一种杜仲水提物诱导PC12细胞向神经元样细胞分化的方法与流程

一种杜仲水提物诱导pc12细胞向神经元样细胞分化的方法
技术领域
1.本发明属于细胞转分化技术领域，公开了一种杜仲水提物诱导pc12细胞向神经元样细胞分化的方法。


背景技术：

2.杜仲（学名eucommia ulmoides oliver）又名胶木，为杜仲科植物。杜仲游离氨基酸极少，含有的少量蛋白质，是和绝大多数食品类似的完全蛋白，即能够水解检出对人体必需的8种氨基酸。
3.药用杜仲为杜仲的干燥树皮。杜仲水提物主要成分有木脂素类、多糖类、环烯醚萜类、黄酮类、绿原酸、多酚及氨基酸等，具有增强免疫力、抗癌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗肝纤维化及镇静等药理作用。近年来有研究表明杜仲中的化学成分具有神经保护作用，治疗中枢神经系统疾病和退行性疾病的成方中均含有杜仲。
4.pc12细胞是一个常用的神经细胞株，它来源于褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，形态多呈圆形，半贴壁生长，广泛用于神经系统疾病的体外研究。在特定条件下，pc12细胞可被神经生长因子（ngf）诱导为神经元样细胞，胞体由较小的圆形变为较大的多边形，伸出突起，并表达神经丝蛋白（nf-h）。pc12细胞是目前广泛用于研究神经细胞分化及凋亡的细胞模型，研究药物对pc12 细胞的促分化作用是神经药理学中证明药物具有神经可塑性的有力证据。
5.目前，杜仲水提物对神经系统疾病的治疗作用已被公认，但是否像ngf一样具有神经元营养和促进突起生长等功能，是否能诱导pc12细胞分化为神经元样细胞并未见报道。


技术实现要素：

6.本发明发现杜仲水提物具有诱导pc12细胞向神经元样细胞分化的作用，公开了一种杜仲水提物诱导pc12细胞向神经元样细胞分化的方法。
7.目为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：（1）杜仲诱导培养基配制；（2）pc12细胞复苏及传代培养；（3）杜仲诱导培养基诱导培养pc12细胞向神经元样细胞分化。
8.所述步骤（1）的操作为：按4mg/ml剂量用基础培养基溶解杜仲水提物，超声震荡30min以充分混匀。在超净台无菌条件下，用0.22μm滤器过滤，加5%~8% 胎牛血清配制成杜仲诱导培养基。
9.所述步骤（2）的操作为：取出液氮冻存的pc12细胞，置37 ℃水浴锅溶解复苏，1000转离心5min，弃去冻存液，加完全培养基重悬细胞，接种在培养皿中，5%co2，37 ℃培养1-2d。待细胞增殖贴壁至80%-90%左右时，用1000ml移液枪机械吹打下贴壁细胞，完全培养基重悬后，1:4传代培养。
10.所述步骤（3）的操作为：传至第三代pc12细胞，吸弃原完全培养基，更换为上述步
骤（1）所述的杜仲诱导培养基，培养3-4天。显微镜下可见pc12发生分化，细胞由圆形变为多边形，胞体变大，突起逐渐变多并伸长，分化为神经元样细胞。
11.所述杜仲水提物为杜仲树皮水提物干燥粉。
12.所述基础培养基为25mm高糖dmem，ph值为7.4。
13.所述完全培养基为25mm高糖dmem加5%胎牛血清和5%马血清。
14.本发明的有益效果在于：本发明提出杜仲水提物可以诱导pc12细胞分化为神经元样细胞，提供了杜仲水提物诱导pc12细胞分化的具体剂量、培养基成分及诱导时间。相比较已有的一些研究，本发明不需要在培养基添加ngf，仅依靠含特定浓度的杜仲水提物培养基就能使pc12细胞分化为神经元样细胞，并表达神经丝蛋白。杜仲诱导pc12细胞分化为神经元样细胞，可广泛作为神经生物学、药理学及毒理学研究的模型，为中药诱导pc12细胞分化提供了新思路。本发明为杜仲的神经营养功能及促进突触生长等生物活性功能提供了有力依据，对进一步开发利用杜仲这一宝贵资源及探讨杜仲生物活性作用具有深远的现实意义。
附图说明
15.图1为杜仲诱导前后pc12细胞形态对比图。a为普通完全培养基培养4d的pc12细胞；b为杜仲诱导培养基培养4d的pc12细胞。
16.图2为杜仲诱导前后pc12分化为神经元样细胞的nf-h免疫荧光表达。a为普通完全培养基培养4d的pc12细胞，不表达nf-h；b—d分别为杜仲诱导培养基培养2-4天，nf-h的表达情况。
具体实施方式
17.材料：pc12细胞，由西北农林科技大学动物医学院神经生物学实验室冻存。杜仲树皮水提物干燥粉购于陕西全昌荣生物科技有限公司；25mm高糖dmem、胎牛血清、马血清购于美国gibco公司；兔抗鼠nf-h抗体购于美国cell signaling technology 公司；dapi购于sigma公司。
18.完全培养基的配制：25mm高糖dmem 40ml，加5%胎牛血清和5%马血清，置于50ml无菌离心管备用。
19.杜仲诱导培养基配制：按4mg/ml剂量用25mm高糖dmem溶解杜仲水提物，超声震荡30min以充分混匀。在超净台无菌条件下，用0.22μm滤器过滤至50ml无菌离心管中，加5%~8% 胎牛血清，标记备用。
20.pc12细胞培养及成神经诱导：取出液氮冻存的pc12细胞，置37 ℃水浴锅溶解复苏，1000转离心5min，弃冻存液，加完全培养基重悬细胞，接种在培养皿中，5%co2，37 ℃培养1-2d。待细胞增殖贴壁至80%-90%左右时，用1000ml移液枪机械吹打下贴壁细胞，完全培养基重悬后1:4传代培养。取第三代细胞，以每孔103个细胞接种于24孔培养板中，贴壁培养过夜。次日，吸弃原完全培养基，更换为杜仲诱导培养基，培养3-4天。显微镜下每日观察pc12形态变化。
21.杜仲诱导的pc12细胞形态学变化：普通完全培养基培养4d的未分化pc12细胞，形态多呈圆形，胞体较小，几乎无突起伸出（图1a）。杜仲诱导培养基培养的pc12细胞，随着诱
导时间的增长，细胞逐渐开始分化，细胞由圆形变为多边形，胞体变大、伸出突起，诱导4d可明显观察到细胞突起逐渐变多并伸长，互相连接成网，分化为具有神经细胞形态特征的神经元样细胞（图1b）。
22.pc12 细胞nf-h免疫荧光标记：4％多聚甲醛溶液室温固定细胞30min，pbs浸洗3次；0.3%的triton透膜5min，pbs浸洗3次（每次3min）；正常山羊血清封闭，室温孵育20min，吸弃山羊血清；滴加1：500的兔抗大鼠神经丝蛋白-h（nf-h）抗体，4℃孵育过夜。次日，吸弃一抗，pbs浸洗3次（每次3min），滴加1：400的fitc标记山羊抗兔二抗，室温孵育1h，吸弃二抗，pbs浸洗3次（每次3min）；10
µ
g/ml dapi复染细胞核10min，pbs洗3次，荧光显微镜下观察摄像。
23.通过对普通完全培养基及杜仲诱导培养基诱导1-3天的pc12细胞nf-h免疫荧光标记可发现：普通完全培养基培养的pc12细胞不能自行分化，不表达神经元特异抗体nf-h（图2a）。杜仲诱导培养基培养的pc12细胞，诱导第2天，已有少量细胞分化为神经元样细胞并表达nf-h；诱导第3天部分细胞强阳性表达nf-h，多数细胞弱阳性表达nf-h；诱导第4天约90%以上的细胞强阳性表达nf-h，并可见细长的突起（图2b、c、d）。
24.权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。实施例只起到示范作用，没有绝对的限制性，所有使用到的试剂范围均由所附权利要求限定。本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。