一种抗旋毛虫小热休克蛋白卵黄抗体及制备方法和用途与流程

一种抗旋毛虫小热休克蛋白卵黄抗体及制备方法和用途
1.技术领域：本发明提供了一种抗旋毛虫小热休克蛋白卵黄抗体，涉及抗旋毛虫与lewis 肺癌相关基因蛋白抗原shsps的卵黄抗体，特别是公开了抗旋毛虫与lewis 肺癌相关基因蛋白抗原shsps的鸡卵黄抗体及制备方法；同时还提供了卵黄抗体在抗肿瘤中的医用用途，属生物医药技术领域。
2.

背景技术：
旋毛虫（trichinella spiralis）是一种成虫寄生于哺乳动物小肠和幼虫寄生于肌肉组织中的人兽共患寄生虫。目前研究发现旋毛虫除能引起旋毛虫病外，旋毛虫感染还能提高宿主抗肿瘤的能力。目前，有关旋毛虫与癌细胞相关基因蛋白抗原多抗和单抗卡抗肿瘤作用已有一些相关研究报道，发现旋毛虫与肿瘤相关基因蛋白抗原的多抗和单抗对肿瘤细胞有抑制作用，且针对这些相关蛋白抗原制备的鼠源血清和单克隆抗体均在小鼠动物实验中取得了一定的抗肿瘤效果，但上述使用的抗体均为注射使用，临床推广应用存在较大困难。尚无利用旋毛虫与肿瘤相关基因蛋白抗原的禽卵黄抗体口服用于癌症防治的报道。
3.

技术实现要素：
本发明提供了一种抗旋毛虫小热休克蛋白（small heat shock protein，shsps）鸡卵黄抗体及制备方法，具有使用方便、成本低、安全无毒、便于大规模工厂化生产等优点。
4.本发明进一步公开了旋毛虫小热休克蛋白（shsps）鸡等禽类卵黄抗体的用途，具有增强动物免疫力、无毒、无害特点，可作为口服制剂用于肿瘤的治疗，同时也可制做成口服液等做为食品用于预防肿瘤。
5.本发明所述的旋毛虫与lewis 肺癌相关基因蛋白抗原shsps的基因序列，如seq no.1所示。
6.本发明公开的旋毛虫与lewis 肺癌相关蛋白基因shsps具有以下表征：该基因登录号为dq986457.1，编码小热休克蛋白（shsps），开放阅读框498bp，编码165个氨基酸，等电点6.62，分子量约19kda。
7.本发明所说的一种抗旋毛虫小热休克蛋白（shsps）鸡卵黄抗体，具有以下表征：1、sds-page检测发现该卵黄抗体重链约为68kda，轻链约为38kda;2、elisa和western blot检测发现，该卵黄抗体可与shsps发生反应。
8.本发明所说的一种旋毛虫小热休克蛋白（shsps）鸡卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：1）根据旋毛虫小热休克蛋白特异性基因序列设计一对引物；上游引物：5
’-
atggccttgactgcgtggtataatc-3’；下游引物：5
’-
tcatctcttctgagcagccggagc-3’；2）以旋毛虫肌幼虫cdna为模板，对shsps基因进行pcr扩增，与克隆载体pmd-18t连接（pmd-18t-shsps）；3）经测序后，分别双酶切pmd-18t-shsps和空载体pet-32a( )，用t4 dna连接酶连接，胶回收pmd-18t-shsps和pet-32a( )后，转化bl-21（de3）；
4）对测序正确的重组菌用iptg诱导表达，收集菌体超声破碎后取上清，经镍柱亲和层析法纯化；bca法测浓度后免疫罗曼母鸡，收集鸡蛋，分离蛋黄，采用梯度peg6000法分离纯化卵黄抗体获得。
9.本发明所述的一种旋毛虫小热休克蛋白（shsps）鸡卵黄抗体在防治肿瘤药物中的医用用途。
10.本发明所述的一种旋毛虫小热休克蛋白（shsps）鸡卵黄抗体在防治肺癌药物中的医用用途。
11.下述的药理试验证实了抗旋毛虫shsps卵黄抗体具有显著的抑制肿瘤生长的作用，可以作为防治肿瘤的制剂被应用：将c57小鼠接种lewis 肺癌细胞12d后随机分成2组，每组6只。按每组100μg的剂量进行灌胃治疗，其中免疫前卵黄抗体组：100μg；抗shsps卵黄抗体组：100μg。连续处理15d，最后一次处理后的第3d，分离血清检测细胞因子，并麻醉处死小鼠，分离肿瘤组织，测量体积和重量。并用spss 23.0软件进行分析。同时取部分小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织福尔马林固定，he染色。通过对各组小鼠肿瘤的体积和重量分析计算抑瘤率，结果发现抗shsps卵黄抗体的抑制率为44.80%。细胞因子检测发现，抗shsps卵黄抗体能显著增加ifn-γ、il-2和tnf-α的水平。各组小鼠组织器官he染色结果显示，抗shsps卵黄抗体并未引起病理损伤。
12.本发明的积极效果在于：提供了一种抗旋毛虫小热休克蛋白（shsps）鸡卵黄抗体，同时还公开了卵黄抗体在抗肿瘤中的医用用途；具有增强动物免疫力、无毒等特点，可作为口服制剂药物用于肿瘤的治疗，同时也可制成口服液等做为食品用于预防肿瘤；鸡等禽类卵黄抗体可口服、使用方便、无毒、成本低、安全、便于大规模工厂化生产。
13.附图说明：图1为本发明旋毛虫shsps的sds-page分析电泳图（m.蛋白marker 1.纯化后的shsps）；图2为本发明旋毛虫shsps western blot分析电泳图（m.蛋白marker 1.纯化后的shsps）；图3为本发明抗shsps卵黄抗体sds-page分析电泳图（m.蛋白marker 1.anti-shsps igy 2.免疫前对照）；图4为本发明抗shsps卵黄抗体western blot分析电泳图（上图m.蛋白marker 1.2.3.anti-shsps igy 下图.免疫前对照）；图5为本发明各组小鼠组织器官he染色图。
14.具体实施方式：为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
15.实施例1：旋毛虫与lewis 肺癌相关抗原基因shsps表达根据旋毛虫小热休克蛋白（shsps）特异性基因序列（dq986457.1）设计引物，其引物的核苷酸序列为：上游引物：5
’-
atggccttgactgcgtggtataatc-3’；下游引物：5
’-
tcatctcttctgagcagccggagc-3’；
酶切位点分别为：ggatcc(bamhⅰ)；gtcgac(salⅰ)；以旋毛虫肌幼虫cdna为模板，对shsps基因进行pcr扩增并与克隆载体pmd-18t连接命名为pmd-18t-shsps，经测序验证后，分别双酶切pmd-18t-shsps和空载体pet-32a( )，用t4 dna连接酶连接胶回收后的pmd-18t-shsps和pet-32a( )，最后转化bl-21（de3），对测序正确的重组菌用iptg诱导表达，收集菌体超声破碎后取上清，备用；旋毛虫与lewis 肺癌相关抗原shsps的纯化取上述制备的上清，经镍柱亲和层析法纯化，bca法测定浓度，取50μl 纯化样品制样后进行sds-page及western blot鉴定，结果见图1、2；其它样品-20℃保存；抗shsps的卵黄抗体的提取及纯化将上述旋毛虫shsps按500μg/只的剂量与等体积福氏完全佐剂混合乳化，大腿外侧和后胸部多点免疫。第一次免疫14d后，用250μg shsps与等体积福氏不完全佐剂混合后加强免疫，共加强免疫3次，每次间隔10d；第一次后7d开始收集鸡蛋，4℃保存；将鸡蛋用75%酒精擦拭表面。破碎蛋壳分离出蛋黄，刺破卵黄膜，收集蛋黄。将蛋黄与5倍体积的pbs混合，4℃静置30min后，加入3.5%peg6000，静置10min，4℃，8000r/min 离心30min，取上清用纱布过滤后加入8.5% peg6000，静置10min，4℃，8000r/min 离心30min，弃去上清，沉淀用pbs溶解并加入12% peg6000，静置10min，4℃，8000r/min 离心30min，pbs溶解沉淀即为igy，用3kda超滤管进行脱盐及浓缩。bca法测浓度后于-20℃保存。
16.试验例1抗shsps卵黄抗体的效价及鉴定将实施例1制备的shsps按1μg/孔的量包被，4℃过夜，用200μl pbst洗涤3次，使用100μl pbst溶解的5%脱脂奶粉于37℃封闭2h，洗涤后加入倍比稀释的igy于37℃孵育2h，洗涤后加入100μl 兔抗鸡igg（1：500），37℃孵育45min，洗涤后加100μl tmb显色液，孵育15min，加入100μl终止液，酶标仪读取od450值。结果发现第四次免疫后，抗shsps卵黄抗体的效价可达到1：102400（表1）：表1.抗shsps卵黄抗体效价（od450）分别取实施例1制备的50μl 免疫前igy和抗shsps igy制样，进行sds-page及考马斯亮蓝染色，见图3。
17.将实施例1制备的20μg shsps进行sds-page并转到pvdf膜上，用tbst溶解的5%脱脂奶粉室温封闭2h，分别以免疫前igy、抗shsps igy（1：500）作为一抗4℃孵育过夜，tbst洗涤3次，然后室温孵育兔抗鸡igg（1：500）45min，洗涤2h，滴加ecl发光液于膜上并用化学发光凝胶成像仪观察，见图4。
18.试验例2抗shsps卵黄抗体抗肿瘤试验将2
×
10
6 lewis 肺癌细胞接种c57 小鼠12d后随机分成2组，每组6只。按每组100μg的
剂量进行灌胃治疗，其中免疫前卵黄抗体组：0.1ml（100μg）；抗shsps卵黄抗体组：0.1ml。连续用卵黄抗体处理15d，最后一次用卵黄抗体后第3d，采血分离血清。后麻醉处死小鼠，分离肿瘤组织，称量重量，并测量体积。另取小鼠心、肝、脾、肺、肾各脏器组织进行福尔马林固定备用。所有数据使用spss 23.0软件分析。试验结果见表2：表2. 各组小鼠体内肿瘤体积和重量
组别数量肿瘤体积（mm3）/抑制率肿瘤肿瘤（g）/抑制率免疫前igy6386.47
±
27.40（5.33%）1.45
±
0.07（5.84%）抗shspsigy6225.33
±
30.56***（44.80%）0.86
±
0.05***（44.16%）
*p《0.05，** p 《0.01， ***p 《0.001。
19.结论：通过对各组小鼠肿瘤的重量和体积统计分析，计算各组抑瘤率，结果发现抗shsps卵黄抗体能明显抑制肿瘤生长，抑瘤率为44.80%，与免疫前卵黄抗体对照组比较差异极显著 (p 《0.001)；试验例3抗shsps卵黄抗体对细胞因子影响及安全性评价对试验例2获得的小鼠血清利用商品化细胞因子检测试剂盒进行检测。结果发现抗shsps卵黄抗体增加了ifn-γ、il-2、tnf-α的表达水平；结果见表3。
20.表3. 抗shsps卵黄抗体对荷瘤小鼠细胞因子的影响
组别ifn-γtnf-αil-2il-4il-10免疫前igy44.83
±
7.8169.57
±
5.22241.38
±
8.29180.56
±
9.22166.71
±
8.24抗shspsigy57.64
±
7.72**81.2
±
3.84*259.50
±
7.02*177.36
±
6.72169.13
±
10.97
*p《0.05， ** p 《0.01，***p 《0.001。
21.结论：对试验例2获得的各组小鼠心、肝、脾、肺、肾等福尔马林固定组织按常规方法进行he染色，观察卵黄抗体对机体组织器官的病理损伤作用，结果发现免疫前igy、shsps卵黄抗体组均未发现明显的病理损伤，即制备的抗旋毛虫shsps卵黄抗体不会对机体产生病理损伤，如图5所示。