一种抗CD22抗体及其应用的制作方法

一种抗cd22抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种抗cd22抗体及其应用。


背景技术：

2.b细胞急性淋巴细胞白血病(b cell acute lymphoblastic leukemia，b-all)是一种侵袭性血液系统恶性肿瘤，其特征是cd19

b细胞前体的克隆扩增。b-all是儿童中最常见的恶性肿瘤之一，在成人中虽然较为少见，但是却有不良的预后。尽管超过90％的患者在一线治疗后得到完全缓解，但难治/复发(r/r)b-all患者的预后较差。
3.过继转移经过改造以表达靶向肿瘤细胞表面相关抗原的人工嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptort cells，car-t)是一种革命性的癌症免疫细胞疗法。目前，cd19 car-t疗法是b-all的理想细胞疗法之一，cd19在恶性细胞上均匀表达，而其脱靶表达仅限于正常b细胞，并且cd19 car-t导致的b细胞发育不全在临床上通过使用γ-免疫球蛋白很容易得到控制。cd19 car-t彻底改变了r/r b-all的治疗，完全缓解率达到80％～90％；然而，40％～60％接受cd19靶向免疫疗法治疗的患者在1年后仍会复发。复发类型主要分为两种：一种仍为cd19

的复发，通常是t细胞功能差或car-t细胞持续时间短；另外一种为cd19的复发，其疾病复发时伴随着细胞表面cd19表达的丢失，代表了一种新的“干细胞起源相关”的肿瘤逃逸机制。
4.car-t治疗b-all的另外一个有希望的靶点是cd22。cd22是一种唾液酸结合粘附分子，其表达主要局限于b细胞，并在大多数b细胞恶性肿瘤中高表达。cd22靶向免疫疗法已在多项研究中得到开发和测试，如cn111320703a公开了一种靶向cd22的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体序列选自如下两种结构中的一种，第一种结构：cd22抗原结合结构域与t细胞受体(tcr)的恒定结构域；第二种结构：顺序串联的跨膜蛋白信号肽、cd22抗原结合结构域、cd8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1bb共刺激结构域与cd3ζ胞内信号传导结构域；此外，在一项针对cd19 car-t治疗后出现疾病进展的儿童和年轻成人b-all患者的研究中，cd22 car-t可诱导73％的完全缓解率，其对cd19

和cd19-b-all的有效性相同。但是复发也很常见，一部分患者的复发与cd22表达下调相关。因此，r/r b-all在临床上仍然具有挑战性。
5.综合上述，针对r/r b-all开发高效的car-t疗法，对于b-all治疗领域具有重要意义。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种抗cd22抗体及其应用，所述抗cd22抗体具备高亲和力和特异性，能够高效靶向cd22，以抗cd22抗体为抗原结合结构域构建的car-t细胞能够高效靶向肿瘤细胞cd22，从而介导免疫细胞杀伤肿瘤细胞。
7.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种抗cd22抗体，所述抗cd22抗体包括重链可变区，所述重
链可变区的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.1或seq id no.2所示的序列，所述重链可变区的cdr2的氨基酸序列包括seq idno.3或seq id no.4所示的序列，所述重链可变区的cdr3的氨基酸序列包括seq id no.5或seq id no.6所示的序列。
9.本发明筛选抗cd22抗体，所述抗cd22抗体仅包括重链可变区具备高亲和力和特异性，能够高效靶向cd22抗原，结构简单，易于制备，在制备以cd22为靶点的药物领域具有重要应用价值。
10.seq id no.1：gdthssyc。
11.seq id no.2：gytnsrry。
12.seq id no.3：vdsdgkq。
13.seq id no.4：iytgdgdsrt。
14.seq id no.5：aaapwcyreaedfti。
15.seq id no.6：aadvwyhgdwndpklypy。
16.优选地，所述重链可变区的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.1所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.3所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.5所示的序列。
17.优选地，所述重链可变区的cdr1的氨基酸序列包括seq id no.2所示的序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.4所示的序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.6所示的序列。
18.优选地，所述重链可变区还包括框架区fr1-fr4。
19.优选地，所述fr1的氨基酸序列包括seq id no.7或seq id no.8所示的序列。
20.优选地，所述fr2的氨基酸序列包括seq id no.9或seq id no.10所示的序列。
21.优选地，所述fr3的氨基酸序列包括seq id no.11或seq id no.12所示的序列。
22.优选地，所述fr4的氨基酸序列包括seq id no.13所示的序列。
23.优选地，所述重链可变区的氨基酸序列包括seq id no.14或seq id no.15所示的序列。
24.seq id no.7：evqlvesggdsvqpggslrlscavs。
25.seq id no.8：evqlvesggasvqaggsltlscaas。
26.seq id no.9：lawfrqapgkeregvaf。
27.seq id no.10：mawfrqtpgkeregvay。
28.seq id no.11：
29.ihadsvkgrftgsrdntkntlflqmdslqledtamyyc。
30.seq id no.12：
31.yyadsvkgrftisrdnakgtvnlqmnslqpgdsamyyc。
32.seq id no.13：wgqgtqvtvss。
33.seq id no.14：
34.evqlvesggdsvqpggslrlscavsgdthssyclawfrqapgkeregvafvdsdgkqihadsvkgrftgsrdntkntlflqmdslqledtamyycaaapwcyreaedftiwgqgtqvtvss。
35.seq id no.15：
36.evqlvesggasvqaggsltlscaasgytnsrrymawfrqtpgkeregvayiytgdgdsrtyyadsvkg
rftisrdnakgtvnlqmnslqpgdsamyycaadvwyhgdwndpklypywgqgtqvtvss。
37.本发明将所述抗cd22抗体的编码基因插入表达载体，得到重组表达载体，将所述重组表达载体导入细胞并进行培养，进行分离纯化，得到所述抗cd22抗体。
38.第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子包括第一方面所述的抗cd22抗体的编码基因。
39.优选地，所述核酸分子包括seq id no.16或seq id no.17所示的序列。
40.seq id no.16：
41.gaagtgcagctggtggaatctggcggcgatagcgtgcagcctggcggcagcctgagactgagctgtgccgtgagcggcgatacccatagcagctattgtctggcctggtttagacaggcccctggcaaagaaagagaaggcgtggcctttgtggattccgatggaaaacagattcatgccgatagcgtgaaaggccggtttaccggctccagagataataccaaaaataccctgtttctgcagatggatagcctgcagctggaagataccgccatgtattattgtgccgccgccccttggtgttatagagaagccgaagattttaccatttggggccagggcacccaggtgaccgtgagcagc。
42.seq id no.17：
43.gaggtgcagctggtggagagcggcggcgccagcgtgcaggccggcggcagcctgaccctgagctgtgctgcctctggatacacaaattctagaagatatatggcctggtttagacagaccccaggaaaagagagagaaggcgtggcttatatctatacaggcgatggagattctagaacatattatgccgatagcgtgaagggcagattcacaattagcagagacaacgccaagggcaccgtgaacctgcagatgaacagcctgcagcccggcgacagcgccatgtactactgcgccgccgacgtgtggtaccacggcgactggaacgacccaaagctgtacccctactgggggcagggcacccaggtgaccgtgagcagc。
44.本发明所述的核酸分子能够准确编码第一方面所述的抗cd22抗体。
45.第三方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和信号转导结构域，所述抗原结合结构域第一方面所述的抗cd22抗体。
46.本发明中，利用所述抗cd22抗体构建嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体能够高效靶向cd22。
47.优选地，所述信号肽包括cd8α信号肽。
48.优选地，所述抗原结合结构域还同时包括抗cd19抗体。
49.优选地，所述抗原结合结构域包括抗cd19抗体和抗cd22抗体依次串联构成的抗原结合结构域或抗cd22抗体和抗cd19抗体依次串联构成的抗原结合结构域。
50.优选地，所述铰链区包括cd8α铰链区；
51.优选地，所述跨膜区包括cd8α跨膜区、cd28跨膜区或dap10跨膜区中的任意一种或至少两种的组合；
52.优选地，所述信号转导结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序；
53.优选地，所述信号转导结构域还包括共刺激分子，所述共刺激分子包括4-1bb、cd28胞内区、ox40、icos或dap10胞内区中的任意一种或至少两种的组合
54.优选地，所述嵌合抗原受体还包括cd3ε或cd3γ。
55.优选地，所述信号肽的氨基酸序列包括seq id no.18所示的序列。
56.优选地，所述cd8α铰链区和跨膜区的氨基酸序列包括seq id no.19所示的序列。
57.优选地，所述免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列包括seq id no.20所示的序
列。
58.优选地，所述cd3ε的氨基酸序列包括seq id no.21所示的序列。
59.优选地，所述cd3γ的氨基酸序列包括seq id no.22所示的序列。
60.优选地，优选地，所述嵌合抗原受体包括抗cd19抗体和cd3ε融合得到的第一条肽链及抗cd22抗体和cd3γ融合得到的第二条肽链，或所述嵌合抗原受体包括抗cd22抗体和cd3ε融合得到的第一条肽链及抗cd19抗体和cd3γ融合得到的第二条肽链。
61.第四方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包括第三方面所述的嵌合抗原受体的编码基因。
62.优选地，所述表达载体为含有第三方面所述的嵌合抗原受体的编码基因的慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。
63.第五方面，本发明提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒含有第四方面所述的表达载体。
64.本发明中，所述重组慢病毒由转染第四方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞制备得到。
65.第六方面，本发明提供一种嵌合抗原受体免疫细胞，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达第三方面所述的嵌合抗原受体。
66.本发明利用所述抗cd22抗体制备嵌合抗原受体，并进一步制备嵌合抗原受体免疫细胞，所述嵌合抗原受体免疫细胞能够特异性识别cd22和/或cd19阳性肿瘤细胞，并进行高效杀伤，同时还能释放多种细胞因子包括il-2、tnf-α和ifn-γ因子等发挥细胞杀伤作用。
67.优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括第四方面所述的表达载体和/或第五方面所述的重组慢病毒。
68.优选地，所述免疫细胞包括t淋巴细胞、b淋巴细胞、nk细胞、肥大细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合。
69.第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第六方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞。
70.优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
71.第八方面，本发明提供第一方面所述的抗cd22抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的嵌合抗原受体、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组慢病毒、第六方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞或第七方面所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
72.优选地，所述肿瘤包括b细胞急性淋巴细胞白血病。
73.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
74.(1)本发明的抗cd22抗体仅包括重链可变区具备高亲和力和特异性，能够高效靶向cd22抗原，且结构简单，易于制备；
75.(2)本发明中，利用所述抗cd22抗体构建嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体能够高效靶向cd22，此外，抗原结合结构域可同时采用抗cd22抗体和抗cd19抗体，从而制备能够同时靶向cd22和cd19的嵌合抗原受体；
76.(3)本发明的嵌合抗原受体细胞能够特异性识别cd22和/或cd19阳性肿瘤细胞，并进行高效杀伤，同时还能释放多种细胞因子包括il-2、tnf-α和ifn-γ因子等发挥细胞杀伤
作用。
附图说明
77.图1a为biacore检测抗cd22抗体(cd22-28)的亲和力结果图；
78.图1b为biacore检测抗cd22抗体(cd22-29)的亲和力结果图；
79.图2为facs检测抗cd22抗体识别细胞表面的cd22抗原结果图；
80.图3a为表达cd22嵌合抗原受体的慢病毒载体(hd sin03 cd22(v28)41bbz(ka))质粒图谱；
81.图3b为表达cd22嵌合抗原受体的慢病毒载体(hd sin03 cd22(v29)41bbz(ka))质粒图谱；
82.图3c为表达cd22嵌合抗原受体的慢病毒载体(hd sin03 cd19-cd22(v28)41bbz(ka))质粒图谱；
83.图3d为表达cd22嵌合抗原受体的慢病毒载体(hd sin03 cd19-cd22(v29)41bbz(ka))质粒图谱；
84.图3e为表达cd22嵌合抗原受体的慢病毒载体(hd sin03 cd22(v28)-cd19-41bbz(ka))质粒图谱；
85.图3f为表达cd22嵌合抗原受体的慢病毒载体(hd sin03 cd22(v29)-cd19-41bbz(ka))质粒图谱；
86.图3g为表达cd22嵌合抗原受体的慢病毒载体(hd sin03 cd19-cd3ε-t2a-cd22(v28)-cd3γ(ka))质粒图谱；
87.图3h为表达cd22嵌合抗原受体的慢病毒载体(hd sin03 cd19-cd3ε-t2a-cd22(v29)-cd3γ(ka))质粒图谱；
88.图4a为cd22嵌合抗原受体(抗原结合结构域仅含cd22抗体)的结构示意图；
89.图4b为cd22嵌合抗原受体(cd19抗体在cd22抗体之前)的结构示意图；
90.图4c为cd22嵌合抗原受体(cd19抗体在cd22抗体之后)的结构示意图；
91.图4d为cd22嵌合抗原受体(cd19抗体在cd22抗体之前，且二者中间连接有cd3ε-t2a)的结构示意图；
92.图5为car-t细胞中嵌合抗原受体表达率图；
93.图6a为本发明car-t细胞对k562-luci细胞杀伤效果图；
94.图6b为本发明car-t细胞对k562-cd19-luci细胞杀伤效果图；
95.图6c为本发明car-t细胞对k562-cd22-luci细胞杀伤效果图；
96.图6d为本发明car-t细胞对k562-cd19-cd22-luci细胞杀伤效果图；
97.图7为car-t细胞的il-2细胞因子分泌水平图；
98.图8为car-t细胞的tnf-α细胞因子分泌水平图；
99.图9为car-t细胞的ifn-γ细胞因子分泌水平图。
具体实施方式
100.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非
对本发明的限定。
101.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
102.本发明中利用噬菌体展示技术对cd22免疫过的羊驼vhh免疫文库进行筛选，从而获得了高亲和力的抗cd22的纳米抗体。
103.实施例1
104.本实施例构建噬菌体纳米抗体库并进行淘选与elisa初步筛选。
105.1、噬菌体纳米抗体库的构建
106.(1)采用表达胞外区的cd22-fc免疫双峰驼，elisa验证效价后，抽取200ml外周血；
107.(2)分选淋巴细胞，获得外周血单核淋巴细胞沉淀，提取rna；
108.(3)用iii反转录酶以rna为模板合成第一链cdna，然后利用巢式pcr扩增vhh基因；
109.(4)将vhh基因插入pmecs噬菌体展示载体，电转化tg1感受态细胞后，取菌液进行文库鉴定，剩余所有培养物均匀涂布于lb/ampglu平板，待菌长出后收集菌苔，加入1/3体积的50％甘油，混匀分装，-80℃保存，成功构建了库容大于109的噬菌体展示骆驼vhh免疫文库。
110.2、噬菌体纳米抗体库的淘选
111.将纯化的cd22-his重组蛋白用pbs缓冲液稀释至4μg/ml，取96孔酶标板，选择3复孔，每孔加入100μl(400ng/孔)，4℃包被过夜，pbs作为阴性对照；弃去包被液，每孔加入150μl 2％浓度脱脂内粉，25℃封闭1h；用pbst洗涤4次，取制备好的噬菌体溶液，用2％脂奶粉，稀释至5
×
1011pfu/ml，加入酶标板，100μl/孔，25℃孵育2h；弃去噬菌体样品，用pbst洗涤10次，再用pbs洗涤5次，每孔加入100μl新鲜配制的0.1m三乙胺，25℃静置10min，吸出洗脱液迅速用等体积1m tris-hcl(ph7.4)中和；取部分洗脱液测定噬菌体滴度；另取400μl洗脱液，侵染4ml新鲜培养对数期tg1菌液(od600约0.6)，37℃孵育30min，加入16ml2
×
yt/amp-glu培养，37℃、200r/min培养至od
600
达到0.7。取100μl细菌悬液进行梯度稀释后均匀涂抹于2
×
yt/氨苄青霉素/葡萄糖琼脂平板上以便进行文库库容和多样性测定；取100μl细菌悬液即噬菌体展示载体文库接种于2
×
yt/amp-glu培养基中，培养至对数期，加入辅助噬菌体，实施文库救援，获得噬菌体颗粒需测定噬菌体滴度，然后浓缩纯化得到噬菌体粒子用于下一轮筛选；剩余菌液经过离心后使用适当体积的2
×
yt培养液重悬，涂抹于带有筛选抗性的平板上进行过夜培养，使用适量的液体培养液从平板上刮取细菌，加入含1/3体积的50％甘油的2
×
yt培养液进行重悬后分装，所有细菌保存在-80℃。
112.上述筛选操作重复3次。
113.在体外对免疫纳米抗体库进行3轮固相筛选，使具有结合活性的噬菌体克隆得到了有效富集。对单克隆噬菌体进行原核诱导表达后，通过elisa进一步筛选出了可结合抗原胞外区的噬菌体克隆。
114.3、噬菌体包装
115.取100μl冻存的上一轮淘选菌液加入到100ml 2
×
yt/ampgl培养液中37℃振荡(200rpm)培养至对数期(od
600
值为0.6)，加入90μl辅助噬菌体m13k07(1.7
×
10
13
pfu/ml)，该
混合物首先37℃静置30min，2800
×
g离心10min收集菌体，用200ml 2
×
yt/amp-kan培养基重悬，37℃振荡(200rpm)培养12h，4℃、3800
×
g离心30min去除菌体收集上清并加入1/5体积预冷的peg/nacl混匀，沉淀噬菌体2h，4℃、3800
×
g离心30min收集噬菌体后，用终体积2ml pbs溶液重悬并转移至15ml离心管中，4℃、12000
×
g离心15min收集上清，加入1/5体积预冷的peg/nacl溶液，上下颠倒混匀，冰上静置2h；4℃、10000
×
g离心10min，弃上清，用1ml pbs重悬噬菌体沉淀，4℃摇床孵育过夜，使噬菌体颗粒充分溶解，噬菌体溶液与等体积60％甘油混合后分装至1.5ml ep管中并保存于-80℃。
116.使用cd22抗原对噬菌体文库进行3轮淘选，为了避免丢失序列的多样性，初步的elisa筛选将从第2轮和第3轮的淘选产物中进行，阳性克隆从淘选产物中随机挑选出来并进行诱导表达，表达上清即为粗提vhh抗体，通过测序确定单克隆菌株的vhh抗体序列。
117.实施例2
118.本实施例进行荧光激活细胞分选(facs)候选克隆。
119.按照标准细胞培养方案培养nalm6(cd22

)、raji(cd22

)、k562(cd22-)(均购自atcc)和sk-hep-1(cd22-，购自中科院上海细胞库)，使用胰酶消化细胞制备cd22阳性及阴性细胞悬液，离心(300
×
g，5min)去除培养液后用flow buffer重悬细胞至2
×
106cell/ml，v形底96孔板中每孔加入2
×
105个细胞的细胞悬液，300
×
g离心5min后去除上清，添加vhh抗体粗提物重悬细胞，并在4℃孵育1h，300
×
g离心5min后去除上清，flow buffer重悬细胞，使用flow buffer稀释apc anti-his抗体至2μg/ml，每孔100μl重悬细胞，4℃孵育1h，flow buffer清洗细胞3次后使用200μl flow buffer重悬细胞并上流式细胞仪检测，筛选到两种候选抗体，命名为cd22-28和cd22-29。
120.实施例3
121.本实施例进行vhh-migg2a fc纳米抗体表达、纯化以及抗体亲和力测定。
122.为了进一步对实施例2筛选得到的抗体进行鉴定，需要通过哺乳动物细胞中表达所述抗体，因此，首先构建了带有小鼠fc标签表达vhh的质粒载体c-4pcp.stuffer-mcg2a-fc，构建方法包括以下步骤：
123.(1)pcr扩增cd22 vhh：cd22-28和cd22-29，所用试剂如表1所示，引物如表2所示，体系及pcr反应条件如表3所示；
124.表1
[0125][0126]
表2
[0127][0128]
表3
[0129][0130]
(2)酶切体系及反应条件分别如表4所示，酶切后的载体用pcr纯化试剂盒进行纯化，风干的dna溶解到20μl水中，检测dna的浓度；
[0131]
表4
[0132][0133]
(3)同源重组反应体系为10μl，如表5所示；
[0134]
表5
[0135][0136]
(4)取全部同源重组反应体系加入dh5α感受态细胞中，转化dh5α感受态细胞，转化条件如表6所示；
[0137]
表6
[0138][0139][0140]
(5)转化平板挑选单克隆pcr预鉴定，pcr鉴定体系条件如表7所示；送测序公司测序鉴定，测序结果符合预期，成功构建了带有小鼠fc标签表达vhh的质粒载体。
[0141]
表7
[0142][0143]
在质粒转染前约24h，传代293e细胞，使细胞密度约为2.6
×
106cells/ml，取0.15mg scfv-migg1/100ml 293e用pei法转染293e细胞，dna:pei＝1:2。37℃、130rpm、8％co2摇床培养6天，3000rpm，30min收集细胞培养物上清，把收集到的包含目的抗体的上清经millex-gp filter unit 0.45μm sterile过滤后，用mabselect
tm sure
tm
离心浓缩，1
×
pbs洗涤柱体，0.1m(mol/l)gly-hcl洗脱蛋白，并用1/10体积且ph 8.5的tris-hcl中和，蛋白4℃透析过夜后，用nanodrop 2000测定a280的方法定量，sec-hplc测定抗体纯度。
[0144]
另外，将纯化后的2种cd22 vhh抗体(cd22-28和cd22-29)通过biacore进行亲和力的测定。biacore是基于表面等离子共振(surface plasmon resonance,spr)开发的生物分析传感技术，可检测跟踪溶液中的分子与固定在芯片表面的分子结合、解离的整个变化过程，以传感图的形式进行记录，并提供动力学和亲和力数据，测定过程中，将抗体固化到芯片表面，流动相为含有抗原的溶液，测定结果如表8和图1a和图1b所示，由测定结果可知，这2种cd22 vhh抗体具有高亲和力。
[0145]
表8
[0146]
固定相流动相ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)0.5μg/ml cd22-28cd222.79e 051.44e-045.14e-100.5μg/ml cd22-29cd222.16e 051.88e-058.68e-11
[0147]
实施例4
[0148]
本实施例对抗cd22单链抗体进行流式测定。
[0149]
将nalm6肿瘤细胞与纯化的2株重组抗cd22 vhh-migg2抗体(cd22-28和cd22-29)在冰浴下孵育30min，空白对照组不加抗cd22 vhh-migg2抗体，然后用apc标记的羊抗鼠igg抗体孵育30min，采用流式细胞仪检测，结果如图2所示，表明本发明筛选制备的抗cd22抗体能够识别细胞表面的cd22抗原。
[0150]
实施例5
[0151]
本实施例制备表达抗cd22抗体(cd22 vhh)的嵌合抗原受体以及共表达cd22 vhh和cd19 scfv的嵌合抗原受体的慢病毒载体。
[0152]
构建携带cd22 vhh(cd22-28和cd22-29)嵌合抗原受体的慢病毒载体hd sin03 cd22(v28)41bbz(ka)和hd sin03 cd22(v29)41bbz(ka)，以及还同时携带cd19抗体的6种慢病毒载体：
[0153]
hd sin03 cd19-cd22(v28)41bbz(ka)和hd sin03 cd19-cd22(v29)41bbz(ka)，cd19抗体在cd20抗体之前；
[0154]
hd sin03 cd22(v28)-cd19-41bbz(ka)和hd sin03 cd22(v29)-cd19-41bbz(ka)，cd19抗体在cd20抗体之后；
[0155]
hd sin03 cd19-cd3ε-t2a-cd22(v28)-cd3γ(ka)和hd sin03 cd19-cd3ε-t2a-cd22(v29)-cd3γ(ka)，cd19抗体在cd20抗体之前，且二者中间连接有cd3ε-t2a；
[0156]
载体图谱如图3a-3h所示，表达含信号肽、cd22 vhh、cd19 scfv、cd8α铰链区、跨膜区、免疫受体酪氨酸活化基序、cd3ε或cd3γ的嵌合抗原受体，嵌合抗原受体结构示意图如图4a-图4d所示。
[0157]
一、构建hd sin03 cd22(v28)41bbz(ka)和hd sin03 cd22(v29)41bbz(ka)慢病毒载体
[0158]
1、按照表10配制pcr反应体系，扩增cd22 vhh片段，使用引物如表9所示。
[0159]
表9
[0160][0161]
注：cd22(28)-r可替代cd22(29)-r。
[0162]
表10
[0163]
试剂体积(μl)10x缓冲液52mm dntp525mm mgso4310μm primer f110μm primer r1template dna(cdna clone)1pcr级纯水33kod-plus-neo1
[0164]
以上试剂来源于toyobo inc.。
[0165]
配制结束后按照表11所示的pcr程序进行反应。
[0166]
表11
[0167][0168]
2、按照表13配制pcr反应体系，在抗体片段前加信号肽，使用引物如表12所示，信号肽的氨基酸序列为：malpvtalllplalllhaarp(seq id no.18)。
[0169]
表12
[0170][0171]
注：cd22(28)-r可替代cd22(29)-r。
[0172]
表13
[0173][0174][0175]
配制结束后按照表11所示的pcr程序进行pcr反应，反应结束后，pcr产物行1％琼脂糖凝胶电泳，回收500bp左右的片段，紫外吸收法定量。
[0176]
3、按照表14配制pcr反应体系，扩增cd8a hinge-tm-41bb-cd3z片段，使用引物如下：
[0177]
cd8ah-f：accacgacgccagcgccgcgac。
[0178]
vector-r：tcgataagcttgatatcg。
[0179]
配制结束后按照表11所示的pcr程序进行pcr反应，pcr结束后行1％琼脂糖凝胶电泳，回收780bp左右的片段，紫外吸收法定量。
[0180]
表14
[0181]
试剂体积(μl)10x缓冲液52mm dntp525mm mgso4310μm primer f cd8ah-f110μm primer r vector-r1模板dna(hd cd19 car)1pcr级纯水33kod-plus-neo1
[0182]
试剂来源于toyobo inc.。
[0183]
4、将5μg构建的hd sin03 cd19 41bbz(ka)质粒进行bamhi和ecori双酶切，37℃水浴反应2h后，回收载体。
[0184]
5、将上述步骤2和3回收的2个片段和步骤4得到的载体用重组酶连接，重组反应体系如表15所示，配制结束后37℃水浴反应0.5h，按常规方法转化至大肠杆菌stbl3感受态细
leader-cd19 scfv片段。使用引物如下：
[0199]
bamh-cd8a sig-f：
[0200]
gctgcaggtcgactctagaggatcccgccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgc。
[0201]
linker(75)-cd19vh-r：
[0202]
cacccgatccgccgcccccagatccgcccccaccggaccctccaccgcctgaaccgccccctcctgaggagacggtgactgag。
[0203]
配制结束后按照表19所示的pcr程序进行pcr反应，pcr结束后行1％琼脂糖凝胶电泳，回收800bp左右的片段，紫外吸收法定量。
[0204]
表18
[0205]
试剂体积(μl)10x buffer52mm dntp525mm mgso4310μm primer f110μm primer r1模板dna1pcr级纯水33kod-plus-neo1
[0206]
表19
[0207][0208]
2、分别以hd sin03 cd22(v28)41bbz(ka)和hd sin03 cd22(v29)41bbz(ka)为模板，配制表18的pcr反应体系，扩增cd22(v28)-cd8a hinge-tm-41bb-cd3z和cd22(v29)-cd8a hinge-tm-41bb-cd3z片段，使用引物分别如下：
[0209]
linker(75)-cd22(v28)-f：
[0210]
ggcggcggatcgggtggtggtggtagtgaagtgcagctggtggaatc；
[0211]
vector-r：tcgataagcttgatatcg；
[0212]
linker(75)-cd22(v29)-f：
[0213]
ggcggcggatcgggtggtggtggtagtgaggtgcagctggtggag；
[0214]
vector-r：tcgataagcttgatatcg。
[0215]
配制结束后按照表19所示的pcr程序进行pcr反应，pcr结束后行1％琼脂糖凝胶电泳，回收1100bp左右的片段，紫外吸收法定量。
[0216]
3、将上述2个片段和步骤一.4得到的载体用重组酶连接，重组反应体系如表20所
示，配制结束后37℃水浴反应0.5h，按常规方法转化至大肠杆菌stbl3感受态细胞，从固体培养基上挑选单克隆，过夜培养，进行pcr鉴定，pcr结束后挑选阳性克隆进一步测序鉴定，测序结果符合预期，pcr反应物配制如图表16所示，pcr程序如表17所示。
[0217]
表20
[0218][0219]
三、构建hd sin03 cd22(v28)-cd19 41bbz(ka)和hd sin03 cd22(v29)-cd19 41bbz(ka)慢病毒载体
[0220]
1、以hd sin03 cd19 41bbz(ka)为模板，配置表18的pcr反应体系，扩增cd19 scfv-cd8a hinge-tm-41bb-cd3z片段，使用引物如下：
[0221]
linker(75)-cd19vl-f：
[0222]
ggcggcggatcgggtggtggtggtagtgacatccagatgacacag；
[0223]
vector-r：tcgataagcttgatatcg；
[0224]
配制结束后按照表19所示的pcr程序进行pcr反应，pcr结束后行1％琼脂糖凝胶电泳，回收1400bp左右的片段，紫外吸收法定量。
[0225]
2、分别以hd sin03 cd22(v28)41bbz(ka)和hd sin03 cd22(v29)41bbz(ka)为模板，配置表18的pcr反应体系，扩增cd8a leader-cd22(v28)vhh和cd8a leader-cd22(v29)vhh片段，使用引物分别如下：
[0226]
bamh-cd8a sig-f：
[0227]
gctgcaggtcgactctagaggatcccgccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgc；
[0228]
linker(75)-cd22(v28)-r：
[0229]
cacccgatccgccgcccccagatccgcccccaccggaccctccaccgcctgaaccgccccctccgctgctcacggtcacctg；
[0230]
bamh-cd8a sig-f：
[0231]
gctgcaggtcgactctagaggatcccgccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgc；
[0232]
linker(75)-cd22(v29)-r：
[0233]
cacccgatccgccgcccccagatccgcccccaccggaccctccaccgcctgaaccgccccctccgctgctcacggtcacctg；
[0234]
配制结束后按照表19所示的pcr程序进行pcr反应，pcr结束后行1％琼脂糖凝胶电泳，回收500bp左右的片段，紫外吸收法定量。
[0235]
3、将上述2个片段和步骤一.4得到的载体用重组酶连接，重组反应体系如表21所
示，配制结束后37℃水浴反应0.5h，按常规方法转化至大肠杆菌stbl3感受态细胞，从固体培养基上挑选单克隆，过夜培养，进行pcr鉴定，pcr反应物配制如图表16所示，pcr程序如表17所示，pcr结束后挑选阳性克隆进一步测序鉴定，测序结果符合预期。
[0236]
表21
[0237]
试剂用量hd sin03 cd19 41bbz(ka)150ngcd19 scfv-cd8a hinge-tm-41bb-cd3z28ngcd8a leader-cd22(v28或v29)10ng5x ce multis buffer2μlexnase multis1μlpcr级纯水加至10μl总体积10μl
[0238]
四、构建hd sin03 cd19-cd3ε-t2a-cd22(v28)-cd3γ(ka)和hd sin03 cd19-cd3ε-t2a-cd22(v29)-cd3γ(ka)慢病毒载体
[0239]
1、以hd sin03 cd19 41bbz(ka)为模板，配置表18的pcr反应体系，扩增cd8a leader-cd19 scfv片段，使用引物如下：
[0240]
bamh-cd8a sig-f：
[0241]
gctgcaggtcgactctagaggatcccgccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgc；
[0242]
linker3-cd19vh-r：
[0243]
agatccgcccccaccggaccctccaccgcctgaaccgccccctcctgaggagacggtgactgag；
[0244]
配制结束后按照表19所示的pcr程序进行pcr反应，pcr结束后行1％琼脂糖凝胶电泳，回收800bp左右的片段，紫外吸收法定量。
[0245]
2、以委托生工生物合成的puc57-cd3ε表达载体为模板，配制表18的pcr反应体系，扩增cd3ε片段，使用引物如下：
[0246]
linker3-cd3ε-ecd-f：
[0247]
cggtgggggcggatctgatggtaatgaagaaatgg；
[0248]
t2a-cd3ε-icd-r：
[0249]
agggccgggattctcctccacgtcaccgcatgttagaagacttcctctgccctcgatgcgtctctgattcag；
[0250]
配制结束后按照表19所示的pcr程序进行pcr反应，pcr结束后行1％琼脂糖凝胶电泳，回收600bp左右的片段，紫外吸收法定量。
[0251]
3、分别以hd sin03 cd22(v28)41bbz(ka)和hd sin03 cd22(v29)41bbz(ka)为模板，配制表18的pcr反应体系，扩增cd8a leader-cd22(v28)和cd8a leader-cd22(v29)片段，使用引物分别如下：
[0252]
t2a-cd8a sig-f：ggagaatcccggccctatggccttaccagtgacc；
[0253]
linker2-cd22(v28)-r：
[0254]
agagccaccacctccggagccgccacctccggaccctccgccaccgctgctcacggtcacctg；
[0255]
t2a-cd8a sig-f：ggagaatcccggccctatggccttaccagtgacc。
[0256]
linker2-cd22(v29)-r：
[0257]
agagccaccacctccggagccgccacctccggaccctccgccaccgctgctcacggtcacctg；
[0258]
配制结束后按照表19所示的pcr程序进行pcr反应，pcr结束后行1％琼脂糖凝胶电泳，回收500bp左右的片段，紫外吸收法定量。
[0259]
4、以委托生工生物合成的puc57-cd3γ表达载体为模板，配置表18的pcr反应体系，扩增cd3γ片段，使用引物如下：
[0260]
linker2-cd3γ-ecd-f：
[0261]
cggaggtggtggctctcagtcaatcaaaggaaacc；
[0262]
ecori-cd3γ-icd-r：
[0263]
tcgataagcttgatatcgaattctcaattcctcctcaactgg；
[0264]
配制结束后按照表19所示的pcr程序进行pcr反应，pcr结束后行1％琼脂糖凝胶电泳，回收500bp左右的片段，紫外吸收法定量。
[0265]
5、将上述4个片段和步骤一.4得到的载体用重组酶连接，重组反应体系如表22所示，配制结束后37℃水浴反应0.5h，按常规方法转化至大肠杆菌stbl3感受态细胞。从固体培养基上挑选单克隆，过夜培养，进行pcr鉴定，pcr反应物配制如图表16所示，pcr程序如表17所示，pcr结束后挑选阳性克隆进一步测序鉴定，测序结果符合预期。
[0266]
表22
[0267]
试剂用量hd sin03 cd19 41bbz(ka)150ngcd8a leader-cd19 scfv16ngcd3ε12ngcd8a leader-cd22(v28或v29)10ngcd3γ10ng5x ce multis buffer2μlexnase multis1μlpcr级纯水加至10μl总体积10μl
[0268]
6、将获得的信号肽-vhh、cd19 scfv-cd8a hinge-tm-41bb-cd3z、cd22(v28或v29)-cd8a hinge-tm-41bb-cd3z、信号肽-cd19 scfv、cd3ε、cd3γ片段经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶dna片段回收试剂盒进行回收、纯化、定量；用限制性内切酶bamhi和ecori(购自neb公司)切慢病毒表达载体hd sin03 cd19 41bbz(ka)，按说明书进行操作。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶dna片段回收试剂盒进行回收、纯化、定量；然后将对应的目的片段与载体用重组酶克隆到慢病毒载体中，并进行测序验证，测序结果符合预期。
[0269]
cd3ε片段氨基酸序列为(seq id no.21)：
[0270]
dgneemggitqtpykvsisgttviltcpqypgseilwqhndkniggdeddknigsdedhlslkefseleqsgyyvcyprgskpedanfylylrarvcencmemdvmsvativivdicitggllllvyywsknrkakakpvtrgagaggrqrgqnkerpppvpnpdyepirkgqrdlysglnqrri。
[0271]
cd3γ片段氨基酸序列为(seq idno.22)：
[0272]
qsikgnhlvkvydyqedgsvlltcdaeaknitwfkdgkmigfltedkkkwnlgsnakdprgmyqckgsqnkskplqvyyrmcqncielnaatisgflfaeivsifvlavgvyfiagqdgvrqsrasdkqtllpndqlyqplkdreddqyshlqgnqlrrn。
[0273]
实施例6
[0274]
本实施例进行慢病毒的包装，包括以下步骤：
[0275]
(1)以1.6
×
107细胞数接种293t细胞于15cm培养皿中，37℃，5％co2培养过夜准备包装病毒，培养基为dmem，添加10％胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)；
[0276]
(2)将30μg实施例5中构建的8种慢病毒载体分别与12.5μg辅助质粒gag/pol与10μg包膜质粒vsvg溶入2000μl无血清dmem培养液，混匀；
[0277]
(3)将157.5μg pei(1μg/μl)溶解于2000μl的无血清dmem培养液中，1000rpm涡旋5秒钟，25℃孵育5min；
[0278]
(4)转染复合物的形成：将pei混合液加入dna混合液中，加入后立即涡旋混合或轻轻混匀，25℃下孵育20min；
[0279]
(5)将转染复合物4ml滴加入含25ml dmem培养基的15cm培养皿中，4h小时后，更换新鲜培养基；
[0280]
(6)48h后，收集病毒液上清，得到8种表达不同结构嵌合抗原受体的慢病毒。
[0281]
实施例7
[0282]
本实施例进行慢病毒浓缩。
[0283]
将实施例制6备的病毒上清用0.45μm滤膜过滤后收集到50ml离心管中，加入1/4的peg-nacl病毒浓缩液，上下颠倒混匀，4℃放置过夜；4℃，3500rpm，离心30min；去上清，加入rpmi 1640培养基(含10％fbs)，溶解重悬病毒沉淀；浓缩后的慢病毒悬液分装成50μl每份，保存在成品管中，储存在-80℃。
[0284]
实施例8
[0285]
本实施例进行慢病毒滴度检测。
[0286]
将500μl k562细胞(1
×
105个细胞)接种细胞于24孔培养板；将实施例7浓缩后的慢病毒分别以1μl、0.2μl和0.04μl添加到细胞悬液中，并添加polybrene至终浓度5μg/ml；37℃，5％co2培养过夜后，更换新鲜培养基；感染72h后，400
×
g离心5min，弃上清收集细胞，加100μl pbs 2％fbs重悬细胞，加入1μg的af488-anti-cd19 scfv和/或pe-anti-vhh抗体，冰上孵育30min；pbs 2％fbs清洗2次后，加入300μl pbs 2％fbs重悬细胞，采用流式细胞仪检测感染效率；取阳性率为15％的细胞样品为宜，计算滴度(tu/ml)＝细胞数量(105)
×
阳性率/病毒体积(ml)。
[0287]
实施例9
[0288]
本实施例利用慢病毒转导t淋巴细胞。
[0289]
用pbs将抗人cd3抗体和抗人cd28抗体稀释，终浓度分别为1μg/ml和0.5μg/ml，包被孔板，4℃冰箱静置过夜；弃去孔板中的抗体包被液，1ml pbs洗两次；用t细胞培养基(x-vivo 10％fbs il-2(300u/ml))将人pbmc调整至密度为1
×
106/ml，然后接种到cd3和cd28抗体包被的孔板中活化48h；收集活化的t细胞，调整细胞密度为1
×
106/ml，按照感染复数(multiplicity of infection，moi)＝10加入实施例7制备慢病毒，添加polybrene至终浓度为5μg/ml；于37℃、5％co2环境中培养过夜后更换新鲜培养基，每2天进行传代。
[0290]
实施例10
[0291]
本实施例进行t淋巴细胞嵌合抗原受体表达，包括以下步骤：
[0292]
(1)感染5天后，取3
×
105的t细胞，4℃、400
×
g离心5min，弃上清，pbs 2％fbs清洗一次；
[0293]
(2)加100μl pbs 2％fbs重悬细胞，加入1μg的af488-anti-cd19 scfv和pe-anti-vhh抗体，冰上孵育30min；pbs 2％fbs清洗2次后，加入300μl pbs 2％fbs重悬细胞，以未经感染t细胞作为对照，采用流式细胞仪检测感染效率，结果如图5所示，感染后的car-t细胞有明显的阳性细胞群，表明本发明成功构建了8种表达不同结构嵌合抗原受体的car-t细胞，分别为嵌合抗原受体的抗原结合结构域仅含有cd22-28抗体(对应细胞标记为cd22(v28))或cd22-29抗体(对应细胞标记为cd22(v29))，同时嵌合抗原受体的抗原结合结构域同含有cd22和cd19抗体，但排序不同，分别标记为cd22(v28)-cd19、cd22(v29)-cd19、cd19-cd22(v28)、cd19-cd22(v29)、cd19-ε-cd22(v28)-γ或cd19-ε-cd22(v29)-γ。
[0294]
实施例11
[0295]
本实施例利用实施例9制备的8种car-t细胞进行体外毒性实验，包括以下步骤：
[0296]
(1)靶细胞接种：
[0297]
以本实验室保存的肿瘤细胞k562-luci(cd19-cd22-)、k562-cd19-luci(cd19

cd22-)、k562-cd22-luci(cd19-cd22

)、k562-cd19-cd22-luci(cd19

cd22

)作为靶细胞，调整靶细胞浓度为2
×
105/ml，取50μl接种到96well板；
[0298]
(2)效应细胞接种：
[0299]
以实施例9制备的同时含cd19抗体和cd22抗体的car-t以及对照t(未进行慢病毒感染)细胞为效应细胞；按效靶比0.3:1、1:1和3:1向96孔板中加入car-t细胞及对照t细胞；
[0300]
各组均设2个复孔，取2个复孔的平均值，其中实验组和对照组如下：
[0301]
实验组：car-t 靶细胞；
[0302]
对照组：对照t细胞 靶细胞；
[0303]
(3)效应细胞与靶细胞共培养18h后，使用steady-萤光素酶检测试剂盒进行检测，具体检测步骤参照steady-萤光素酶检测试剂盒说明书，结果如图6a-图6d所示，本发明构建的car-t细胞对cd22和cd19阳性的肿瘤细胞具有高效杀伤活性，且对cd22和cd19阴性细胞无杀伤作用，说明本发明构建的car-t细胞还具备高特异性。
[0304]
实施例12
[0305]
本实施例检测car-t细胞因子分泌。
[0306]
1.细胞培养上清
[0307]
将实施例11中效靶比1:1的细胞培养物400
×
g离心10min去除沉淀物，取上清置于-80℃贮存待检。
[0308]
2.试剂准备
[0309]
使用联科生物elisa试剂盒(货号分别为：人γ干扰素elisa试剂盒：ek180-96；人白介素2elisa试剂盒：ek102-96；人肿瘤坏死因子α(tnf-α)elisa试剂盒：ek182-96)进行检测，检测前将所有的试剂、样本恢复至25℃，按照使用说明配制1
×
洗液，1
×
检测缓冲液，检测抗体。
[0310]
3.标准品及样品配制
[0311]
标准品：使用5％1640培养基2倍稀释标准品原液，一共8个稀释梯度，包括零浓度。
[0312]
样品：使用5％1640培养基按比稀释样品。
[0313]
4.检测步骤
[0314]
(1)浸泡酶标板：加入300μl 1
×
洗液静置浸泡30s，弃掉洗液之后，在吸水纸上将微孔板拍干；
[0315]
(2)加标准品：标准品孔加入100μl 2倍倍比稀释的标准品，空白孔加入100μl 5％1640培养基；
[0316]
(3)加样本：样本孔加入100μl细胞培养上清；
[0317]
(4)加检测抗体：每孔加入50μl稀释的检测抗体(1:100稀释)；
[0318]
(5)孵育：使用封板膜封板，300rpm振荡，25℃孵育2h；
[0319]
(6)洗涤：弃掉液体，每孔加入300μl洗液洗板，洗涤6次；
[0320]
(7)加酶孵育：每孔加入100μl稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1:100稀释)；
[0321]
(8)孵育：使用新的封板膜封板，300rpm振荡，25℃孵育45min；
[0322]
(9)洗涤：重复步骤(6)；
[0323]
(10)加底物显色：每孔加入100μl显色底物tmb，避光，25℃孵育15min；
[0324]
(11)加终止液：每孔加入100μl终止液，充分混匀；
[0325]
(12)检测读数：使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长和630nm参考波长下的od值，校准后的od值为450nm的测定值减去630nm的测定值。
[0326]
il-2、tnf-α和ifn-γ因子分泌结果分别如图7-图9所示，其中自发为car-t细胞单独培养物，在自发以及k562-luci和car-t培养物中检测到微量tnf-α、il-2和ifn-γ因子，k562-cd19-luci、k562-cd22-luci和k562-cd19-cd22-luci分别与car-t培养物中均检测到较高含量的il-2、tnf-α和ifn-γ因子，表明本发明构建的car-t细胞还能够对cd19和/或cd22阳性的肿瘤细胞释放细胞因子而发挥杀伤功能，且具备高特异性，对cd19和/或cd22阴性细胞无明显细胞因子分泌。
[0327]
综上所述，本发明筛选制备抗cd22抗体，所述抗cd22抗体具备高亲和力和特异性，能够有效靶向肿瘤抗原cd22，利用所述抗cd22抗嵌合抗原受体，并进一步制备嵌合抗原受体细胞，所述嵌合抗原受体细胞能够高效杀伤肿瘤细胞，并能分泌多种细胞因子发挥杀伤功能，且具备高特异性。
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申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。