一种用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的LAMP引物组及其检测方法和应用与流程

一种用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的lamp引物组及其检测方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的lamp引物组及其检测方法和应用。


背景技术：

2.橡胶树(hevea brasiliensis)是一种具有重要经济价值的热带林木。全球超过98％的天然橡胶均来源于橡胶树，该产业的健康发展具有重大的战略意义。由胶孢炭疽菌复合群(colletotrichum gloeosporioides)的暹罗刺盘孢菌(c.siamense)和果生刺盘孢菌(c.fructicola)引起的炭疽病是我国橡胶树的主要病害之一，病原物可侵染橡胶树叶、花、枝条等多个组织，造成叶枯、落叶，导致天然橡胶严重减产。胶孢炭疽菌具有潜伏侵染特性，一旦环境条件适宜便能短时间内爆发成灾，造成严重的经济损失，因此亟需开发橡胶树胶孢炭疽菌的早期检测技术。
3.炭疽菌种类繁多，遗传多态性丰富，常规的形态学鉴定方法步骤繁琐且难以鉴定到种，满足不了目前快速、准确、灵敏的鉴定需求。基于实时荧光定量pcr的橡胶树胶孢炭疽菌检测技术虽然灵敏度高、特异性强，但需要昂贵的仪器设备和试剂，不利于基层推广应用。环介导等温扩增技术(loop
‑
mediated isothermal amplification,lamp)是近年发展起来的一种新型检测技术，因具有特异性强、灵敏度高、操作简单、仪器需求低、速度快反应等优点，被广泛应用于微生物快速检测。lamp是一个单步扩增过程，可以避免复杂的dna提纯程序，在植物病原菌的早期检测中有良好的应用潜力。目前lamp技术已成功应用于大豆炭疽病菌c.truncatum、辣椒炭疽病菌c.capsici、草莓炭疽病菌c.gloeosporioides和c.acutatum、番石榴炭疽病菌c.gloeosporioides等炭疽菌的检测，国内外尚未见橡胶树炭疽病菌检测研究的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的lamp引物组；
5.本发明的第二目的在于提供一种用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的试剂盒；
6.本发明的第三目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的检测橡胶树胶孢炭疽菌的方法。本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的lamp引物组，其包括外引物tub
‑
f3、外引物tub
‑
b3、内引物tub
‑
fip和内引物tub
‑
bip，其中，所述外引物tub
‑
f3的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述外引物tub
‑
b3的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述内引物tub
‑
fip的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述内引物tub
‑
bip的核苷酸序列如seq id no.4所示。
7.一种用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的试剂盒，包含所述的lamp引物组。
8.进一步地，所述试剂盒中含包括lamp反应试剂。
9.所述的lamp引物组及所述的试剂盒在检测橡胶树胶孢炭疽菌中的应用。
10.一种检测橡胶树胶孢炭疽菌的方法，它包括以下步骤：
11.s1.提取dna：提取待检测橡胶树胶孢炭疽菌叶片的dna；
12.s2.lamp扩增：将步骤s1提取的dna为模板，用上述的引物组进行lamp扩增；
13.s3.结果判定：扩增结束后加入sybr green i染液进行荧光染色，若反应管呈现绿色判定为阳性，若呈橙色判定为阴性；或者将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若凝胶电泳图为瀑布状梯形条带即为阳性，反之则为阴性。
14.进一步地，步骤s2所述lamp扩增的反应体系为：0.18u
·
μl bst
‑
dna polymerase，4mmol
·
l
‑1mg
2
，1mmol
·
l
‑1dntps，0.6mol
·
l
‑1甜菜碱，1.6μmol
·
l
‑1内引物fip和bip，0.2μmol
·
l
‑1内引物f3和b3，1μl dna，1μl 10
×
bst
‑
dna polymerase buffer，加ddh2o补足10μl。
15.进一步地，所述的lamp扩增在62～64℃条件下进行，反应时间为50～90min。
16.本发明具有以下优点：
17.(1)本发明公开了一种用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的lamp引物组，该引物组以β
‑
tubulin基因设计，可区分胶孢炭疽菌和其他炭疽菌，且未扩增出橡胶树其他病原菌的序列；
18.(2)本发明成功建立了一个特异性强、灵敏度高的橡胶树胶孢炭疽菌lamp检测方法，lamp引物组特异性识别橡胶树胶孢炭疽菌，且对不同的菌株均具有良好的识别能力，说明该引物可用于橡胶树胶孢炭疽菌的种属鉴定；本发明公开的lamp反应体系灵敏度高，可以检测到胶孢炭疽菌1pg的dna和100个孢子，在人工侵染和田间自然发病条件的叶片中均能检出病原菌，故该检测方法可被用于监测橡胶树胶孢炭疽菌从潜伏侵染到发病的生长全过程，大大提高了田间检测的应用范围；
19.(3)与常规pcr技术相比，本发明公开的lamp技术检测橡胶树发病组织中的胶孢炭疽菌具有三个优点：首先，常规pcr技术只在靶标序列两个区域设计一对引物，lamp技术在靶标序列六个区域设计两对引物，大大提高了扩增的特异性；其次，lamp检测方法简单易行，只需1小时即可检测出病原体，且检测结果肉眼可见；最后，lamp技术可直接在含有寄主植物和腐生菌的dna混样中检测出胶孢炭疽菌。因此，该方法可用于检测橡胶树自然发病条件下的胶孢炭疽菌。
附图说明
20.图1为本发明lamp反应体系最适反应温度和反应时间的筛选结果图，其中a为最适反应温度的筛选，b为最适反应时间的筛选，图中a1～a9的温度分别为59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃，66℃和67℃，b1
‑
b8的时间分别为20min，30min，40min，50min，60min，70min，80min和90min，m：100bp dna marker；
21.图2为本发明的lamp反应体系特异性验证结果图，图中：1：c.siamense；2：c.fructicola；3：c.nymphaeae；4：c.laticiphilum；5：c.wanningense；6：c.musae；7：oidium heveae；8：corynespora cassiicola；9：bipolaris bicolor；10：hevea brasiliensis；m：100bp dna marker；
22.图3为不同炭疽菌的lamp引物靶标序列比对结果图；
23.图4为不同省份的胶孢炭疽菌供试菌株进行lamp扩增的结果示意图，图中，1
‑
16菌株来自广东省，17
‑
32菌株来自海南省，33
‑
47菌株来自云南省，ck为清水对照；
24.图5为不同浓度的橡胶树c.siamense菌丝dna和不同孢子浓度的橡胶树c.siamense dna为模板进行lamp扩增的实验结果示意图；
25.其中，a为lamp体系检测橡胶树c.siamense菌丝dna，b为lamp体系检测橡胶树c.siamense孢子dna；图中：m：100bp dna marker。a1～a9：dna浓度分别为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、0fg/μl；b1～b6：孢子浓度分别为104个/μl、103个/μl、102个/μl、1个/μl、0个/μl；
26.图6为本发明lamp体系检测室内侵染叶片的实验结果图，其中，a和c分别为102个/ml和106个/ml孢子悬浮液侵染橡胶树的叶片症状；b和d分别为lamp检测叶片中的胶孢炭疽菌，ck为未侵染的橡胶树叶片；
27.图7为对田间采集无症状和不同病级的叶片进行lamp检测实验结果图，其中，1
‑
24为无症状的橡胶树叶片，25
‑
29为不同病级的橡胶树叶片，30为清水对照。
具体实施方式
28.下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
29.供试材料：供试菌株于2017
‑
2020年采集自中国主要植胶区，单孢分离后经过形态学和分子生物学鉴定，部分菌株信息见表1：
30.表1供试菌株信息
[0031][0032]
病原菌培养及dna提取：将菌块接种于马铃薯葡萄糖(pda)固体培养基上，置于28℃恒温培养箱5
‑
6天后，用载玻片轻轻刮下菌落外围菌丝，利用dna提取试剂盒提取菌株的基因组dna。
[0033]
试剂：hp plant dna mini kit试剂盒购置于美国omega公司；bst dna polymerase large fragment试剂盒、mgcl2、dntps购置于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；甜菜碱、sybr green i核酸染料、golden view i核酸染色剂、琼脂糖购自北京索莱宝科技有限公司。
[0034]
实施例1：用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的lamp引物组的制备
[0035]
以c.siamense和c.fructicolaβ
‑
tubulin基因为靶序列，利用lamp在线软件primer explorer v4(http://primerexplorer.jp/e/)设计出外引物tub
‑
f3和tub
‑
b3，内引物tub
‑
fip和tub
‑
bip，如表2所示。设计的引物由广州天一辉远科技有限公司合成后，用ddh2o溶解后分装保存于
‑
20℃备用。
[0036]
表2用于检测橡胶树胶孢炭疽菌的lamp引物组
[0037][0038]
实施例2：lamp反应体系及反应条件优化
[0039]
2.1反应体系的建立
[0040]
lamp反应体系包括外引物tub
‑
f3和tub
‑
b3、内引物tub
‑
fip和tub
‑
bip、mgso4、dntps、甜菜碱、模板dna、10
×
buffer、bst dna聚合酶，以ddh2o补足10μl。通过对lamp反应体系中各组分浓度的优化，确定用于检测橡胶树炭疽菌的lamp最佳反应体系为：0.18u
·
μl bst
‑
dna polymerase，4mmol
·
l
‑1mg
2
，1mmol
·
l
‑1dntps，0.6mol
·
l
‑1甜菜碱，1.6μmol
·
l
‑1内引物fip和bip，0.2μmol
·
l
‑1内引物f3和b3，1μl dna，1μl 10
×
bst
‑
dna polymerase buffer，加ddh2o补足10μl。
[0041]
2.2反应条件的优化
[0042]
对各反应组份的浓度及时间和温度等反应条件进行优化，其中mgso4浓度分别为1、2、3、4、5、6、7、8mmol
·
l
‑1；dntps浓度分别为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2mmol
·
l
‑1；内外引物浓度比分别为2:1、4:1、6:1和8:1；甜菜碱浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mol
·
l
‑1；bst dna聚合酶分别为0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20u
·
μl
‑1；反应温度分别为59、60、61、62、63、64、65、66℃；反应时间分别为20、30、40、50、60、70、80、90min。每个因子设置3个重复，以确定最佳反应体系及反应条件。扩增反应结束后，加入1μl浓度为1000
×
的sybr green i染液进行荧光染色，观察反应管颜色变化，若反应管呈现绿色判定为阳性，若呈橙色判定为阴性。将反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，如凝胶电泳图为瀑布状梯形条带即为阳性，反之则为阴性。
[0043]
采用上述最佳反应体系进行最适反应温度的筛选。如图1所示，结果表明，在60℃～65℃之间，lamp产物均显示绿色。凝胶电泳结果进一步表明，在62℃～64℃范围内时lamp扩增效率最高，产物条带最亮，因此选择63℃作为lamp体系的最适反应温度(图1a)。
[0044]
采用上述最佳反应体系和最适反应温度进行反应时间的筛选。结果如图1b所示，在所设置的8个反应时间下，在50～90min反应时均可以很好地条带扩增。在反应60min时，条带清晰且加入染色液后产物颜色变化明显，故确定lamp反应时间为60min。
[0045]
实施例3：lamp反应特异性检测
[0046]
利用最优反应体系对供试菌株进行lamp扩增，验证其特异性。反应产物分别经sybr green i染液染色和2％琼脂糖凝胶电泳观察。用优化的lamp反应体系对9种常见的橡胶树病原菌dna进行lamp扩增。结果如图2所示，胶孢炭疽菌复合群下的c.siamense和
c.fructicola lamp产物显示绿色，电泳出现梯形条带，其他供试的7种病原菌及橡胶树lamp产物均显示橙色，电泳未出现条带。通过对比不同炭疽菌的lamp引物靶标序列，发现c.siamense和c.fructicola与其他炭疽菌序列差异较大，如图3所示。使用采自广东、海南和云南省47个橡胶树胶孢炭疽菌菌株的dna，进一步验证lamp检测的地域特异性，发现其扩增产物均显示绿色，如图4所示。综上所述，本发明建立的lamp方法对橡胶树胶孢炭疽菌具有良好的特异性。
[0047]
实施例4：lamp反应灵敏度检测
[0048]
将dna母液进行梯度稀释，使其浓度依次为100ng
·
μl
‑1、10ng
·
μl
‑1、1ng
·
μl
‑1、100pg
·
μl
‑1、10pg
·
μl
‑1、1pg
·
μl
‑1、100fg
·
μl
‑1，分别取1μl作为lamp检测的dna模板，每个浓度梯度设置3个重复。将马铃薯葡萄糖液体培养基(pdb)摇培的分生孢子用血球板计数调节浓度至5
×
106个
·
ml
‑1，取100μl孢子悬浮液进行dna提取，得到50μl dna，取1μl dna按10倍梯度依次稀释后，分别取1μl稀释液作为lamp检测的dna模板，每个浓度梯度设置3个重复，进行lamp扩增，结果如图5所示。
[0049]
以不同浓度的橡胶树c.siamense菌丝dna为模板进行lamp扩增。结果如图5a所示，从1pg
·
μl
‑1至100ng
·
μl
‑1dna的lamp产物均显示绿色，电泳出现梯形条带，说明该lamp反应体系可以检测到1pg的橡胶树c.siamense基因组dna。以不同孢子浓度的橡胶树c.siamense dna为模板进行lamp扩增。结果如图5b所示，从100个
·
μl
‑1至104个
·
μl
‑1孢子dna的lamp产物均显示绿色，电泳出现梯形条带，说明该lamp反应体系可以检测到100个橡胶树c.siamense孢子。
[0050]
实施例5：lamp体系检测室内侵染的叶片中的炭疽菌
[0051]
分别取100ml的102个
·
ml
‑1和106个
·
ml
‑1孢子悬浮液加入1ml 0.6％的吐温80制成接种液。选取橡胶树淡绿期的健康叶片，用喷壶将孢子悬浮液均匀喷洒到叶片两面，直到液滴从叶片上滴落，后放在垫好亲水棉花的塑料盒中，置于28℃、湿度100％的人工气候箱中培养2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h和72h时取出叶片，拍照记录病程后，清水冲洗干净叶片并提取dna进行lamp检测，结果如图6所示。
[0052]
102和106个
·
ml
‑1孢子悬浮液侵染橡胶树叶片后，发病时间分别为48h和12h，如图6所示(图6a、b)。lamp体系可检测出全部发病叶片中的炭疽菌，同时可检测出接种102个
·
ml
‑1孢子24h和接种106个
·
ml
‑1孢子2h的叶片中的炭疽菌(图6c、d)，说明该检测体系可监测橡胶树胶孢炭疽菌潜伏侵染到发病的生长全过程。
[0053]
实施例6：田间样本检测
[0054]
2021年3月于炭疽病流行期采集海南省儋州市五队苗圃的具有炭疽病疑似症状的橡胶树叶片29份，其中24份为疑似无症状叶片，5份为不同发病等级的病叶。提取样本dna进行lamp检测，同时对病株发病部位按照常规组织分离法进行病菌分离验证，如图7所示。
[0055]
田间采集无症状橡胶树叶片和不同病级的叶片进行lamp检测。在24个无症状的橡胶树叶片中，有4个叶片的lamp产物显示绿色。5个不同发病等级的叶片lamp产物均显示绿色，进一步采用组织分离法成功地分离到了这些叶片中的胶孢炭疽菌，表明本研究建立的lamp检测体系具有高灵敏度和准确率，可用于田间检测处于潜伏侵染期和发病期的橡胶树胶孢炭疽菌。
[0056]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，
任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。