇泡沫抑制剂。
[0454]
本文的组合物可以在宽范围的ph内具有清洁活性。在某些实施例中，所述组合物具有从ph4至ph11.5的清洁活性。在其他实施例中，所述组合物从ph6至ph11、从ph7至ph11、从ph8至ph11、从ph9至ph11或从ph10至ph11.5具有活性。
[0455]
本文的组合物可以在宽范围的温度(例如从10℃或更低至90℃)内具有清洁活性。优选地，该温度将是低于50℃或40℃或甚至30℃。在某些实施例中，对于这些组合物来说的最适温度范围是从10℃至20℃、从15℃至25℃、从15℃至30℃、从20℃至30℃、从25℃至35℃、从30℃至40℃、从35℃至45℃或从40℃至50℃。
[0456]
组合物的形式
[0457]
本文所述的组合物被有利地用在例如洗衣应用、硬表面清洁、餐具洗涤应用、连同化妆品应用(如义齿、牙齿、头发和皮肤)中。本发明的组合物具体是固体或液体清洁和/或处理组合物。在一方面，本发明涉及一种组合物，其中所述组合物的形式选自由以下组成的组：规则的、压缩的或浓缩的液体；凝胶；膏；皂条；规则的或压缩的粉末；颗粒状固体；具有两个或更多个层(相同或不同相)的均匀或多层片剂；具有一个或多个室的袋；单个或多个室单位剂型；或其任何组合。
[0458]
所述组合物的形式可以将多个室(例如像可水溶的袋)中或片剂的不同层中的组分物理地彼此分离。因此，可以避免组分间的不良的储存相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
[0459]
袋可以被配置为单一室或多室。它可以具有合适用于容持所述组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许所述组合物从袋中释放出来。所述袋由水溶性膜制成，它包含了一个内部体积。可以将所述内部体积分成袋的室。优选的膜是聚合物材料，优选地形成膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(hpmc)。优选地，聚合物在膜例如pva中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，所述共混组合物包含可水解降解并且可水溶的聚合物共混物，如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考号m8630下，如由美国印第安纳州的monosol有限责任公司(monosol llc)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。所述袋可以包含固体洗衣清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与含有固体的室不同(us 2009/0011970 a1)。
[0460]
水溶性膜-本发明的组合物还可以被包封于水溶性膜之内。优选地，优选的膜材料是聚合物材料。膜材料可以是例如通过聚合物材料的铸造、吹塑、挤出或吹胀挤塑来获得，如本领域中已知的。适合用于用作袋材料的优选的聚合物、共聚物或其衍生物是选自：聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧烷、丙烯酰胺、丙烯酸、纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺、聚乙烯乙酸酯、聚羧酸和盐、聚氨基酸或肽、聚酰胺、聚丙烯酰胺、马来酸/丙烯酸的共聚物、多糖(包括淀粉和明胶)、天然胶(例如黄原胶和卡拉胶(carragum))。更优选的聚合物选自聚丙烯酸酯和水溶性丙烯酸脂共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，并且最优选地选自聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物和羟丙基甲基纤维素(hpmc)、及其组合。优选地，聚合物在袋材料(例如，pva聚合物)中的水平是至少60wt％。聚合物可以具有任何重均分子量，优选是从约1.000至1.000.000、从约10.000至300.000、从约20.000至150.000。聚合物的混合物还可以用作袋材料。
[0461]
天然地，不同的膜材料和/或不同厚度的膜可以用于制作本发明的室。在选择不同的膜中的益处是所得的室可以展现不同溶解度或释放特征。
[0462]
优选的膜材料是在monosol商标名称m8630、m8900、h8779下已知的pva膜，以及描述于us 6166117和us 6787512中的那些，以及具有相应溶解度和变形特征的pva膜。
[0463]
本文的膜材料还可以包括一种或多种添加剂成分。例如，可以有益的是添加增塑剂，例如甘油、乙二醇、二乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。其他添加剂包括有待被递送至洗涤用水的功能性洗涤剂添加剂，例如有机聚合物分散剂等。
[0464]
制造组合物的方法
[0465]
可以将本发明的组合物配制为任何适合的形式，并且可通过被配制者所选择的任何方法来制备，所述方法的非限制性实例描述于申请人的实例中以及us 4990280；us 20030087791 a1；us 20030087790 a1；us 20050003983 a1；us 20040048764 a1；us 4762636；us 6291412；us 20050227891 a1；ep 1070115 a2；us 5879584；us 5691297；us 5574005；us 5569645；us 5565422；us 5516448；us 5489392；us 5486303中，将所有文献通过引用并入本文。本发明的组合物或根据本发明制备的组合物包括清洁和/或处理组合物，包括但不限于用于在织物和家居护理领域中处理织物、硬表面和任何其他表面的组合物，包括：空气护理(包括空气清新剂和气味递送系统)、汽车护理、餐具洗涤、织物调节(包括软化和/或清新)、洗衣去垢、洗衣和漂洗添加剂和/或护理、硬表面清洁和/或处理(包括地板和马桶清洁剂)、颗粒或粉末形式通用型或“重垢”洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或膏状形式通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体类型；液体精细织物洗涤剂；手动餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机器餐具洗涤剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型：汽车或地毯香波，浴室清洁剂(包括马桶清洁剂)；以及清洁辅助剂，例如漂白添加剂以及“去污棒”或预处理类型、装载底物的组合物(例如添加干燥剂的片层)。优选的是用于清洁和/或处理纺织品和/或硬表面(最优选为纺织品)的组合物和方法。组合物优选地是在洗涤过程的预处理步骤中或主要洗涤步骤中(最优选用于纺织品洗涤步骤)使用的组合物。
[0466]
如本文使用的，术语“织物和/或硬表面清洁和/或处理组合物”是清洁和处理组合物的子集，除非另外指出，所述子集包括颗粒或粉末形式通用型或“重垢”洗涤剂，尤其是清
洁洗涤剂；液体、凝胶或膏状形式通用型洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体类型；液体精细织物洗涤剂；手动餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机器餐具洗涤剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，汽车或地毯香波，浴室清洁剂(包括马桶清洁剂)；织物调节组合物(包括软化和/或清新)，可以呈液体、固体和/或干燥剂片层形式；以及清洁辅助剂，例如漂白添加剂以及“去污棒”或预处理类型、装载底物的组合物(例如添加干燥剂的片层)。所有的可应用的此类组合物可以呈标准的、浓缩的或甚至高度浓缩的形式，甚至到此类组合物可以在某些方面呈非水性的程度。
[0467]
使用方法
[0468]
本发明包括在织物和/或家居护理领域中用于清洁任何表面(包括处理纺织品或硬表面或其他表面)的方法。考虑了如所述的清洁可以处于小规模(例如家庭家务(family house hold))连同大规模(如处于例如工业和专业设置)两者。在本发明的一个方面，该方法包括在洗涤过程的预处理步骤或主要洗涤步骤(最优选用于在纺织品洗涤步骤中使用或可替代地用于在餐具洗涤(包括手动以及自动/机械餐具洗涤两者)中使用)中接触有待处理的表面的步骤。在本发明的一个实施例中，将脂肪酶变体和其他组分顺序地添加至用于清洁和/或处理表面的方法中。可替代地，同时地添加脂肪酶变体和其他组分。
[0469]
如本文使用的，洗涤包括但不限于擦洗和机械搅拌。洗涤可以用泡沫组合物进行(如wo 08/101958中所述的)，和/或通过施加交变压力(压力/真空)作为擦洗和机械搅拌的附加方法或替代方案来进行。对此类表面或织物进行干燥可以通过在家庭或工业环境中采用的通用手段中的任一种来完成。本发明的清洁组合物理想地适用于在洗衣以及餐具洗涤应用中使用。相应地，本发明包括用于清洁物体(包括但不限于织物、餐具、刀具以及厨具)的方法。所述方法包括使有待清洁的物体与所述清洁组合物接触的步骤，所述清洁组合物包含申请人的清洁组合物、清洁添加剂或其混合物中的至少一个实施例。织物可以包括能够在常规消费者或公共机构使用条件下被洗涤的大多数任何织物。所述溶液可以具有从8至10.5的ph。可以在溶液中以从500ppm至15.000ppm的浓度使用该组合物。水温范围典型地是从5℃至90℃。水与织物之比典型地是从1:1至30:1。
[0470]
在一方面，本发明涉及使用本发明的脂肪酶变体用于产生本发明的组合物的方法。在一方面，本发明涉及组合物用于清洁物体的用途。
[0471]
在一方面，本发明涉及产生组合物的方法，所述方法包括添加本发明的脂肪酶变体和表面活性剂。在一方面，本发明涉及用于清洁表面的方法，所述方法包括使待清洁的表面上存在的脂质污渍与所述清洁组合物接触。在一方面，本发明涉及用于水解存在于表面上的污垢和/或污渍中的脂质的方法，所述方法包括使污垢和/或污渍与清洁组合物接触。在一方面，本发明涉及所述组合物在羧酸酯水解中的用途。在一方面，本发明涉及所述组合物在酯的水解、合成或酯交换中的用途。在一方面，本发明涉及所述组合物用于制造稳定配制品的用途。
[0472]
一种或多种酶
[0473]
在一个实施例中，本发明的组合物可以进一步包含选自由以下组成的组的酶：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶、磷酸二酯酶(pde)、优选地dna酶和/或rna酶、漆酶、过氧化物酶、卤代过氧化物酶、过水解酶及其组合。
[0474]
所述一种或多种酶可以包括适合于包含在洗衣或餐具洗涤剂(洗涤剂酶)中的一种或多种酶，例如，蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶)、脂肪酶、角质酶、淀粉酶(特别是α-淀粉酶)、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木聚糖酶、pde、优选地dna酶和/或rna酶、过水解酶、氧化还原酶(例如，漆酶、过氧化物酶、过氧合酶和/或卤代过氧化物酶)。优选的洗涤剂酶是蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶)、脂肪酶、淀粉酶、裂解酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、pde、优选地dna酶和/或rna酶、过水解酶、和氧化还原酶(例如，漆酶、过氧化物酶、过氧合酶和/或卤代过氧化物酶)；或其组合。更优选的洗涤剂酶为蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶)、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、pde和甘露聚糖酶；或其组合。
[0475]
所述组合物可以包括多于0.1％(w/w)的活性酶蛋白(特别是本发明的脂肪酶变体)；优选地多于0.25％、更优选地多于0.5％、更优选地多于1％、更优选地多于2.5％、优选地多于5％、更优选地多于7.5％、更优选地多于10％、更优选地多于12.5％、更优选地多于15％、甚至更优选地多于20％、并且最优选地多于25％(w/w)的活性酶蛋白。
[0476]
蛋白酶：用于在本发明中使用的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶、金属蛋白酶和/或胰蛋白酶样蛋白酶。优选地，所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶；更优选地，所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。
[0477]
丝氨酸蛋白酶是催化肽键水解并且在活性位点处存在一个必需丝氨酸残基的酶(white,handler和smith,1973“principles of biochemistry[生物化学原理],”第五版,麦格劳-希尔图书公司(mcgraw-hill book company),纽约，第271-272页)。枯草杆菌蛋白酶包括i-s1和i-s2亚组，优选地由其构成，如siezen等人,protein engng.[蛋白质工程]4(1991)719-737；和siezen等人,protein science 6(1997)501-523[蛋白质科学]所定义。由于丝氨酸蛋白酶的活性位点的结构高度保守，根据本发明的枯草杆菌蛋白酶可以在功能上相当于由siezen等人(同上)提出的指定亚组的枯草杆菌酶(subtilase)。
[0478]
枯草杆菌蛋白酶可以是动物、植物或微生物来源的，包括化学或基因修饰的突变体(蛋白工程化的变体)，优选为碱性微生物枯草杆菌蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶novo、枯草杆菌蛋白酶carlsberg、枯草杆菌蛋白酶bpn’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(描述于wo 89/06279中)以及蛋白酶pd138(wo 93/18140)。实例描述于wo 98/020115、wo 01/44452、wo 01/58275、wo 01/58276、wo 03/006602以及wo 04/099401中。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)以及在wo 89/06270和wo 94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。其他实例是描述于wo 92/19729、wo 88/08028、wo 98/20115、wo 98/20116、wo 98/34946、wo 2000/037599、wo 2011/036263中的变体，尤其是在以下一个或多个位置具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。
[0479]
金属蛋白酶可以是动物、植物或微生物来源的，包括化学或基因修饰的突变体(蛋白质工程化变体)，优选为碱性微生物金属蛋白酶。实例描述于wo 2007/044993、wo 2012/110562及wo 2008/134343中。
[0480]
可商购的枯草杆菌蛋白酶的实例包括kannase
tm
、everlase
tm
、relase
tm
、esperase
tm
、alcalase
tm
、durazym
tm
、savinase
tm
、ovozyme
tm
、liquanase
tm
、coronasetm、
360)、嗜热脂肪芽杆菌(jp 64/744992)或短小芽孢杆菌(wo 91/16422)。
[0488]
其他实例是例如在wo 92/05249、wo 94/01541、ep 407 225、ep 260 105、wo 95/35381、wo 96/00292、wo 95/30744、wo 94/25578、wo 95/14783、wo 95/22615、wo 97/04079、wo 97/07202、wo 00/060063、wo 2007/087508以及wo 2009/109500中所描述的那些脂肪酶变体。
[0489]
其他可商购的脂肪酶包括lipolase
tm
、lipolase ultra
tm
、和lipex
tm
；lipex
tm
evity、lecitase
tm
、lipolex
tm
；lipoclean
tm
，lipoprime
tm
(诺维信公司)。其他可商购的脂肪酶包括lumafast(杜邦公司)；lipomax(杜邦公司)和来自索尔维公司(solvay)的芽孢杆菌属物种脂肪酶。
[0490]
淀粉酶：适当的淀粉酶(α-和/或β-淀粉酶)包含来源于细菌或真菌的淀粉酶。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属、例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于gb 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。
[0491]
合适的α-淀粉酶的实例包括具有wo 95/10603中的seq id no:2的淀粉酶或其与seq id no:3具有90％序列同一性的变体。优选的变体描述于wo 94/02597、wo 94/18314、wo 97/43424中以及wo 99/019467的seq id no:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。
[0492]
不同的合适的α-淀粉酶包括具有wo 02/010355中的seq id no:6的淀粉酶或其与seq id no:6具有90％序列同一性的变体。seq id no:6的优选的变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
[0493]
其他适合的α-淀粉酶是包括wo 2006/066594的seq id no:6中所示的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于wo 2006/066594的seq id no:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。此杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：g48、t49、g107、h156、a181、n190、m197、i201、a209和q264。包含wo 2006/066594的seq id no:6中所示的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和seq id no:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选的变体是具有以下取代的那些：
[0494]
m197t；
[0495]
h156y a181t n190f a209v q264s；或
[0496]
g48a t49i g107a h156y a181t n190f i201f a209v q264s。
[0497]
另外的合适的淀粉酶是具有wo 99/019467中的seq id no:6的淀粉酶或其与seq id no:6具有90％序列同一性的变体。seq id no:6的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：r181、g182、h183、g184、n195、i206、e212、e216和k269。特别优选的淀粉酶是在位置r181和g182、或位置h183和g184中具有缺失的那些。
[0498]
可以使用的额外的淀粉酶是具有wo 96/023873的seq id no:1、seq id no:3、seq id no:2或seq id no:7的那些淀粉酶，或与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7具有90％序列同一性的其变体。seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:7的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在位置181和
182或位置183和184处具有缺失的那些。seq id no:1、seq id no:2或seq id no:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个中具有取代的那些。
[0499]
可以使用的其他淀粉酶是具有wo 08/153815的seq id no:2、wo 01/66712中的seq id no:10的淀粉酶或其与wo 08/153815的seq id no:2具有90％序列同一性或与wo 01/66712中的seq id no:10具有90％序列同一性的变体。wo 01/66712中的seq id no:10的优选的变体是在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211和264。
[0500]
另外的合适的淀粉酶是具有wo 09/061380的seq id no:2的淀粉酶或其与seq id no:2具有90％序列同一性的变体。seq id no:2的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有c-末端截短和/或取代、缺失或插入的那些：q87、q98、s125、n128、t131、t165、k178、r180、s181、t182、g183、m201、f202、n225、s243、n272、n282、y305、r309、d319、q320、q359、k444和g475。seq id no:2的更优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代的那些：q87e,r、q98r、s125a、n128c、t131i、t165i、k178l、t182g、m201l、f202y、n225e,r、n272e,r、s243q,a,e,d、y305r、r309a、q320r、q359e、k444e、以及g475k，和/或在位置r180和/或s181或t182和/或g183中具有缺失的那些。seq id no:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
[0501]
n128c k178l t182g y305r g475k；
[0502]
n128c k178l t182g f202y y305r d319t g475k；
[0503]
s125a n128c k178l t182g y305r g475k；或
[0504]
s125a n128c t131i t165i k178l t182g y305r g475k，其中所述变体是c-末端截短的，并且任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。
[0505]
其他适合的淀粉酶是具有wo 01/66712中的seq id no:12的α-淀粉酶或与seq id no:12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在wo 01/66712中的seq id no:12中的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：r28、r118、n174；r181、g182、d183、g184、g186、w189、n195、m202、y298、n299、k302、s303、n306、r310、n314；r320、h324、e345、y396、r400、w439、r444、n445、k446、q449、r458、n471、n484。特别优选的淀粉酶包括具有d183和g184的缺失并且具有取代r118k、n195f、r320k和r458k的变体，以及另外在一个或多个选自下组的位置中具有取代的变体：m9、g149、g182、g186、m202、t257、y295、n299、m323、e345和a339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。
[0506]
其他实例是淀粉酶变体，如在wo 2011/098531、wo 2013/001078和wo 2013/001087中描述的那些。
[0507]
可商购的淀粉酶是stainzyme
tm
；stainzyme
tm
plus；stainzyme
tm
ultra、duramyl
tm
、termamyl
tm
、termamyl ultra；natalase、fungamyl
tm
和ban
tm
(诺维信公司)、rapidase
tm
和purastar
tm
/effectenz
tm
、powerase和preferenz s100(来自杜邦公司)。
[0508]
磷酸二酯酶(pde)是破坏磷酸二酯键的酶。通常，磷酸二酯酶是指环核苷酸磷酸二酯酶，其具有重大临床意义并在下文进行描述。然而，存在许多其他磷酸二酯酶家族，包括磷脂酶c和d、自毒素、鞘磷脂磷酸二酯酶、dna酶、rna酶和限制核酸内切酶(其均破坏了dna
或rna的磷酸二酯主链)、以及许多未充分表征的小分子磷酸二酯酶。
[0509]
脱氧核糖核酸酶(dna酶)：合适的脱氧核糖核酸酶(dna酶)是催化dna主链中的磷酸二酯键的水解裂解从而降解dna的任何酶。根据本发明，可获得自细菌的dna酶是优选的；特别地，可获得自芽孢杆菌属的dna酶是优选的；特别地，可获得自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dna酶是优选的。此类dna酶的实例描述于专利申请wo 2011/098579或pct/ep2013/075922中。
[0510]
核糖核酸酶(rna酶)：催化rna降解成较小组分的核酸酶。核糖核酸酶可以分为内切核糖核酸酶和外切核糖核酸酶。
[0511]
过水解酶：合适的过水解酶能够催化过水解反应，所述反应导致在过氧化物源(例如，过氧化氢)的存在下从羧酸酯(酰)底物产生过酸。虽然许多酶以低水平进行所述反应，过水解酶展现出高的过水解:水解比率(通常大于1)。适合的过水解酶可以是植物、细菌或真菌来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。
[0512]
有用的过水解酶的实例包括天然存在的分枝杆菌属过水解酶或其变体。示例性酶来源于耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)。这种酶，其酶特性、其结构及其变体描述于wo 2005/056782、wo 2008/063400、us 2008/145353以及us 2007167344中。
[0513]
氧化酶/过氧化物酶：合适的氧化酶和过氧化物酶(或氧化还原酶)包括各种糖氧化酶、漆酶、过氧化物酶以及卤代过氧化物酶。
[0514]
合适的过氧化物酶包括由国际生物化学与分子生物学联合会(iubmb)命名委员会陈述的酶分类ec 1.11.1.7包括的那些过氧化物酶，或来源于其中的展示出过氧化物酶活性的任何片段。
[0515]
合适的过氧化物酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自拟鬼伞属，例如来自灰盖拟鬼伞(c.cinerea)的过氧化物酶(ep 179,486)，及其变体，如在wo 93/24618、wo 95/10602以及wo 98/15257中所描述的那些。
[0516]
用于在本发明中使用的过氧化物酶还包括卤代过氧化物酶，例如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶以及展示出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。根据其对卤素离子的特异性将卤代过氧化物酶进行分类。氯过氧化物酶(e.c.1.11.1.10)催化从氯离子形成次氯酸盐。
[0517]
在一个实施例中，所述卤代过氧化物酶是氯过氧化物酶。优选地，所述卤代过氧化物酶是钒卤代过氧化物酶，即含钒酸盐的卤代过氧化物酶。在本发明的优选的方法中，将含钒酸盐的卤代过氧化物酶与氯离子来源组合。
[0518]
已从许多不同真菌，特别是从暗色丝孢菌(dematiaceous hyphomycete)真菌组中分离出了卤代过氧化物酶，如卡尔黑霉属(caldariomyces)(例如，煤卡尔黑霉(c.fumago))、链格孢属、弯孢属(例如，疣枝弯孢(c.verruculosa)和不等弯孢(c.inaequalis))、内脐蠕孢属、细基格孢属以及葡萄孢属。
[0519]
还已从细菌，如假单胞菌属(例如吡咯假单胞菌(p.pyrrocinia))和链霉菌属(例如，金色链霉菌(s.aureofaciens))中分离出了卤代过氧化物酶。
[0520]
在一个优选的实施例中，卤代过氧化物酶可来源于弯孢属物种，特别是疣枝弯孢(curvularia verruculosa)或不等弯孢，如描述于wo 95/27046中的不等弯孢cbs 102.42；
或描述于wo 97/04102中的疣枝弯孢cbs 147.63或疣枝弯孢cbs 444.70；或来源于如描述于wo 01/79459中的drechslera hartlebii、如描述于wo 01/79458中的盐沼小树状霉(dendryphiella salina)、如描述于wo 01/79461中的phaeotrichoconis crotalarie、或如描述于wo 01/79460中的geniculosporium属物种。
[0521]
根据本发明的氧化酶特别包括由酶分类ec 1.10.3.2囊括的任何漆酶或来源于其中的展示出漆酶活性的片段、或展示出类似活性的化合物，例如儿茶酚氧化酶(ec 1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(ec 1.10.3.4)或胆红素氧化酶(ec 1.3.3.5)。
[0522]
优选的漆酶是微生物来源的酶。所述酶可以来源于植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。
[0523]
来自真菌的合适的实例包括可来源于以下的菌株的漆酶：曲霉属(aspergillus)、脉孢菌属(neurospora)(例如，粗糙脉孢菌(n.crassa))、柄孢壳菌属(podospora)、葡萄孢属、金钱菌属(collybia)、层孔菌属(fomes)、香菇属(lentinus)、侧耳属(pleurotus)、栓菌属(trametes)(例如，长绒毛栓菌(t.villosa)和变色栓菌(t.versicolor))、丝核菌属(rhizoctonia)(例如，立枯丝核菌(r.solani))，拟鬼伞属(例如，灰盖拟鬼伞、毛头拟鬼伞(c.comatus)、弗瑞氏拟鬼伞(c.friesii)及褶纹鬼伞(c.plicatilis))、小脆柄菇属(psathyrella)(例如，白黄小脆柄菇(p.condelleana))、斑褶菇属(panaeolus)(例如，蝶形斑褶菇(p.papilionaceus))、毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)、柱顶孢霉属(schytalidium)(例如，嗜热柱顶孢霉(s.thermophilum))、多孔菌属(polyporus)(例如，匹斯特斯多孔菌(p.pinsitus))、射脉菌属(phlebia)(例如，射脉侧菌(p.radiata))(wo 92/01046)或革盖菌属(coriolus)(例如，毛革盖菌(c.hirsutus))(jp 2238885)。
[0524]
来自细菌的合适实例包括可来源于芽孢杆菌属的菌株的漆酶。
[0525]
优选的是来源于拟鬼伞属或毁丝霉属的漆酶；特别是来源于灰盖拟鬼伞的漆酶，如披露于wo 97/08325中；或来源于嗜热毁丝霉，如披露于wo 95/33836中。
[0526]
其他氧化酶的实例包括但不限于氨基酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、乳酸盐氧化酶、半乳糖氧化酶、多元醇氧化酶(例如，wo 2008/051491)、以及醛糖氧化酶。氧化酶及其对应的底物可以被用作过氧化氢生成酶系统，由此作为过氧化氢的一个来源。几种酶，如过氧化物酶、卤代过氧化物酶以及过水解酶需要一个过氧化氢的来源。通过研究ec 1.1.3._、ec 1.2.3._、ec 1.4.3._、以及ec 1.5.3._或类似类别(在国际生物化学协会下)，本领域的普通技术人员容易识别氧化酶和底物的此类组合的其他实例。
[0527]
酶稳定剂和/或流变改性剂
[0528]
所述组合物还可以含有如本领域中已知的酶稳定剂，例如，多元醇、聚合物、可逆性酶抑制剂、二价阳离子、酶底物、抗氧化剂等。水溶性稳定剂是优选的。
[0529]
可逆性蛋白酶抑制剂的实例是硼酸、肽醛及其衍生物以及高分子的蛋白型抑制剂(像basi/rasi抑制剂，参见wo 2009/095425)。金属蛋白酶抑制剂的一个实例描述于wo 2008/134343中。下面在“蛋白酶抑制剂”的标题下更加详细地描述了蛋白酶抑制剂。
[0530]
稳定化聚合物可以基于，例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇及其共聚物。稳定化多元醇可以是像甘油、山梨醇、丙二醇等的更小分子，但也可以是像聚乙二醇、多糖等的更大分子。
[0531]
稳定化二价阳离子ca2 、mg2 和zn2 在本领域中是熟知的。因此，在一个实施例
中，本发明的组合物包括ca2 、mg2 或zn2 离子的来源。优选地，ca2 、mg2 或zn2 离子的来源是ca2 、mg2 或zn2 的一种难溶性(缓慢溶解)盐。难溶性意味着在20℃下在纯水中的溶解度低于5g/l、2g/l、1g/l、0.5g/l、0.2g/l、0.1g/l、或0.05g/l。ca2 、mg2 或zn2 的优选的盐是碳酸钙、碳酸镁、碳酸锌、硫酸钙、亚硫酸钙、亚硫酸镁、亚硫酸锌、磷酸钙、磷酸氢钙、磷酸镁、磷酸锌、柠檬酸钙、柠檬酸镁、柠檬酸锌、草酸钙、草酸镁、草酸锌、酒石酸钙、酒石酸镁、或酒石酸锌。
[0532]
在大多情况下，通过添加它们的底物(例如，对于蛋白酶是蛋白，对于淀粉酶是淀粉)来稳定化这些酶。抗氧化剂或还原剂可以用于减少酶的氧化，例如硫代硫酸盐、抗坏血酸盐等。每克洗涤剂所需的这些稳定剂的净剂量相比于将这些稳定剂添加至所述连续的洗涤剂相要低得多，因为他们在内囊相中是浓缩的，并且在许多情况下在储存期间将不会扩散出去，或者取决于稳定剂的结构和分子量仅仅缓慢扩散出去。特别地，高分子量稳定剂(例如，高于1kda，或高于2kda更优选高于5kda)将给出改善的净效率。因此优选的是高分子量抑制剂、聚合物、多元醇、阳离子、酶底物和抗氧化剂。
[0533]
可以通过添加一种“牺牲剂”蛋白来保护所述酶。使酶不稳定的组分通过反应到蛋白上的氨基酸基团(例如，氨基)上由此可以与所添加的牺牲剂或牺牲蛋白反应。优选的是具有足够大分子量以停留在所述囊内部的牺牲剂蛋白。
[0534]
在以下编号的段落中描述了本发明：
[0535]
1.一种如seq id no:2所示的多肽的亲本脂肪酶的变体，其中：
[0536]
i)所述变体是具有脂肪酶活性的多肽；
[0537]
ii)所述变体是与如seq id no:2所示的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％、但小于100％序列同一性的多肽；
[0538]
iii)所述变体是由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与如seq id no:1所示的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列同一性；
[0539]
iv)所述变体是具有脂肪酶活性的ii)或iii)的多肽的片段；
[0540]
其中所述变体包含：
[0541]
(a)对应于以下的取代：
[0542]
d4a；i7d；k14e；t17s；g34d；r36e；r36m；r36v；r36q；s38d；s38e；g43d；g43h；n47d；n47e；n47g；n47h；q49t；q49v；l57s；d60g；d60v；g68i；e69m；e69t；k70d；k70h；k70q；a89y；v94d；v94l；n102m；g109r；q118s；k120a；k120d；k120e；k120n；k120m；k120g；k120p；k120q；k120s；k120v；a123e；k136g；h158e；h158q；h161d；h161e；a162s；n163e；n163h；i174a；p177g；p177i；p177k；p177l；a178i；a178l；a178t；a178v；n181k；n181l；n181t；n181w；y182w；v183m；i184v；g185a；g185i；g185k；g185r；g185t；g185w；g185y；k187g；k187l；p189a；p189l；p189m；p189n；p189q；p189r；p189t；p189v；p189w；i199t；i199v；e196m；s206g；s206v；a207n；l211c；r223a；r223e；r223g；r223h；r223k；r223n；r223q；s224t；i232p；232q；t234s；d235a；i248l；s252n；l260f；和/或
[0543]
(b)对应于以下的取代：
[0544]
n163e r223n；k70e s206g；r101v s206v；a15e k120q；d130r s206g；d130r s206v；t2s a15e；和/或
[0545]
(c)对应于以下的取代：
[0546]
r36v v183m r223n；n47h k70e s206g；n163e r223n s252n；n47d k120g r223n；g43d n47d k120g；k70e h195s s206g；k70e l156f s206g；a178y p189v r223n；r36e g43d n47d；k70d n163e s252n；n47d k120g n163e；k70e p189q s206g；r36t k70e s206g；r36i k70e s206g；q49t k70e s206g；g43d k70e s206g；r36k k70e s206g；k70e p189m s206g；k52a k70e s206g；r36m k70e s206g；r36e k70e s206g；r101v s206v r223s；r36v n47d k120g；k14a k70e s206g；d4c s206g n236c；k70e g185l s206g；r36y k70e s206g；r36l k70e s206g；k70e p189l s206g；r36a k70e s206g；r101v d130r s206g；d4c s206g n236c；d4c s206v n236c；r36f k70e s206g；k70e k120p s206g；和/或
[0547]
(d)对应于以下的取代：
[0548]
n163e g185h r223n s252n；n163e n181w r223n s252n；k70d n163e r223n s252n；d4c s206g n236c s252n；d4c s206g r223n n236c；a178y v183m p189v r223n；和/或
[0549]
(e)对应于以下的取代：
[0550]
d4c p189v s206g r223n n236c；d4c n163e s206g n236c s252n；d4c n163e s206g r223n n236c；d4c a178y s206g r223n n236c；d4c k108a d130r s206v n236c；和/或
[0551]
(f)对应于以下的取代：s1c a8c t17c l225r n230c l254c；s1c a8c t17c l225r n230c l254c；d4c n97d r101v d130r s206v n236c；和/或
[0552]
(g)对应于以下的取代：
[0553]
s1c a8c t17c i184n l225c n230c l254c；s1c a8c t17c y75f l225c n230c l254c；s1c a8c t17c q49l l225c n230c l254c；s1c a8c t17c y167f l225c n230c l254c；s1c a8c t17c y190f l225c n230c l254c；s1c a8c t17c q49i l225c n230c l254c；s1c a8c t17c l225c n230c f244n l254c；s1c a8c a15e t17c l225c n230c l254c；s1c a8c t17c a162s l225c n230c l254c；s1c a8c t17c v183s l225c n230c l254c；s1c a8c t17c i164l l225c n230c l254c；s1c a8c t17c y19f l225c n230c l254c；s1c a8c t17c e165s l225c n230c l254c；s1c a8c t17c q49s l225c n230c l254c；s1c a8c t17c k187n l225c n230c l254c；s1c a8c a15r t17c l225c n230c l254c；和/或
[0554]
(h)对应于以下的取代：
[0555]
r101v a131r a152s n176t s206g r223s f247v g255d；s1c d4n r6s a8c t17c l225c n230c l254c；r101v a131r a152s n176t s206g r223s f247v g255d；s1c a8c t17c k136n v138s l225c n230c l254c；a26c i32c a45v q49k n97d d130r h159k s224r；s1c a8c t17c k70e i184n l225c n230c l254cs1c a8c t17c v76i l225c n230c l254c；和/或
[0556]
(i)对应于以下的取代：
[0557]
s1c a8c t17c h159k h161n n163s l225c n230c l254c；s1c a8c t17c v76i
v138l i164l l225c n230c l254c；和/或
[0558]
(j)对应于以下的取代：
[0559]
s1c a8c t17c s38t v76i v138l i164l l225c n230c l254c；和/或
[0560]
(k)对应于以下的取代：
[0561]
a8c t17c r36n g43d q49t k70n k72s k120g s206v r223n l225c l254c；和/或
[0562]
(l)对应于以下的取代：
[0563]
a8c t17c r36v s38d g43d n47d q49n k70n k72s k120g t148v e165s n181w s206v r223h l225c l254c。
[0564]
2.如段落1所述的变体，其中与亲本脂肪酶相比，所述变体具有改善的洗涤性能。
[0565]
3.如段落1或2所述的变体，其中与如seq id no:2所示的亲本脂肪酶相比，所述变体具有改善的洗涤性能。
[0566]
4.如段落1-3中任一项所述的变体，其中当使用标准x洗涤剂在自动机械应力测定(amsa)中进行测试时，与seq id no:2的脂肪酶相比，所述脂肪酶变体的洗涤性能评分(wps)为“ ”，优选地“ ”，更优选地“ ”，甚至更优选地“ ”。
[0567]
5.如段落1-4中任一项所述的变体，其中所述亲本脂肪酶包含如seq id no:2所示的多肽序列或由其组成，或是与如seq id no:2所示的脂肪酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽。
[0568]
6.如段落1-5中任一项所述的变体，其中与seq id no:2相比，取代的数目是1-20个，例如1-15个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个。
[0569]
7.一种组合物，所述组合物包含如段落1-6中任一项所述的变体。
[0570]
8.如段落7所述的组合物，所述组合物进一步包含表面活性剂或表面活性剂系统，其中所述表面活性剂选自下组：非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂、及其混合物。
[0571]
9.如段落8所述的组合物，其中表面活性剂的水平在从0.1wt％至60wt％、从0.2wt％到40wt％、从0.5wt％至30wt％、从1wt％至50wt％、从1wt％至40wt％、从1wt％至30wt％、从1wt％至20wt％、从3wt％至10wt％、从3wt％至5wt％、从5wt％至40wt％、从5wt％至30wt％、从5wt％至15wt％、从3wt％至20wt％、从3wt％至10wt％、从8wt％至12wt％、从10wt％至12wt％、从20wt％至25wt％或从25wt％-60wt％的范围内。
[0572]
10.如段落8-9中任一项所述的组合物，其中所述阴离子去污表面活性剂包括硫酸盐和磺酸盐去污表面活性剂，特别是烷基苯磺酸盐，特别是c
10-13
烷基苯磺酸盐。
[0573]
11.如段落10所述的组合物，其中所述烷基苯磺酸盐是直链烷基苯磺酸盐(las)。
[0574]
12.如段落10所述的组合物，其中所述硫酸盐去污表面活性剂包括烷基硫酸盐，特别是c
8-18
烷基硫酸盐，例如主要为c
12
烷基硫酸盐。
[0575]
13.如段落10所述的组合物，其中所述硫酸盐去污表面活性剂是烷基烷氧基化硫酸盐，特别是烷基乙氧基化硫酸盐，例如c
8-18
烷基烷氧基化硫酸盐或c
8-18
烷基乙氧基化硫酸盐，例如具有从0.5至20或从0.5至10的平均烷氧基化度的烷基烷氧基化硫酸盐。
[0576]
14.如段落8所述的组合物，其中非离子去污表面活性剂选自由以下组成的组：c
8-c
18
烷基乙氧基化物，例如c
6-c
12
烷基苯酚烷氧基化物，其中所述烷氧基化物
单元可以是乙烯氧基单元，丙烯氧基单元或其混合物；c
12-c
18
醇和c
6-c
12
烷基苯酚与环氧乙烷/环氧丙烷嵌段聚合物的缩合物，例如c
14-c
22
中链分支的醇；c
14-c
22
中链分支的烷基烷氧基化物，典型地具有从1至30的平均烷氧基化度；烷基多糖，在一方面为烷基多糖苷；多羟基脂肪酸酰胺；醚封端的聚(烷氧基化)醇表面活性剂；及其混合物。
[0577]
15.如段落14所述的组合物，其中所述非离子去污表面活性剂是烷基多糖苷和/或烷基烷氧基化醇。
[0578]
16.如段落8-15中任一项所述的组合物，其中所述非离子去污表面活性剂是烷基烷氧基化醇，特别是c
8-18
烷基烷氧基化醇，例如c
8-18
烷基乙氧基化醇，具有从1至50、从1至30、从1至20、或从1至10的平均烷氧基化度的烷基烷氧基化醇。
[0579]
17.如段落8-16中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含选自下组的非离子表面活性剂：醇乙氧基化物(ae或aeo)、醇丙氧基化物、丙氧基化脂肪醇(pfa)、烷氧基化脂肪酸烷基酯(如乙氧基化和/或丙氧基化脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(ape)、壬基酚乙氧基化物(npe)、烷基多糖苷(apg)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(fam)、脂肪酸二乙醇酰胺(fada)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(efam)、丙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(pfam)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的n-酰基n-烷基衍生物(葡糖酰胺(ga)、或脂肪酸葡糖酰胺(faga))、以及在span和tween商品名下可获得的产品、及其组合。
[0580]
18.如段落8-17中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂包括直链烷基苯-磺酸(las)和醇乙氧基化物(aeo)。
[0581]
19.如段落8-18中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂系统是标准洗涤剂x。
[0582]
20.如段落7-19中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含酶，所述酶包括半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、聚戊糖酶、马拉纳酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、叶绿素酶、淀粉酶(包括α-淀粉酶)、磷酸二酯酶(pde)、优选地dna酶和/或rna酶、纤维素酶和/或甘露聚糖酶。
[0583]
21.如段落1-6中任一项所述的脂肪酶变体或如段落6-19中任一项所述的组合物用于水解脂肪酶底物的用途。
[0584]
22.一种用于清洁表面的方法，所述方法包括使所述表面与如段落-16中任一项所述的脂肪酶变体或如段落7-20中任一项所述的组合物接触。
[0585]
23.一种水解脂肪酶底物的方法，所述方法包括用如段落1-6中任一项所述的脂肪酶变体或如段落7-20中任一项所述的组合物处理所述脂肪酶底物。
[0586]
24.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如段落1-6中任一项所述的脂肪酶变体。
[0587]
25.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含如段落24所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，所述一个或多个控制序列指导如段落11-6中任一项所述的脂肪酶变体在重组宿主细胞中的产生。
[0588]
26.一种表达载体，所述表达载体包含如段落24所述的多核苷酸或如段落25所述的核酸构建体。
[0589]
27.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如段落24所述的多核苷酸、如段落25所述的
核酸构建体或如段落26所述的表达载体。
[0590]
28.一种产生脂肪酶变体的方法，所述方法包括：
[0591]
a)在适合于表达所述脂肪酶变体的条件下培养如段落27所述的宿主细胞；以及
[0592]
b)回收所述脂肪酶变体。
[0593]
通过以下实例进一步描述本发明，所述实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
[0594]
实例
[0595]
实例1
[0596]
对硝基苯基(pnp)测定
[0597]
可以通过使用对硝基苯基酰基酯作为底物的动力学测定来确定脂肪酶的水解活性。
[0598]
可以将以下这些底物在dmso中的100mm储备溶液稀释到测定缓冲液(50mm tris；ph 7.7；0.4％triton x-100)中1mm 25mm的终浓度：对硝基苯基丁酸酯(c4)、对硝基苯基己酸酯(c6)、对硝基苯基癸酸酯(c10)、对硝基苯基月桂酸酯(c12)和对硝基苯基棕榈酸酯(c16)(所有都来自西格玛奥德里奇丹麦公司(sigma-aldrich danmark a/s)，kirkebjerg all
é
84，2605目录号：c3：n-9876、c6：n-0502、c10：n-0252、c12：n-2002、c16：n-2752)。
[0599]
将在50mm hepes(ph 8.0)；10ppm triton x-100； /-20mm cacl2中的本发明的脂肪酶变体和如seq id no:2所示的亲本脂肪酶按以下最终蛋白质浓度：0.01mg/ml；5x10-3
mg/ml；2.5x10-4
mg/ml和1.25x10-4
mg/ml添加至96-孔nunc板(目录号：260836，kamstrupvej 90，dk-4000，罗斯基勒(roskilde))中的底物溶液中。缓冲液也作为阴性对照运行。可以在spectra max 190(分子设备股份有限公司(molecular devices gmbh)，bismarckring 39，88400biberach an der riss，德国)上，以10秒间隔，在405nm处监测由对硝基苯基酰水解而释放的对硝基苯酚，持续5分钟。可以将变体对一种或多种底物的水解活性与如seq id no:2所示的亲本脂肪酶对一种或多种底物的水解活性进行比较。
[0600]
实例2
[0601]
通过定点诱变构建脂肪酶变体
[0602]
定点变体可以是构建自包含具体取代的、如seq id no:2所示的脂肪酶。使用pcr连同正确地设计的诱变寡核苷酸(其在所得序列中引入所希望的突变)，通过传统的dna片段克隆制得这些变体(sambrook等人,molecular cloning:a laboratory manual[分子克隆：实验室手册]，第2版，冷泉港，1989)。
[0603]
对应于所需的一个或多个突变位点侧翼的dna序列设计诱变的寡核苷酸，其由限定插入/缺失/取代的dna碱基对分离，并购自寡核苷酸的供应商，如生命科技公司(life technologies)。
[0604]
为了测试脂肪酶变体，将包含变体的突变dna通过同源重组而整合到感受态米曲霉中，使用标准方案(基于酵母提取物的培养基，3-4天，30℃)发酵，并通过色谱法纯化。
[0605]
实例3
[0606]
相对于参照脂肪酶(seq id no:2)测定脂肪酶变体的洗涤性能
[0607]
为了评估在衣物洗涤中的洗涤性能，使用自动机械应力测定(amsa)进行洗涤实
验。amsa板具有许多用于测试溶液的槽和盖子，盖子针对所有槽开口强力挤压衣物洗涤样品(待洗涤的纺织品)。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈摇动以使测试溶液与纺织品接触并以规则的、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见wo 02/42740，尤其是第23-24页的“特定方法实施例(special method embodiments)”段落。
[0608]
在以下指定的实验条件下进行衣物洗涤实验：
[0609]
洗涤剂：1.75g/l标准洗涤剂x
[0610]
测试溶液体积：160μl
[0611]
洗涤时间：20分钟
[0612]
温度：30℃
[0613]
脂肪酶剂量：0ppm(不含酶的空白)，0.35ppm
[0614]
测试材料：猪脂染色的针织棉(kc-s-62)，测试材料中心(center for testmaterials)(stoomloggerweg 11，3133kt弗拉尔丁恩(vlaardingen)，荷兰)
[0615]
通过添加cacl2、mgcl2、和nahco3(ca
2
:mg
2
:hco
3-＝2:1:4.5)将水硬度调节为6
°
dh。
[0616]
[0617][0618]
a)余量是水
[0619]
b)添加的量
[0620]
洗涤之后，将纺织品在自来水中冲洗并且使用滤纸将过量的水从纺织品中去除，并且其后立即将纺织品在室温下干燥15分钟。
[0621]
以所洗涤的弄脏的纺织品的颜色变化来测量洗涤性能。污垢是含天然着色剂的猪脂。在洗涤期间将着色剂与猪脂一起去除。脂肪酶洗涤性能因此可以被表示为当用白光照亮时，从所洗涤的弄脏的纺织品反射-发射的光的颜色变化程度。
[0622]
使用用于捕获所洗涤的弄脏的纺织品的图像的专业平板扫描仪(epson expression 11000xl，阿特亚公司(atea a/s)，lautrupvang 6，2750巴勒鲁普(ballerup)，丹麦)进行颜色测量。为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24位像素值转化为红色、绿色和蓝色(rgb)值。
[0623]
归因于脂肪酶活性的颜色变化被测量为光强度值(int)的变化，所述变化计算为：
[0624][0625]
相对于参照脂肪酶，脂肪酶的洗涤性能被计算为：
[0626]
相对洗涤性能＝测试的脂肪酶的int(洗涤性能)-参照脂肪酶的int(洗涤性能)
[0627]
如果脂肪酶表现优于参照，则认为脂肪酶展示出改善的洗涤性能。在本发明的上下文中，参照脂肪酶是如seq id no:2所示的脂肪酶。相对于seq id no:2，具有改善的洗涤性能的变体的相对洗涤性能》0.00。换言之，所述参照脂肪酶(即，seq id no:2))的相对洗涤性能＝0.00。如下所示确定所述脂肪酶变体的洗涤性能评分(wps)。
[0628] 洗涤性能评分(wps)相对洗涤性能高于15.00 相对洗涤性能高于10.00-15.00 相对洗涤性能高于5.00-10.00 相对洗涤性能高于0.00-5.00
[0629]
相对于如seq id no:2所示的参照脂肪酶，洗涤性能测试的结果
[0630]
[0631]
[0632]
[0633]
[0634]
[0635]
[0636][0637]
实例4
[0638]
参照脂肪酶(seq id no:2)和野生型脂肪酶(seq id no:3)的洗涤性能相对于空白(无脂肪酶)和野生型犁头霉属脂肪酶(asl)(seq id no:3)，在与实例3所述的相同条件下，在标准x洗涤剂中确定了如seq id no:2所示的参照脂肪酶的洗涤性能(即，δ洗涤性能)。
[0639] δ洗涤性能(dwp)空白(无酶)0野生型asl(seq id no:3)0.29参照脂肪酶(seq id no:2)5.95
[0640]
本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的具体方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明几方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员会从前述说明变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
