新的外排体产生方法及其应用与流程

1.本发明涉及用于产生外排体的方法，并且具体地，涉及可提高外排体产生和/或增强外排体的生物活性的用于产生外排体的方法。
2.此外，本发明涉及用于提高外排体产生的方法、用于增强外排体生物活性的方法及其培养基。
3.另外，本发明涉及通过上述产生方法获得的具有增强生物活性的外排体的应用。


背景技术：

4.最近，有报道称细胞分泌组(secretome)包含调节细胞行为的多种生物活性分子。特别地，细胞分泌组包含具有细胞间信号传导功能的“外排体(exosome)”或“胞外囊泡”，并因此已积极地对其组分和功能进行了研究。
5.细胞将多种膜囊泡脱落到其细胞外环境，并且这些释放的囊泡通常被称为胞外囊泡(extracellular vesicle，ev)。ev也称为细胞膜来源囊泡、核外颗粒体、脱落囊泡、微粒、外排体等，并且在一些情况下也与外排体区别使用。
6.外排体是尺寸为数十至数百纳米的囊泡，其包含与细胞膜具有相同结构的磷脂双层膜。该外排体包含称为外排体载物(cargo)的蛋白质、核酸(mrna、mirna等)等。已知外排体载物包括多种信号传导因子，并且这些信号传导因子对细胞类型具有特异性，并且根据分泌细胞的环境而受到不同的调节。已知外排体是细胞分泌的细胞间信号传导介质，并且通过其传递的多种细胞信号来调节细胞行为，包括靶细胞的活化、生长、迁移、分化、去分化、凋亡和坏死。根据外排体来源于的细胞的性质和状态，外排体包含特定的遗传物质和生物活性因子。来源于增殖干细胞的外排体调节细胞行为，例如细胞迁移、增殖和分化，并且重现参与组织再生的干细胞的特征(nature review immunology 2002(2)569-579)。
7.换言之，被称为细胞“化身”的外排体包含生物活性因子例如生长因子，与细胞类似，并且作为在细胞间传递生物活性因子的载体，即起到介导细胞间通讯的作用。已知外排体不仅从动物细胞例如干细胞、免疫细胞、成纤维细胞和癌细胞中释放，而且从多种生物体例如植物、细菌、真菌和藻类的细胞中释放。
8.用于分离外排体的常规技术包括超速离心、密度梯度离心、超滤、切向流过滤(tangential flow filtration，tff)、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、免疫亲和捕获、基于微流体的分离、外排体沉淀、总外排体分离试剂盒、基于聚合物的沉淀等。
9.然而，尽管已经提出了如上所述的多种用于分离外排体的方法，但在与外排体的产生相关的技术领域中可以进行不断改进，类似于其他技术领域。例如，需要提供用于产生外排体的新技术，其可以提高每种细胞来源条件培养基的外排体生产率，并改善与外排体的生物活性因子相关的效力。
10.同时，应理解，作为背景技术描述的内容仅旨在帮助理解本发明的背景，并不被认为是针对本发明的现有技术。


技术实现要素：

11.本发明的一个目的是提供用于产生外排体的方法，其可以提高外排体产生和/或增强外排体的生物活性。
12.本发明的另一个目的是提供用于提高外排体产生的方法和用于增强外排体生物活性的方法。
13.本发明的又一个目的是提供用于提高外排体产生和/或增强外排体生物活性的培养基。
14.本发明的再一个目的是提供通过上述产生方法获得的具有增强生物活性的外排体的多种应用。
15.然而，如上所述的本发明的目的是举例说明性的，并且本发明的范围不限于此。另外，本发明的其他目的和优点将从以下描述、所附权利要求书和附图中更加明显。
具体实施方式
16.本发明人对可以提高外排体产生和增强外排体效力的用于产生外排体的方法进行了深入研究，并且作为结果已发现，当使用tnf-α和干扰素-γ的组合时，每种条件培养基(或每个细胞)产生的外排体的量提高，并且产生的外排体的生物活性得到增强，从而完成了本发明。
17.本发明提供了用于产生外排体的方法，该方法包括在包含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养动物细胞。
18.本文中所使用的术语“胞外囊泡(ev)”通常意指涵盖膜囊泡、核外颗粒体、脱落的囊泡、微粒或其等同物。根据分离环境、条件和方法，术语“胞外囊泡”可具有与术语“外排体”相同的含义，并且也可意指包括与外排体具有相同或相似尺寸但具有与外排体的组成不同的组成的纳米囊泡。同时，与生产率相关使用的术语“外排体”意指包括上述胞外囊泡。
19.本文中所使用的术语“外排体”是指尺寸为数十至数百纳米(优选约30至200nm)的囊泡，其包含与细胞膜具有相同结构的磷脂双层膜(然而，根据从中分离出外排体的细胞的类型、分离方法和测量方法，外排体的颗粒尺寸是可变的)(vasiliy s.chernyshev et al.，“size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes”，anal bioanal chem，(2015)doi 10.1007/s00216-015-8535-3)。这些外排体包含被称为外排体载物的蛋白质、核酸(mrna、mirna等)等。已知，外排体载物包括广泛多种信号传导因子，并且这些信号传导因子对细胞类型具有特异性，并根据分泌细胞的环境而不同地调节。已知，外排体是由细胞分泌的细胞间信号传导介质，并通过它们传递的多种细胞信号调节细胞行为，包括靶细胞的活化、生长、迁移、分化、去分化、凋亡和坏死。
20.同时，本文中所使用的术语“外排体”旨在包括从动物细胞分泌并释放到胞外空间中且具有纳米尺寸囊泡结构和与外排体的组成类似的组成的所有囊泡(例如，外排体样囊泡)。
21.在本发明中，外排体来源的动物细胞的类型不受限制。作为不限制本发明范围的实例，动物细胞可以是干细胞或免疫细胞。干细胞可以是胚胎干细胞、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，ipsc)、成体干细胞、胚胎干细胞来源的间充质干细胞或诱导多能干细胞来源的间充质干细胞。免疫细胞可以是t细胞、b细胞、nk细胞、细胞毒性t
细胞、树突细胞或巨噬细胞。
22.作为不限制本发明范围的实例，成体干细胞可以是选自以下的至少一种类型的成体干细胞：间充质干细胞、人组织来源的间充质基质细胞、人组织来源的间充质干细胞和多能干细胞。所述间充质干细胞可以是来源于选自以下的至少一种组织的间充质干细胞：脐带、脐带血、骨髓、脂肪组织、肌肉、神经、皮肤、羊膜、沃顿氏胶和胎盘。优选地，成体干细胞可以是间充质干细胞，例如脂肪-、骨髓-、脐带-或脐带血-来源的干细胞，更优选脂肪来源干细胞。干细胞或免疫细胞不限于其种类，只要它们不构成病原体感染的风险并且不引起免疫排斥即可，但可以优选地为人干细胞或人免疫细胞。
23.然而，当然可以使用本领域中正在使用或可在将来使用的多种动物细胞，只要其不对人体造成不良作用即可。例如，也可以使用hek293细胞或hek293t细胞。因此，应理解的是，在稍后描述的实施例中使用的脂肪来源干细胞是可用于本发明的动物细胞的一个实例，并且本发明不限于此。
24.本文中所使用的术语“经预处理的”是指在包含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养动物细胞，并且术语“经预处理的外排体”是指通过在包含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养动物细胞而获得的外排体。术语“未经处理的”意指在不含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养动物细胞，并且术语“未经处理的外排体”或“未经处理的对照”是指在任何细胞培养步骤和外排体产生步骤中在没有用tnf-α和干扰素-γ进行处理的情况下获得的外排体。
25.本文中所使用的术语“无血清培养基”或“sfm”是指例如包含未补充有血清如胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)的基础培养基的培养基(任选地包含抗生素和/或抗真菌剂)，并且术语“edm”是指包含补充有以下的基础培养基的培养基(任选地包含抗生素和/或抗真菌剂)：血小板裂解物、优选人血小板裂解物、更优选已从其中去除血小板裂解物来源的外排体和胞外囊泡的人血小板裂解物。作为不限制本发明范围的实例，基础培养基可以是α-mem、dmem、dmem f12、199培养基、rpmi-1640、l-15、hum f-10、hum f-12、dm-160、dm-170等。
26.本发明提供了用于提高外排体产生的方法，该方法包括在包含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养动物细胞。例如，根据本发明一个实施方案的用于提高外排体产生的方法可包含以下步骤：(a)在包含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养动物细胞；(b)洗涤动物细胞；(c)在无血清培养基中培养动物细胞并收集动物细胞的条件培养基；以及(d)从收集的条件培养基中分离外排体。
27.在根据本发明一个实施方案的用于提高外排体产生的方法中，步骤(c)中的无血清培养基可补充有血小板裂解物。血小板裂解物可优选地是人血小板裂解物，更优选已从其中去除血小板裂解物来源的外排体和胞外囊泡的人血小板裂解物。
28.在根据本发明一个实施方案的用于提高外排体产生的方法中，tnf-α和干扰素-γ各自可以以约1ng/ml至100ng/ml、优选约10ng/ml至30ng/ml，例如约20ng/ml的浓度包含在培养基中。
29.在根据本发明一个实施方案的用于提高外排体产生的方法中，培养可进行约12小时至48小时，例如24小时。
30.在根据本发明一个实施方案的用于提高外排体产生的方法中，外排体产生可定义为外排体颗粒数/ml条件培养基(或外排体颗粒数/个细胞)。
31.本发明提供了用于增强外排体生物活性的方法，该方法包括在包含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养动物细胞。例如，根据本发明一个实施方案的用于增强外排体生物活性的方法可包括以下步骤：(a)在包含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养动物细胞；(b)洗涤动物细胞；(c)在无血清培养基中培养动物细胞并收集动物细胞的条件培养基；以及(d)从收集的条件培养基中分离外排体。
32.在根据本发明一个实施方案的用于增强外排体生物活性的方法中，步骤(c)中的无血清培养基可补充有血小板裂解物。血小板裂解物可优选地是人血小板裂解物，更优选已从其中去除血小板裂解物来源的外排体和胞外囊泡的人血小板裂解物。
33.在根据本发明一个实施方案的用于增强外排体生物活性的方法中，tnf-α和干扰素-γ各自可以以约1ng/ml至100ng/ml、优选约10ng/ml至30ng/ml，例如约20ng/ml的浓度包含在培养基中。
34.在根据本发明一个实施方案的用于增强外排体生物活性的方法中，培养可进行约12小时至48小时，例如，24小时。
35.在根据本发明一个实施方案的用于增强外排体生物活性的方法中，外排体生物活性的增强可以是在提高外排体的弹性蛋白合成方面的增强，例如皮肤弹性改善作用和皱纹减少作用中至少一种的增强。
36.本发明提供了用于提高来源于动物细胞的外排体的产生或增强来源于动物细胞的外排体的生物活性的培养基。
37.在根据本发明一个实施方案的用于提高来源于动物细胞的外排体的产生或增强来源于动物细胞的外排体的生物活性的培养基中，tnf-α和干扰素-γ各自可以以约1ng/ml至100ng/ml、优选约10ng/ml至30ng/ml，例如约20ng/ml的浓度包含在培养基中。
38.本发明还提供了组合物，其包含具有增强的提高弹性蛋白合成作用的外排体作为活性成分，所述外排体通过在包含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养动物细胞而获得。该组合物可以是例如用于皮肤弹性改善或皱纹减少的组合物。
39.例如，根据本发明一个实施方案的组合物可通过进行以下步骤而获得：(a)在包含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养动物细胞；(b)洗涤动物细胞；(c)在无血清培养基中培养动物细胞并收集动物细胞的条件培养基；以及(d)从收集的条件培养基中分离外排体。
40.在根据本发明一个实施方案的组合物中，步骤(c)中的无血清培养基可补充有血小板裂解物。血小板裂解物可优选地是人血小板裂解物，更优选已从其中去除血小板裂解物来源的外排体和胞外囊泡的人血小板裂解物。
41.在根据本发明一个实施方案的组合物中，tnf-α和干扰素-γ各自可以以约1ng/ml至100ng/ml、优选约10ng/ml至30ng/ml，例如约20ng/ml的浓度包含在培养基中。
42.在根据本发明一个实施方案的组合物中，培养可进行约12小时至48小时，例如24小时。
43.作为不限制本发明范围的实例，根据用于产生外排体的方法而获得的包含外排体的组合物可制备成准药物、化妆品组合物或皮肤外用制剂。准药物或皮肤外用制剂可制备成溶液剂、软膏剂、乳膏剂、喷雾剂、贴片、凝胶剂或气雾剂。根据本发明一个实施方案的化妆品组合物可以是例如霜或化妆水。
44.同时，当将根据本发明一个实施方案的组合物制备成准药物、皮肤外用制剂和/或
化妆品组合物时，在不损害本发明效果的范围内，根据需要，其可适当地包含通常用于准药物、皮肤外用制剂和/或化妆品组合物中的组分，例如，保湿剂、抗氧化剂、油性组分、uv吸收剂、乳化剂、表面活性剂、增稠剂、醇类、粉组分、着色剂、水性组分、水以及多种皮肤营养物等。
45.此外，除了具有增强的生物活性的外排体之外，根据本发明一个实施方案的准药物、皮肤外用制剂和/或化妆品组合物在不损害其作用(例如，皮肤弹性改善作用和/或皱纹减少作用)的范围内还可包含常规的皮肤弹性改进剂、抗皱剂和/或保湿剂。例如，根据本发明的包含具有增强的生物活性的外排体作为活性成分的组合物可包含在以下中的至少一种中或与以下中的至少一种混合：水凝胶、透明质酸、透明质酸的盐(例如透明质酸钠等)或透明质酸凝胶。在根据本发明一个实施方案的准药物、皮肤外用制剂和/或化妆品组合物中，水凝胶的种类没有特别限制，但是水凝胶可优选地通过将凝胶聚合物分散在多元醇中来获得。胶凝聚合物可以是选自以下的至少一种：普朗尼克、纯化琼脂、琼脂糖、结冷胶、藻酸、卡拉胶、肉桂胶、黄原胶、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、果胶、纤维素、瓜尔胶和槐豆胶，并且多元醇可以是选自以下的至少一种：乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇、异丁二醇、二丙二醇、山梨糖醇、木糖醇和甘油。
46.根据本发明一个实施方案的准药物、皮肤外用制剂和/或化妆品组合物可以以多种形式例如贴片、片装面膜面膜巾霜、活肤水、软膏剂、混悬液、乳液、糊剂、化妆水、凝胶剂、油剂、剥撕式面膜喷雾剂、气雾剂、雾剂、粉底、粉和油纸使用。例如，准药物、皮肤外用制剂和/或化妆品组合物可被施加至贴片、片装面膜或面膜巾的至少一个表面或浸透在贴片、片装面膜或面膜巾的至少一个表面中。
47.根据本发明一个实施方案的化妆品组合物用于皮肤弹性改善作用和/或皱纹减少等目的，并且该化妆品组合物可制备成本领域中通常制备的任何制剂。例如，其可配制为贴片、片装面膜、面膜巾、皮肤软化剂、营养物、收敛化妆水、滋养霜、按摩霜、眼霜、清洁霜、精华、眼部精华、清洁化妆水、清洁泡沫、清洁水、防晒霜、唇膏、肥皂、洗发剂、含表面活性剂的清洁剂、浴用制剂、身体乳、身体霜、身体油、身体精华、身体清洁剂、染发剂、生发剂等，但不限于此。
48.根据本发明一个实施方案的准药物、皮肤外用制剂和/或化妆品组合物包含通常在准药物、皮肤外用制剂和/或化妆品产品中使用的组分。例如，准药物、皮肤外用制剂和/或化妆品组合物可包含常规的辅料和载体，例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和香料。另外，本领域技术人员可根据准药物、皮肤外用制剂和/或化妆品组合物的类型或预期用途，毫无困难地适当选择准药物、皮肤外用制剂和/或化妆品组合物的每种制剂中的其他组分。
49.有利效果
50.根据本发明，不仅可以提高待从细胞来源的条件培养基中分离的外排体的产生，而且还可以显示出增强外排体的生物活性，例如提高外排体的弹性蛋白合成的优异作用。因此，根据本发明的用于产生外排体的方法具有以下优点：其可以经济且有效地以高产率产生可在商业和/或临床上使用的具有增强生物活性的外排体，并且特别地，其可以产生大量比通过常规方法产生的外排体好得多的具有增强生物活性的外排体。
51.应当理解，本发明的范围不限于上述作用。
附图说明
52.图1描绘了显示出通过对以下进行纳米颗粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis，nta)而获得的颗粒尺寸分布和颗粒数的图：在不含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养干细胞之后，使用超滤获得的未经处理外排体，以及在包含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养干细胞之后，使用超滤获得的经预处理外排体。
53.图2描绘了显示出以下的比较图：与未用tnf-α和干扰素-γ处理的对照组相比，根据本发明的一个实施方案用tnf-α和干扰素-γ预处理的情况下的外排体产生显著提高。图2a是显示出在对条件培养基(cm)进行超滤之前，对于条件培养基(cm)中外排体颗粒数进行测量和比较的结果的图；图2b是显示出对于在对条件培养基(cm)进行超滤之后获得的外排体溶液中外排体颗粒数进行测量和比较的结果的图；以及图2c是将图2a与图2b的比较结果一并显示的图。
54.图3描绘了显示出通过对以下进行纳米颗粒追踪分析(nta)而获得的颗粒尺寸分布和颗粒数的图：在不含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养干细胞之后，使用超速离心获得的未经处理外排体，以及在包含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养干细胞之后，使用超速离心获得的经预处理外排体。
55.图4描绘了显示出以下的比较图：与未用tnf-α和干扰素-γ处理的对照组相比，根据本发明的一个实施方案用tnf-α和干扰素-γ预处理的情况下的外排体产生显著提高。图4a是显示出在对条件培养基(cm)进行超速离心之前，对于条件培养基(cm)中的外排体颗粒数进行测量和比较的结果的图；图4b是显示出对于在对条件培养基(cm)进行超速离心之后获得的外排体溶液(exo)中外排体颗粒数进行测量和比较的结果的图；以及图4c是将图4a与图4b的比较结果一并显示的图。
56.图5是显示出以下的比较图：与未经处理的对照组、用单独的干扰素-γ预处理的组和用单独的tnf-α预处理的组中每一种中的cd63标志物的含量相比，根据本发明的一个实施方案用tnf-α和干扰素-γ预处理的实验组中cd63标志物(作为外排体特异性标志物，反映外排体的含量和生产率)的含量显著提高。
57.图6是显示出以下的比较图：当根据本发明的一个实施方案用经预处理的外排体对人真皮成纤维细胞进行处理时，与未用任何外排体处理的对照组相比，人真皮成纤维细胞中的弹性蛋白合成显著提高，以及当根据本发明的一个实施方案用经预处理的外排体对人真皮成纤维细胞进行处理时，人真皮成纤维细胞中弹性蛋白合成的提高显著优于未经处理的外排体(普通外排体)、用单独的干扰素-γ预处理的外排体和用单独的tnf-α预处理的外排体中的每一种。
58.图7是显示以下的示意图：根据本发明的一个实施方案，在细胞培养期间，在细胞生长步骤中用tnf-α和干扰素-γ对细胞进行预处理的过程，以及在洗涤经预处理的细胞之后，收集包含通过在sfm培养基或edm培养基中培养细胞分泌的外排体的条件培养基以产生具有增强生物活性的外排体的过程。
59.图8示出了与用tnf-α和干扰素-γ预处理之后在sfm培养基中产生的外排体相比，根据本发明的一个实施方案用tnf-α和干扰素-γ预处理之后在edm培养基中产生的外排体
显著提高了人真皮成纤维细胞中的弹性蛋白合成。
60.实施例
61.在下文中，将参照以下实施例更详细地描述本发明。然而，以下实施例仅用于举例说明本发明，并不旨在限制或约束本发明的范围。本领域技术人员可从本发明的详细描述和实施例中容易地推断出的那些被解释为落入本发明的范围内。本发明中提及的参考文献通过引用并入本文。
62.在本说明书通篇，应当理解，除非另有指明，否则当任何部分被提及“包含/包括”任何组分时，其不排除其他组分，而是还可包含/包括其他组分。
63.实施例
64.实施例1：细胞培养
65.根据本发明所属领域中已知的细胞培养方法，在补充有10％fbs(胎牛血清；购自thermofisher scientific)和1％青霉素-链霉素(购自thermofisher scientific)的mem-α(极限必需培养基α；购自thermofisher scientific)中在37℃、5％co2下培养脂肪来源干细胞。在未用tnf-α和干扰素-γ(ifn-γ)处理干细胞的情况下，将干细胞培养24小时。在用tnf-α和干扰素-γ(ifn-γ)处理干细胞的情况下，培养基用浓度分别为20ng/ml的tnf-α和ifn-γ处理，并且将干细胞在培养基中培养24小时(参见图7中的“1.细胞生长”)。在培养24小时之后，将用tnf-α和ifn-γ处理的干细胞和未用tnf-α和ifn-γ处理的干细胞二者用磷酸缓冲盐水洗涤(图7中的“2.细胞洗涤”)。然后，将培养基更换为无血清培养基(sfm)或edm，将干细胞培养24小时，并收集各培养上清液(以下称为条件培养基)(参见图7中“3.用于外排体产生的培养和条件培养基收集”)。同时，可通过以下来制备edm：收集在人血小板裂解物(human platelet lysate，hpl)的切向流过滤之后获得的渗透物，从而获得已从其中去除胞外囊泡和外排体的人血小板裂解物，并将获得的血小板裂解物添加至基础培养基。
66.稍后描述的实施例2至5将说明在用tnf-α和干扰素-γ预处理之后，在无血清培养基中产生的外排体，并且实施例6将说明在用tnf-α和干扰素-γ预处理之后在edm中产生的外排体在提高弹性蛋白合成方面的效果优于在用tnf-α和干扰素-γ预处理之后在sfm中产生的外排体。
67.实施例2：外排体的分离和纯化
68.实施例2-1：使用超滤分离
69.使用超滤从实施例1中收集的每种条件培养基中分离和浓缩外排体。使用离心过滤器(购自millipore)作为用于超滤的过滤器。可以选择具有不同截留分子量(molecular weight cutoff，mwco)的离心过滤器。使用具有所选mwco的过滤器，将外排体分离并浓缩，并去除比mwco更小的颗粒、蛋白质、脂质、核酸、低分子量化合物等。
70.使用mwco为30,000da(道尔顿)的离心过滤器来分离和浓缩外排体。使用超滤，通过去除小于mwco的物质并将条件培养基浓缩至约1/200的体积，从条件培养基中分离外排体。
71.同时，作为从包括干细胞的动物细胞的条件培养基中分离外排体的方法，除了上述分离方法之外，还可以使用本领域已知的多种方法。例如，对于外排体的分离，可以使用已知的分离方法，例如超速离心、密度梯度离心、切向流过滤(tff)、尺寸排阻色谱、离子交
换色谱、免疫亲和捕获、基于微流体的分离、外排体沉淀、总外排体分离试剂盒、基于聚合物的沉淀等。然而，用于分离外排体的方法不限于上述方法，并且当然可以使用本领域中正在使用的或可在将来使用的多种分离方法。
72.实施例2-2：使用超速离心分离外排体
73.另外，使用超速离心从实施例1中收集的每种条件培养基中分离和浓缩外排体。在4℃下对收集的条件培养基进行依次离心以分离外排体，如下所述。首先，为了从收集的条件培养基中去除细胞，将条件培养基以300
×
g离心10分钟，然后收集上清液。另外，为了从上清液中去除细胞碎片，将上清液以2,000
×
g离心20分钟，然后收集上清液。然后，为了从上清液中去除微泡，将上清液以16,500
×
g离心10分钟，然后收集上清液。将最终获得的上清液以120,000
×
g离心120分钟，然后弃去上清液并收集沉淀物。然后，将沉淀物用磷酸缓冲盐水洗涤，并再次以120,000
×
g离心120分钟，并弃去上清液。接下来，将沉淀物悬浮在磷酸缓冲盐水中，从而分离外排体。
74.实施例3：分离的外排体的表征和外排体生产率的评价
75.实施例3-1：使用超滤分离的外排体生产率的表征和评价
76.通过纳米颗粒追踪分析(nta)仪器(购自malvern)测量根据实施例2-1分离的外排体的颗粒尺寸和浓度。图1描绘了显示出根据实施例2-1分离的外排体的nta结果的图。如图1中所示，可以看出，与在不含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养干细胞之后使用超滤获得的未经处理外排体(在图1中用“未经处理的”表示)相比，根据本发明一个实施方案的在包含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养干细胞之后使用超滤获得的经预处理的外排体(在图1中用“经tnf-α、ifn-γ处理的”表示)具有更均一的颗粒尺寸分布。
77.另外，如图2a、2b和2c中所示，从nta的比较分析结果证实了，与未用tnf-α和干扰素-γ处理的对照组(在图2a、2b和2c中用“未经处理的”表示)相比，在用tnf-α和干扰素-γ预处理的情况(在图2a、2b和2c中用“经tnf-α、ifn-γ处理的”表示)下的外排体生产率提高至约2至3倍或更多。
78.作为在对条件培养基(cm)进行超滤之前对于条件培养基(cm)中外排体颗粒数进行测量和比较的结果，证实了与未用tnf-α和干扰素-γ处理的对照组相比，在用tnf-α和干扰素-γ预处理的情况下的外排体生产率显著提高(图2a和2c)。另外，作为对于在对条件培养基(cm)进行超滤之后获得的外排体溶液中外排体颗粒数进行测量和比较的结果，证实了与未用tnf-α和干扰素-γ处理的对照组相比，在用tnf-α和干扰素-γ预处理的情况下的外排体生产率显著提高(图2b和2c)。
79.因此，可以看出，本发明通过在包含tnf-α和干扰素-γ的组合的培养基中进行培养干细胞的预处理过程，可以经济且有效地以高产率产生具有均一颗粒尺寸分布的外排体。
80.实施例3-2：使用超速离心分离的外排体的生产率的表征和评价
81.通过纳米颗粒追踪分析(nta)仪器(购自malvern)测量根据实施例2-2分离的外排体的颗粒尺寸和浓度。图3描绘了显示出根据实施例2-2分离的外排体的nta结果的图。如图3中所示，可以看出，与在不含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养干细胞之后使用超速离心获得的未经处理外排体(在图3中用“未经处理的”表示)相比，根据本发明的一个实施方案的在包含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养干细胞之后使用超速离心获得的预处理外排
体(在图3中用“经tnf-α、ifn-γ处理的”表示)具有更均一的颗粒尺寸分布。
82.另外，如图4a、4b和4c中所示，从nta的比较分析结果证实了，与未用tnf-α和干扰素-γ处理的对照组(在图4a、4b和4c中用“未经处理的”表示)相比，在用tnf-α和干扰素-γ预处理的情况(在图4a、4b和4c中用“经tnf-α、ifn-γ处理的”表示)下的外排体生产率提高至约2至3倍或更多。
83.作为在对条件培养基(cm)进行超速离心之前对于条件培养基(cm)中外排体颗粒数进行测量和比较的结果，证实了与未用tnf-α和干扰素-γ处理的对照组相比，在用tnf-α和干扰素-γ预处理的情况下的外排体生产率显著提高(图4a和4c)。另外，作为对于在对条件培养基(cm)进行超速离心之后获得的外排体溶液中外排体颗粒数进行测量和比较的结果，证实了与未用tnf-α和干扰素-γ处理的对照组相比，在用tnf-α和干扰素-γ预处理的情况下的外排体生产率显著提高(图4b和4c)
84.因此，可以看出，本发明通过在包含tnf-α和干扰素-γ的组合的培养基中进行培养干细胞的预处理过程，可以经济且有效地以高产率产生具有均一颗粒尺寸分布的外排体。
85.实施例4：关于通过在包含tnf-α和干扰素-γ组合的培养基中培养干细胞的预处理过程是否提高外排体生产率的分析
86.另外，为了准确比较分析外排体的生产率，根据外排体产生的干细胞培养物中是否包含tnf-α和/或干扰素-γ，建立如下实验组：
87.(1)未经处理对照组(未经处理的)：其中在不含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养干细胞，然后根据实施例2-2分离外排体的实验组；
88.(2)用单独的干扰素-γ预处理的组(经ifn-γ处理的)：其中在包含干扰素-γ的培养基中培养干细胞，然后根据实施例2-2分离外排体的实验组；
89.(3)用单独的tnf-α预处理的组(经tnf-α处理的)：其中在包含tnf-α的培养基中培养干细胞，然后根据实施例2-2分离外排体的实验组；以及
90.(4)用tnf-α和干扰素-γ预处理的组(经tnf-α、ifn-γ处理的)：其中在包含tnf-α和干扰素-γ的培养基中培养干细胞，然后根据实施例2-2分离外排体的实验组。
91.将实验组(1)至(4)中每一个的外排体与外排体-入cd63流动检测试剂(exosome-human cd63 flow detection reagent)(invitrogen
tm
)混合在一起过夜。然后，使每种混合物与pe小鼠抗人cd63(bd parmigen
tm
)反应，并使用流式细胞术测量其pe平均荧光强度(mean fluorescence intensity，mfi)。
92.同时，由于cd63是外排体的代表性阳性标志物，因此cd63含量与外排体含量彼此呈线性比例关系，并且cd63含量提高意味着外排体含量成比例提高。根据该原理，将已知浓度的人cd63蛋白进行连续稀释，以制备具有不同人cd63蛋白浓度的人cd63蛋白溶液，并将每种人cd63蛋白溶液与外排体-人cd63流动检测试剂(invitrogen
tm
)混合在一起过夜。然后，使每种混合物与pe小鼠抗人cd63(bd parmigen
tm
)反应，并使用流式细胞仪测量其pe平均荧光强度(mfi)。然后，对人cd63蛋白浓度值和对应的mfi测量值进行线性回归分析，并生成满足线性度为0.99或更高的标准定量分析图。然后，使用生成的标准定量分析图，确定实验组(1)至(4)中每一种中的cd63含量。
93.结果，可以确认在根据本发明用tnf-α和干扰素-γ预处理的实验组(4)中测得的
外排体含量(cd63含量)显著高于在未经处理的实验组(1)和用单独的干扰素-γ预处理的实验组(2)以及用单独的tnf-α预处理的实验组(3)中每一种中测得的外排体含量(参见图5)。因此，可以看出，本发明通过在包含tnf-α和干扰素-γ的组合的培养基中进行培养干细胞的预处理过程，可以显著提高外排体生产率。
94.实施例5：经预处理的外排体对弹性蛋白合成提高作用的评价1
95.使用人真皮成纤维细胞(hdf)，如下评价用tnf-α和/或干扰素-γ(ifn-γ)预处理的干细胞来源外排体对弹性蛋白合成提高的作用。为此，建立了如下实验组：
96.(1)阴性对照组(对照)：其中未用外排体处理人真皮成纤维细胞的实验组；
97.(2)用未经处理的外排体(普通外排体)处理的组：其中用浓度为2.26
×
10
10
个颗粒/ml的实施例4的实验组(1)的普通外排体处理人真皮成纤维细胞的实验组(在图6中用“未经处理的”表示)；
98.(3)用使用单独的ifn-γ预处理的外排体处理的组：其中用浓度为2.26
×
10
10
个颗粒/ml的实施例4的实验组(2)的外排体处理人真皮成纤维细胞的实验组(在图6中用“ifn-γ”表示)；
99.(4)用使用单独的tnf-α预处理的外排体处理的组：其中用浓度为2.26
×
10
10
个颗粒/ml的实施例4的实验组(3)的外排体处理人真皮成纤维细胞的实验组(在图6中用“tnf-α”表示)；以及
100.(5)用使用tnf-α和ifn-γ预处理的外排体处理的组：其中用浓度为2.26
×
10
10
个颗粒/ml的实施例4的实验组(4)的(用tnf-α和ifn-γ预处理的)外排体处理人真皮成纤维细胞的实验组(在图6中用“经tnf-α、ifn-γ处理的”表示)。
101.将人真皮成纤维细胞悬浮在包含10％生长补充剂和1％青霉素-链霉素的hdf生长培养基(购自cefo co.，ltd.，seoul，korea)中，然后以3.0
×
104个细胞/孔的密度接种到48孔板中，并在37℃、5％co2下在培养箱中培养24小时。
102.此后，根据上述实验组(1)至(5)中每一种的条件处理人真皮成纤维细胞，在37℃、5％co2下在培养箱中培养人真皮成纤维细胞72小时。在72小时之后，收集人真皮成纤维细胞的培养上清液，并使用弹性蛋白elisa试剂盒(购自cusabio)测量培养上清液中弹性蛋白合成的量。将弹性蛋白合成的测得量通过用mtt测定试剂盒(购自sigma)测得的人真皮成纤维细胞的最终数目归一化。
103.如图6中所示，与其中用普通外排体处理人真皮成纤维细胞的实验组(2)、其中用使用单独的ifn-γ预处理的外排体处理人真皮成纤维细胞的实验组(3)和其中用使用单独的tnf-α预处理的外排体处理人真皮成纤维细胞的实验组(4)中每一种中的弹性蛋白合成相比，其中根据本发明用使用tnf-α和ifn-γ预处理的外排体处理人真皮成纤维细胞的实验组(5)中的弹性蛋白合成显著提高。
104.因此，可以看出，本发明通过在包含tnf-α和干扰素-γ的组合的培养基中进行培养干细胞的预处理过程，可以显著增强外排体对弹性蛋白合成提高的作用。
105.这些结果表明，根据本发明的用于产生外排体的方法不仅能够改善待从细胞来源的条件培养基中分离的外排体的生产率，而且在增强外排体的生物活性方面，即，在增强外排体对弹性蛋白合成提高的作用方面也是优异的。因此，根据本发明的用于产生外排体的方法适用于产生具有增强的生物活性(例如提高的弹性蛋白合成)的外排体，并且根据该方
法产生的外排体可以有效地用作化妆品组合物中的活性成分以用于皮肤弹性改善、皱纹减少和/或抗衰老。
106.实施例6：经预处理的外排体对弹性蛋白合成提高作用的评价2
107.如下评价在用tnf-α和干扰素-γ(ifn-γ)预处理之后，在用于外排体产生的培养和条件培养基收集过程中使用sfm培养基产生的外排体(以下称为“sfm外排体”)和使用edm培养基产生的外排体(以下称为“edm外排体”)的弹性蛋白合成提高作用(参见图7)。sfm外排体和edm外排体均根据实施例2-2分离。为此，建立了如下实验组：
108.(1)阴性对照组(对照)：其中未用外排体处理人真皮成纤维细胞的实验组；
109.(2)经sfm外排体处理组：其中用浓度为1.09
×
10
11
个颗粒/ml的sfm外排体处理人真皮成纤维细胞的实验组(在图8中用“sfm”表示)；以及
110.(3)经edm外排体处理组：其中用浓度为1.09
×
10
11
个颗粒/ml的edm外排体处理人真皮成纤维细胞的实验组(在图8中用“edm”表示)。
111.将人真皮成纤维细胞悬浮在包含10％生长补充剂和1％青霉素-链霉素的hdf生长培养基(购自cefo co.，ltd.，seoul，korea)中，然后以3.0
×
104个细胞/孔的密度接种到48孔板中，并在37℃、5％co2下在培养箱中培养24小时。
112.此后，根据上述实验组(1)至(3)中的每一种的条件处理人真皮成纤维细胞，并在37℃、5％co2下在培养箱中培养人真皮成纤维细胞72小时。在72小时之后，收集人真皮成纤维细胞的培养上清液，并使用弹性蛋白elisa试剂盒(购自cusabio)测量培养上清液中弹性蛋白合成的量。弹性蛋白合成的测得量通过使用mtt测定试剂盒(购自sigma)测得的人真皮成纤维细胞的最终数目归一化。
113.如图8中所示，与其中用sfm外排体处理人真皮成纤维细胞的实验组(2)中的弹性蛋白合成的量相比，其中用edm外排体处理人真皮成纤维细胞的实验组(3)中的弹性蛋白合成的量显著提高。
114.从这些结果可以看出，在用tnf-α和干扰素-γ(ifn-γ)预处理之后，在用于外排体产生的培养和条件培养基收集过程中使用edm培养基产生的edm外排体具有提高弹性蛋白合成的优异作用。因此，edm外排体优于sfm外排体，因为前者具有更大的与弹性蛋白合成提高相关的生物活性增强，例如，皮肤弹性改善、皱纹减少和/或抗衰老作用。这些具有增强的皮肤弹性改善、皱纹减少和/或抗衰老作用的edm外排体可以经济且有效地以高产率产生，并因此可用于商业和/或临床。
115.因此，根据本发明的具有增强的弹性蛋白合成提高作用的edm外排体可以有效地用作化妆品组合物中的活性成分以用于皮肤弹性改善、皱纹减少和/或抗衰老。
116.尽管已参照一些实施方案描述了本发明，但是本发明的范围不限于这些实施方案。本领域的任何技术人员都将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可进行多种修改和变化，并且这些修改和变化也落入本发明的范围内。