一种拟肽类化合物及其衍生物、制备方法、药物组合物和应用与流程

1.本发明涉及一种拟肽类化合物及其衍生物、制备方法、药物组合物和应用，尤其涉及一种能抑制3c样半胱氨酸蛋白酶的拟肽类化合物及其衍生物、制备方法和应用。


背景技术：

2.sars-cov-2的感染症状从无症状疾病到中度和重度肺炎，以及危及生命的并发症，包括低氧性呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征、多系统器官衰竭，并最终出现死亡。更严重的是，这种病毒不仅具有高度传染性，而且可以通过无症状感染者和那些处于症状期和症状前阶段的人进行传播。
3.和其他冠状病毒一样，sars-cov-2进入宿主细胞后会被分解释放出核衣壳和病毒基因组。宿主细胞核糖体将病毒基因组的开放阅读框架(orf)1a和orf1b分别翻译成多聚蛋白(polyproteins，pp)pp1a和pp1b，用于编码16个非结构蛋白(nsps)，而其余的orf编码结构蛋白和附属蛋白。3c样半胱氨酸蛋白酶(3clpro，nsp5，ec 3.4.22.69) 和木瓜样半胱氨酸蛋白酶(plpro，nsp3，ec3.4.22.46)高度协调，催化pp裂解生成 nsp2-16，进而形成复制-转录复合体(rtc)；3clpro酶活性缺失会导致病毒生命周期停止，因而3clpro对于病毒的复制和生存至关重要。另外，研究表明3clpro还可以裂解宿主免疫相关蛋白，比如人先天性免疫分子sting。3clpro不仅是维持病毒本身复制所必需的，还可以破坏宿主细胞的免疫系统、抑制抗感染免疫应答，造成免疫逃逸。抑制3clpro不仅可以有效杀死冠状病毒还可以减少感染的宿主细胞内免疫失衡。鉴于 3clpro在冠状病毒的基因复制过程中的重要地位，发展3clpro抑制剂对冠状病毒会产生强效的抑制或杀伤效果，这使得3clpro成为抗病毒化学治疗的令人关注的目标。
4.已报道的3clpro抑制剂包括肽类抑制剂(参见kim等(2012)bioorg.med.chem. lett.22:6952-6956；thibaut等(2012)biochem.pharmacol.83:185-192；van等(2014) antiviral res.103:17-24；国际专利申请公布号wo 2005/113580；wo 2006/061714；wo2017/114509；zhang等(2020)science 368：409-412；dai等(2020)science 368：1331-1335； qiao等(2021)science 371：1374-1378；jacobs等(2012)j.med.chem.56：534-546； akaji等(2011)j.med.chem.54:7962-7973；zhang等(2020)j.med.chem.63：4562-4578； hoffman等(2020)j.med.chem.63:12725-12747)和非肽类抑制剂，如杂环酯类(参见lu等(2006)j.med.chem.49:5154-5161)、吡唑类(参见ramajayam等(2010)bioorg. med.chem.18:7849-7854)、靛红衍生物类(参见chen等(2005)bioorg.med.chem. lett.15:3058-3062；zhou等(2006)j.med.chem.49:3440-3443)以及其他类(参见 cn111233649b、cn111920821a、cn11154442a)。现有的抗病毒药物大多针对特定的病毒株进行早中期治疗，无法及时有效地应对突发的疫情和病毒感染患者的晚期治疗，并且长时间使用此类抗病毒药物会出现严重的耐药情况和很大的毒副作用。此外，由于未能有效清除病毒，而造成的细胞因子风暴也极大地威胁患者生命安全。因此，寻找一种新型、高效、低毒的广谱抗病毒药物成为本领域的研究热点之一。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明的目的是提供一种拟肽类化合物及其衍生物；本发明的另一目的是提供一种拟肽类化合物及其衍生物制备方法；本发明的另一目的是提供一种拟肽类化合物或/和衍生物的药物组合物；本发明的另一目的是提供一种拟肽类化合物及其衍生物、、药物组合物在制备rna病毒的3c样半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的应用。
6.本发明的拟肽类化合物及其衍生物，所述化合物的化学结构式如式(i)所示，所述衍生物为所述化合物的互变异构体、立体异构体、溶剂化物、溶剂化物的盐、代谢产物、代谢前体或前药、药学上可接受的盐或它们的混合物：
[0007][0008]
式i中：
[0009]
m＝0-2；
[0010]
a为氢、nr1r2、or3、(ch2)b(c＝o)nr1r2或(c＝o)r3；
[0011]
b＝1-5；
[0012]
r1为氢、羟基、氰基、c
1-8
烷基、氰基(c
1-8
烷基)、氨基(c
1-8
烷基)、c
1-8
烷胺基-c
1-8
烷基、羟基(c
1-8
烷基)、羧基(c
1-8
烷基)、c
2-8
烯基、c
2-8
炔基、c
1-8
烷氧基-c
1-8
烷基、未取代的或r
1-1
取代的c
3-10
环烷基、未取代的或r
1-2
取代的杂芳基、未取代的或r
1-3
取代的杂环烷基、未取代的或r
1-4
取代的c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
1-5
取代的杂芳基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
1-6
取代的杂环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
1-7
取代的c
6-10
芳基、未取代的或r
1-8
取代的c
6-10
芳基-(c
1-6
烷基)-、或r1和r2与它们相连的氮原子一起形成未取代或r
1-9
取代的杂环烷基、或r1和r2与它们相连的氮原子一起形成未取代或r
1-10
取代的杂芳基；其中所述的杂环烷基为“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基；所述的杂芳基为“杂原子选自n、 o和s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”5-10元杂芳基；
[0013]r1-1
～r
1-6
独立地选自羟基、氰基、氨基、卤素、c
1-6
的烷基、卤代(c
1-6
烷基)、羟基(c
1-6
烷基)、c
1-6
烷氧基或c
1-6
烷胺基；
[0014]r1-7
和r
1-8
独立地选自羟基、氰基、卤素、硝基、c
1-6
的烷基、c
2-8
烯基、c
2-6
炔基、 c
1-6
烷氧基、c
6-10
芳基氧基、杂芳基氧基、(c
3-10
环烷基)-氧基、卤代(c
1-6
烷基)、羟基(c
1-6
烷基)、氨基(c
1-6
烷基)、c
1-6
烷胺基-c
1-6
烷氧基-、c
3-10
环烷基、c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷基)-、 c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷氧基)、未取代的或r
1-1-1
取代的c
6-10
芳基、c
6-10
芳基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
1-1-2
取代的c
6-10
芳基-(c
1-6
烷氧基)-、杂环烷基、杂环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
1-1-3
取代的杂芳基、杂芳基-(c
1-6
烷基)-、杂芳基-(c
1-6
烷氧基)-、-nr
1-1-4r1-1-5
、
ꢀ‑
(c＝o)r
1-1-6
、-(c＝o)nr
1-1-7r1-1-8
、-nr
1-1-9
(c＝o)r
1-1-10
、-(c＝o)or
1-1-11
、-o(c＝o)r
1-1-12
、
ꢀ‑
(s＝o)2nr
1-1-13r1-1-14
、-nr
1-1-15
(s＝o)2r
1-1-16
、或-(s＝o)2r
1-1-17
；所述的杂环烷基为“杂原子选自n、o或s
中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基；所述的杂芳基为“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个”的5-10元杂芳基；
[0015]r1-1-1
、r
1-1-2
和r
1-1-3
独立地选自c
1-4
烷基、羟基(c
1-4
烷基)、卤素、氰基、羟基、 c
1-4
烷胺基、c
1-4
烷氧基或卤代(c
1-4
烷基)；
[0016]r1-1-4
～r
1-1-17
独立地选自氢或c
1-4
烷基；
[0017]r1-9
为羟基、氨基、c
1-6
烷基、c
6-10
芳基、c
3-10
环烷基、“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基、或“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个”的5-10元杂芳基；
[0018]r1-10
为羟基、卤素、c
1-6
烷基、氨基、卤代(c
1-6
烷基)、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷胺基、羟基(c
1-6
烷基)、氨基(c
1-6
烷基)、c
6-10
芳基、c
3-10
环烷基、“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基、或“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个”的5-10元杂芳基；
[0019]
r2为氢或c
1-8
烷基；
[0020]
r3为氢、c
1-8
烷基、氰基(c
1-8
烷基)、氨基(c
1-8
烷基)、c
1-8
烷胺基-c
1-8
烷基、羟基(c
1-8
烷基)、c
2-8
烯基、c
2-8
炔基、c
1-8
烷氧基-c
1-8
烷基、未取代的或r
3-1
取代的c
3-10
环烷基、未取代的或r
3-2
取代的杂芳基、未取代的或r
3-3
取代的杂环烷基、未取代的或r
3-4
取代的c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
3-5
取代的杂芳基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
3-6
取代的杂环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
3-7
取代的c
6-10
芳基、未取代的或r
3-8
取代的c
6-10
芳基-(c
1-6
烷基)-、或r1和r2与它们相连的氮原子一起形成未取代或r
3-9
取代的杂环烷基、或r1和r2与它们相连的氮原子一起形成未取代或r
3-10
取代的杂芳基；其中所述的杂环烷基为“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10 元杂环烷基；所述的杂芳基为“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1-3 个的”5-10元杂芳基；
[0021]r3-1
～r
3-6
独立地选自羟基、氰基、氨基、卤素、c
1-6
的烷基、卤代(c
1-6
烷基)、羟基(c
1-6
烷基)、c
1-6
烷氧基或c
1-6
烷胺基；
[0022]r3-7
和r
3-8
独立地选自羟基、氰基、卤素、硝基、c
1-6
的烷基、c
2-8
烯基、c
2-6
炔基、 c
1-6
烷氧基、c
6-10
芳基氧基、杂芳基氧基、(c
3-10
环烷基)-氧基、卤代(c
1-6
烷基)、羟基(c
1-6
烷基)、氨基(c
1-6
烷基)、c
1-6
烷胺基-c
1-6
烷氧基-、c
3-10
环烷基、c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷基)-、 c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷氧基)、未取代的或r
3-1-1
取代的c
6-10
芳基、c
6-10
芳基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
3-1-2
取代的c
6-10
芳基-(c
1-6
烷氧基)-、杂环烷基、杂环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
3-1-3
取代的杂芳基、杂芳基-(c
1-6
烷基)-、杂芳基-(c
1-6
烷氧基)-、-nr
3-1-4r3-1-5
、
ꢀ‑
(c＝o)r
3-1-6
、-(c＝o)nr
3-1-7r3-1-8
、-nr
3-1-9
(c＝o)r
3-1-10
、-(c＝o)or
3-1-11
、-o(c＝o)r
3-1-12
、
ꢀ‑
(s＝o)2nr
3-1-13r3-1-14
、-nr
3-1-15
(s＝o)2r
3-1-16
、或-(s＝o)2r
3-1-17
；所述的杂环烷基为“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基；所述的杂芳基为“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个”的5-10元杂芳基；
[0023]r3-1-1
、r
3-1-2
和r
3-1-3
独立地选自c
1-4
烷基、羟基(c
1-4
烷基)、卤素、氰基、羟基、 c
1-4
烷胺基、c
1-4
烷氧基或卤代(c
1-4
烷基)；
[0024]r3-1-4
～r
3-1-17
独立地选自氢或c
1-4
烷基；
[0025]r3-9
为羟基、氨基、c
1-6
烷基、c
6-10
芳基、c
3-10
环烷基、“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基、或“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原
子数为1-3个”的5-10元杂芳基；
[0026]r3-10
为羟基、卤素、c
1-6
烷基、氨基、卤代(c
1-6
烷基)、c
1-6
烷氧基、c
1-6
烷胺基、羟基(c
1-6
烷基)、氨基(c
1-6
烷基)、c
6-10
芳基、c
3-10
环烷基、“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基、或“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个”的5-10元杂芳基；
[0027]
b为
[0028]
n＝0-3；
[0029]
r4、r5独立地选自氢、羟基、氨基、氰基、醛基、卤素、c
1-8
烷基、氰基(c
1-8
烷基)、氨基(c
1-8
烷基)、羟基(c
1-8
烷基)、羧基(c
1-8
烷基)、c
1-8
烷胺基-c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基-c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
烷巯基、c
1-8
烷胺基、c
2-8
烯基、c
2-8
炔基、c
1-8
酯基、c
1-8
氨基甲酸酯、c
1-8
脲基、c
1-8
酮、未取代的或r
4-1
取代的c
3-10
环烷基、未取代的或r
4-2
取代的c
3-10
环烷羟基、未取代的或r
4-3
取代的c
3-10
环烷巯基、未取代的或r
4-4
取代的c
3-10
环烷胺基、未取代的或r
4-5
取代的杂芳基、未取代的或r
4-6
取代的杂芳羟基、未取代的或r
4-7
取代的杂芳巯基、未取代的或r
4-8
取代的杂芳胺基、未取代的或r
4-9
取代的杂环烷基、未取代的或r
4-10
取代的杂环羟基、未取代的或r
4-11
取代的杂环巯基、未取代的或r
4-12
取代的杂环胺基、未取代的或r
4-13
取代的c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或 r
4-14
取代的杂芳基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
4-15
取代的杂环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
4-16
取代的c
6-10
芳基、未取代的或r
4-17
取代的c
6-10
芳基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
4-18
取代的c
6-10
芳氧基、未取代的或r
4-19
取代的c
6-10
芳巯基，或未取代的或r
4-20
取代的c
6-10
芳胺基；其中所述的杂环烷基为“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基；所述的杂芳基为“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”5-10元杂芳基；
[0030]r4-1
～r
4-4
独立地选自羟基、氰基、氨基、卤素、c
1-6
的烷基、卤代(c
1-6
烷基)、羟基(c
1-6
烷基)、c
1-6
烷氧基或c
1-6
烷胺基；
[0031]r4-5
和r
4-8
独立地选自羟基、氰基、卤素、硝基、c
1-6
的烷基、c
2-8
烯基、c
2-6
炔基、 c
1-6
烷氧基、c
6-10
芳基氧基、杂芳基氧基、(c
3-10
环烷基)-氧基、卤代(c
1-6
烷基)、羟基(c
1-6
烷基)、氨基(c
1-6
烷基)、c
1-6
烷胺基-c
1-6
烷氧基-、c
3-10
环烷基、c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷基)-、 c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷氧基)、未取代的或r
4-1-1
取代的c
6-10
芳基、c
6-10
芳基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
4-1-2
取代的c
6-10
芳基-(c
1-6
烷氧基)-、杂环烷基、杂环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
4-1-3
取代的杂芳基、杂芳基-(c
1-6
烷基)-、杂芳基-(c
1-6
烷氧基)-、-nr
4-1-4r4-1-5
、
ꢀ‑
(c＝o)r
4-1-6
、-(c＝o)nr
4-1-7r4-1-8
、-nr
4-1-9
(c＝o)r
4-1-10
、-(c＝o)or
4-1-11
、-o(c＝o)r
4-1-12
、
ꢀ‑
(s＝o)2nr
4-1-13r4-1-14
、-nr
4-1-15
(s＝o)2r
4-1-16
、或-(s＝o)2r
4-1-17
；所述的杂环烷基为“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基；所述的杂芳基为“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个”的5-10元杂芳基；
[0032]r4-1-1
、r
4-1-2
和r
4-1-3
独立地选自c
1-4
烷基、羟基(c
1-4
烷基)、卤素、氰基、羟基、 c
1-4
烷胺基、c
1-4
烷氧基或卤代(c
1-4
烷基)；
[0033]r4-1-4
～r
4-1-17
独立地选自氢或c
1-4
烷基；
[0034]r4-9
～r
4-13
独立地选自羟基、氰基、氨基、卤素、c
1-6
的烷基、卤代(c
1-6
烷基)、羟基
(c
1-6
烷基)、c
1-6
烷氧基或c
1-6
烷胺基；
[0035]r4-14
和r
4-20
独立地选自羟基、氰基、卤素、硝基、c
1-6
的烷基、c
2-8
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
烷氧基、c
6-10
芳基氧基、杂芳基氧基、(c
3-10
环烷基)-氧基、卤代(c
1-6
烷基)、羟基(c
1-6
烷基)、氨基(c
1-6
烷基)、c
1-6
烷胺基-c
1-6
烷氧基-、c
3-10
环烷基、c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷基)-、c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷氧基)、未取代的或r
4-2-1
取代的c
6-10
芳基、c
6-10
芳基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
4-2-2
取代的c
6-10
芳基-(c
1-6
烷氧基)-、杂环烷基、杂环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
4-2-3
取代的杂芳基、杂芳基-(c
1-6
烷基)-、杂芳基-(c
1-6
烷氧基)-、
ꢀ‑
nr
4-2-4r4-2-5
、-(c＝o)r
4-2-6
、-(c＝o)nr
4-2-7r4-2-8
、-nr
4-2-9
(c＝o)r
4-2-10
、-(c＝o)or
4-2-11
、
ꢀ‑
o(c＝o)r
4-2-12
、-(s＝o)2nr
4-2-13r4-2-14
、-nr
4-2-15
(s＝o)2r
4-2-16
、或-(s＝o)2r
4-2-17
；所述的杂环烷基为“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基；所述的杂芳基为“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个”的 5-10元杂芳基；
[0036]r4-2-1
、r
4-2-2
和r
4-2-3
独立地选自c
1-4
烷基、羟基(c
1-4
烷基)、卤素、氰基、羟基、 c
1-4
烷胺基、c
1-4
烷氧基或卤代(c
1-4
烷基)；
[0037]r4-2-4
～r
4-2-17
独立地选自氢或c
1-4
烷基；
[0038]
d可以存在或者不存在，当d存在时，d选自(ch2)a、(chr6)a、(chr
6-chr7)a、 (cr6r7)a、so2、nh、nr或o；当d不存在时，则e存在，并且e直接独立连接到d 连接的式i所示的氮原子上；
[0039]
e可以存在或者不存在，当e存在时，e选自ch、cr6、o、s或n；当e不存在时，则l可以存在或者不存在；当l存在而e不存在时，则l直接独立连接到d，并且g直接独立连接到d；
[0040]
g为ch、cr6、n或者朝向e、j、l的双键；
[0041]
j可以存在或者不存在，当j存在时，j选自(ch2)a、(chr6)a、(chr
6-chr7)a、或 (cr6r7)a；当j不存在时，则g存在，并且g直接独立连接到j连接的式i所示的碳原子上；
[0042]
m可以存在或者不存在，当m存在时，m选自o、nh、nr6、s、co、so、so2、 c
3-8
烯基、c
3-8
炔基、(ch2)a、(chr6)a、(chr
6-chr7)a、(cr6r7)a或b；
[0043]
k可以存在或者不存在，当k存在时，m选自o、nh、nr6、s、co、so、so2、 (ch2)a、(chr6)a、(chr
6-chr7)a、(cr6r7)a或b；
[0044]
l可以存在或者不存在，当l存在时，l选自o、nh、nr6、s、co、so、so2、 c
2-8
烯基、c
2-8
炔基、(ch2)a、(chr6)a、(chr
6-chr7)a、(cr6r7)a或b；
[0045]
a＝0-5；
[0046]
r6、r7独立地选自氢、羟基、氨基、氰基、醛基、卤素、c
1-8
烷基、氰基(c
1-8
烷基)、氨基(c
1-8
烷基)、羟基(c
1-8
烷基)、羧基(c
1-8
烷基)、c
1-8
烷胺基-c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基-c
1-8
烷基、c
1-8
烷氧基、c
1-8
烷巯基、c
1-8
烷胺基、c
2-8
烯基、c
2-8
炔基、c
1-8
酯基、c
1-8
氨基甲酸酯、c
1-8
脲基、c
1-8
酮、未取代的或r
6-1
取代的c
3-10
环烷基、未取代的或r
6-2
取代的c
3-10
环烷羟基、未取代的或r
6-3
取代的c
3-10
环烷巯基、未取代的或r
6-4
取代的c
3-10
环烷胺基、未取代的或r
6-5
取代的杂芳基、未取代的或r
6-6
取代的杂芳羟基、未取代的或r
6-7
取代的杂芳巯基、未取代的或r
6-8
取代的杂芳胺基、未取代的或r
6-9
取代的杂环烷基、未取代的或r
6-10
取代的杂环羟基、未取代的或r
6-11
取代的杂环巯基、未取代的或r
6-12
取代的杂环胺基、未取代的或r
6-13
取代的c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或 r
6-14
取代的杂芳基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
6-15
取代的杂环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
6-16
取代的c
6-10
芳基、未取代的或r
6-17
取代的c
6-10
芳基-(c
1-6
烷
基)-、未取代的或r
6-18
取代的c
6-10
芳氧基、未取代的或r
6-19
取代的c
6-10
芳巯基，或未取代的或r
6-20
取代的c
6-10
芳胺基；其中所述的杂环烷基为“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基；所述的杂芳基为“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”5-10元杂芳基；
[0047]r6-1
～r
6-4
独立地选自羟基、氰基、氨基、卤素、c
1-6
的烷基、卤代(c
1-6
烷基)、羟基(c
1-6
烷基)、c
1-6
烷氧基或c
1-6
烷胺基；
[0048]r6-5
和r
6-8
独立地选自羟基、氰基、卤素、硝基、c
1-6
的烷基、c
2-8
烯基、c
2-6
炔基、 c
1-6
烷氧基、c
6-10
芳基氧基、杂芳基氧基、(c
3-10
环烷基)-氧基、卤代(c
1-6
烷基)、羟基(c
1-6
烷基)、氨基(c
1-6
烷基)、c
1-6
烷胺基-c
1-6
烷氧基-、c
3-10
环烷基、c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷基)-、 c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷氧基)、未取代的或r
6-1-1
取代的c
6-10
芳基、c
6-10
芳基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
6-1-2
取代的c
6-10
芳基-(c
1-6
烷氧基)-、杂环烷基、杂环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
6-1-3
取代的杂芳基、杂芳基-(c
1-6
烷基)-、杂芳基-(c
1-6
烷氧基)-、-nr
6-1-4r6-1-5
、
ꢀ‑
(c＝o)r
6-1-6
、-(c＝o)nr
6-1-7r6-1-8
、-nr
6-1-9
(c＝o)r
6-1-10
、-(c＝o)or
6-1-11
、-o(c＝o)r
6-1-12
、
ꢀ‑
(s＝o)2nr
6-1-13r6-1-14
、-nr
6-1-15
(s＝o)2r
6-1-16
、或-(s＝o)2r
6-1-17
；所述的杂环烷基为“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基；所述的杂芳基为“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个”的5-10元杂芳基；
[0049]r6-1-1
、r
6-1-2
和r
6-1-3
独立地选自c
1-4
烷基、羟基(c
1-4
烷基)、卤素、氰基、羟基、 c
1-4
烷胺基、c
1-4
烷氧基或卤代(c
1-4
烷基)；
[0050]r6-1-4
～r
6-1-17
独立地选自氢或c
1-4
烷基；
[0051]r6-9
～r
6-13
独立地选自羟基、氰基、氨基、卤素、c
1-6
的烷基、卤代(c
1-6
烷基)、羟基(c
1-6
烷基)、c
1-6
烷氧基或c
1-6
烷胺基；
[0052]r6-14
和r
6-20
独立地选自羟基、氰基、卤素、硝基、c
1-6
的烷基、c
2-8
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
烷氧基、c
6-10
芳基氧基、杂芳基氧基、(c
3-10
环烷基)-氧基、卤代(c
1-6
烷基)、羟基(c
1-6
烷基)、氨基(c
1-6
烷基)、c
1-6
烷胺基-c
1-6
烷氧基-、c
3-10
环烷基、c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷基)-、c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷氧基)、未取代的或r
6-2-1
取代的c
6-10
芳基、c
6-10
芳基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
6-2-2
取代的c
6-10
芳基-(c
1-6
烷氧基)-、杂环烷基、杂环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
6-2-3
取代的杂芳基、杂芳基-(c
1-6
烷基)-、杂芳基-(c
1-6
烷氧基)-、
ꢀ‑
nr
6-2-4r6-2-5
、-(c＝o)r
6-2-6
、-(c＝o)nr
6-2-7r6-2-8
、-nr
6-2-9
(c＝o)r
6-2-10
、-(c＝o)or
6-2-11
、
ꢀ‑
o(c＝o)r
6-2-12
、-(s＝o)2nr
6-2-13r6-2-14
、-nr
6-2-15
(s＝o)2r
6-2-16
、或-(s＝o)2r
6-2-17
；所述的杂环烷基为“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基；所述的杂芳基为“杂原子选自n、o或s中的一种或多种，杂原子数为1-3个”的 5-10元杂芳基；
[0053]r6-2-1
、r
6-2-2
和r
6-2-3
独立地选自c
1-4
烷基、羟基(c
1-4
烷基)、卤素、氰基、羟基、 c
1-4
烷胺基、c
1-4
烷氧基或卤代(c
1-4
烷基)；
[0054]r6-2-4
～r
6-2-17
独立地选自氢或c
1-4
烷基；
[0055]
其中所述n-d-e-g-j-碳单元为五元或六元环，e-g-k-l-m单元为三元至六元环； n-d-e-g-j-c单元与e-g-k-l-m单元共用e、g单元，形成并环或螺环结构；
[0056]
t选自
[0057]
r8、r9独立地选自氢、羟基、氰基、c
1-8
烷基、氰基(c
1-8
烷基)、氨基(c
1-8
烷基)、 c
1-8
烷胺基-c
1-8
烷基、羟基(c
1-8
烷基)、c
2-8
烯基、c
2-8
炔基、c
1-8
烷氧基-c
1-8
烷基、未取代的或r
8-1
取代的c
3-10
环烷基、未取代的或r
8-2
取代的杂环烷基、未取代的或r
8-3
取代的c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷基)-、、未取代的或r
8-4
取代的杂环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
8-5
取代的c
6-10
芳基-(c
1-6
烷基)-、或r8和r9与它们相连的氮原子一起形成未取代或r
8-6
取代的杂环烷基；其中所述的杂环烷基为“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基；
[0058]r8-1
～r
8-6
独立地选自羟基、氰基、氨基、卤素、c
1-6
的烷基、卤代(c
1-6
烷基)、羟基(c
1-6
烷基)、c
1-6
烷氧基或c
1-6
烷胺基；
[0059]
q选自氰基、未取代的或r
10
取代的杂环烷基；
[0060]r10
独立地选自氢、羟基、氰基、c
1-8
烷基、氰基(c
1-8
烷基)、氨基(c
1-8
烷基)、c
1-8
烷胺基-c
1-8
烷基、羟基(c
1-8
烷基)、c
2-8
烯基、c
2-8
炔基、c
1-8
烷氧基-c
1-8
烷基、未取代的或r
10-1
取代的c
3-10
环烷基、未取代的或r
10-2
取代的杂芳基、未取代的或r
10-3
取代的杂环烷基、未取代的或r
10-4
取代的c
3-10
环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
10-5
取代的杂芳基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
10-6
取代的杂环烷基-(c
1-6
烷基)-、未取代的或r
10-7
取代的c
6-10
芳基、未取代的或r
10-8
取代的c
6-10
芳基-(c
1-6
烷基)-；其中所述的杂环烷基为“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”4-10元杂环烷基；所述的杂芳基为“杂原子选自n、o和s中的一种或多种，杂原子数为1-3个的”5-10元杂芳基；
[0061]r10-1
～r
10-8
独立地选自羟基、氰基、氨基、卤素、c
1-6
的烷基、卤代(c
1-6
烷基)、羟基(c
1-6
烷基)、c
1-6
烷氧基或c
1-6
烷胺基；
[0062]
w选自o、nr
10
、s；
[0063]
z选自氢、c
1-8
烷基、氰基(c
1-8
烷基)、氨基(c
1-8
烷基)、c
1-8
烷胺基-c
1-8
烷基、羟基 (c
1-8
烷基)、c
2-8
烯基、c
2-8
炔基、环烷基；
[0064]
进一步地，在式i各部分的上述定义中，各部分的优选基团如下：
[0065]
a的优先定义为nr1r2、or3，其中
[0066]
nr1r2选自以下基团：
[0067]
[0068][0069]
or3选自以下基团：
[0070][0071]
[0072]
其中u1选自氢、羟基、卤素、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基或羟甲基；
[0073]
u2选自氢、羟基、氨基、卤素、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、酯基、羧基、硝基、氰基、苯氧基或羟甲基；
[0074]
u3选自甲基、乙基或异丙基；
[0075]
a可以更优选为：
[0076]
[0077][0078]
m优选为1；
[0079]
b的优选部分为：
[0080]
[0081][0082]
其中，u4选自氢、甲基、三氟甲基、甲氧基、羟基、氨基、羧酸、卤素；
[0083]
b的最优选部分为：
[0084][0085]
z的优选部分为：氢或甲基；
[0086]
w的优选基团为：o或nh；
[0087]
t的优选部分为：
[0088]
其中，r8的优选部分为氢、甲基或乙基；
[0089]
r9的优选部分为氢或甲基；
[0090]
q的优选部分为氰基、环氧丙基；
[0091]
式i所示的以下单元：为环结构。它可以为五元环或六元环结构；
[0092]
其五元环的优选部分可以表示为c、d、e式：
[0093][0094]
其中a的定义同上；
[0095]
c式可进一步表示为：
[0096]
[0097]
其中，r
13
选自以下部分：
[0098][0099]r14
、r
15
可以相同或者不相同，并且独立地选自以下部分：
[0100][0101]r14
、r
15
也可以与它们相连的氮原子一起形成环状结构，优选部分可以表示为：
[0102][0103]r16
选自以下部分：
[0104][0105]
d式的优先定义为：
[0106][0107]
e式优先定义为：
[0108]
[0109]
式i所示的以下单元：其六元环的优选部分可以表示为：
[0110][0111][0112]
式i所示的以下单元：其最优选部分为：
[0113][0114]
进一步地，所述的如式i所示化合物为以下任一化合物：
[0115]
[0116]
[0117]
[0118]
[0119]
[0120]
[0121]
[0122]
[0123]
[0124]
[0125]
[0126]
[0127]
[0128]
[0129]
[0130]
[0131][0132]
上述的拟肽类化合物及其衍生物的制备方法，所述制备方法为：
[0133]
原料1与n-boc-氨基酸溶于n,n-二甲基甲酰胺中，在n,n,n’,n
’‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲和n-甲基吗啉条件下缩合得到化合物2；化合物2在氢氧化钠水溶液存在下，碱性水解，再通过盐酸调节至酸性，得到化合物3；化合物3与r1的异氰酸酯或r1的异硫氰酸酯在碱性条件下反应，得到化合物4；化合物4加入氢氧化钠溶液反应，再通过盐酸调节至酸性，得到化合物5；
[0134]
原料6与双三甲基硅基氨基锂和溴乙腈反应，得到化合物7；化合物7加入六水合氯化钴和硼氢化钠反应，得到化合物8；化合物8加入氨水反应，得到化合物9；化合物9加入醋酸钯、二氯乙腈反应，得到化合物10；化合物10加入氯化氢的二氧六环溶液反应，得到化合物11；化合物11、化合物5、n,n,n’,n
’‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1
‑ꢀ
基)六氟磷酸脲、n-甲基吗啉反应，得到化合物(i-i)；
[0135]
[0136][0137]
或者，原料3先与三光气(或硫光气)生成异(硫)氰酸酯，再与仲胺(或醇)反应，得到化合物13；化合物13与氢氧化钠溶液反应后，用盐酸调至酸性，得到化合物 14a；化合物11、化合物14a、n,n,n’,n
’‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲、 n-甲基吗啉反应，得到化合物(i-ii)；
[0138][0139]
或者，化合物8与氯化氢的二氧六环反应得到化合物15；化合物14b、化合物15、 n,n,n’,n
’‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲、n-甲基吗啉反应得到化合物 16；化合物16与硼氢化钠反应得到化合物17；化合物17与戴斯马丁试剂反应，得到化合物18；化合物18与三甲基碘化亚砜和氢化钠反应，得到化合物(i-iii)；
[0140][0141]
或者，化合物19与氢化钠、二碳酸二叔丁酯反应，得到化合物20；化合物20再与氢化钠、三氟乙酸酐、胺反应，得到化合物21；化合物3、化合物21在氯化汞的作用下与化合物3反应得到化合物22；化合物22与氢氧化钠反应，再用盐酸调节至酸性得到化合物23；化合物11、化合物23溶于n,n-二甲基甲酰胺中，加入n,n,n’,n
’‑
四甲基
ꢀ‑
o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲和n-甲基吗啉反应，得到化合物24；化合物24与氯化氢的二氧六环溶液反应，得到化合物(i-iv)；
[0142]
[0143][0144]
或者，化合物3、丙二酸与n,n,n’,n
’‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲和n-甲基吗啉反应，得到化合物25；化合物25与另一分子的胺与n,n,n’,n
’‑
四甲基
ꢀ‑
o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲和n-甲基吗啉反应，得到化合物26；化合物26与氢氧化钠溶液反应，再用盐酸调节至酸性得到化合物27；将化合物27和化合物11溶于 n,n-二甲基甲酰胺中，加入n,n,n’,n
’‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲和 n-甲基吗啉反应，得到化合物(i-v)；
[0145][0146]
或者，化合物3与r3取代的n-氰基羰亚胺二酯反应得到化合物28；化合物28与氢氧化钠溶液反应，再用盐酸调节至酸性得到化合物29；将化合物29和化合物11溶于 n,n-二甲基甲酰胺中，加入n,n,n’,n
’‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲和 n-甲基吗啉反应，得到化合物(i-vi)；
[0147][0148]
包含上述拟肽类化合物和/或衍生物以及药学上可接受的载体的药物组合物。在所述的药物组合物中，拟肽类化合物和/或衍生物的用量可为治疗有效量。
[0149]
上述拟肽类化合物及其衍生物、上述的药物组合物在制备rna病毒的3c样半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的应用。
[0150]
上述拟肽类化合物及其衍生物、上述的药物组合物在制备药物或疫苗佐剂中的应用，所述的药物为用于治疗病毒感染的药物；所述的疫苗佐剂为用于治疗病毒感染的疫苗佐剂；所述病毒感染为sars-cov、hbv、hcv、h1n1、ebola、sars-cov-2中的一种或多种。
[0151]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)该类小分子及其衍生物对rna病毒的3c样半胱氨酸蛋白酶具有高效的抑制活性；(2)该类拟肽类化合物及其衍生物和药物组合物应用广泛，可制备为治疗/预防sars-cov、hbv、hcv、h1n1、 ebola或sars-cov-2病毒感染疾病的药物，ic
50
值最优可达到纳摩尔浓度级别。(3) 化合物制备方法易操作，反应底物适用性广。
具体实施方式
[0152]
下面对本发明的技术方案作进一步说明。
[0153]
实施例1：合成化合物s1
[0154]
(1r,2s,5s)-3-((s)-2-(3-(叔丁基)脲基)-3,3-二甲基丁酰基)-n-((s)-1-氰基-2-((s)-2-氧吡咯烷-3-基)乙基)-6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酰胺(s1)
[0155]
[0156][0157]
步骤一：合成化合物2
[0158]
称取原料1(2g，10mmol)，n-boc-l-叔亮氨酸(2.3g，10mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(20ml)中，0℃下加入n,n,n
′
,n
′‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(3.7g，12mmol)和n-甲基吗啉(3.3ml，30mmol)，维持0℃反应3h。加入饱和氯化铵溶液(20ml)淬灭，用乙酸乙酯(30ml
×
3)萃取，饱和食盐水(30ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(pe：ea＝10:1)得到白色泡沫状固体化合物2(2.8g，75％)。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ5.11(d,j＝10.2hz,1h), 4.46(s,1h),4.20(d,j＝10.3hz,1h),3.99(d,j＝10.2hz,1h),3.86(ddd,j＝10.2,3.4,1.5 hz,1h),3.74(s,3h),1.44(d,j＝1.5hz,1h),1.40(d,j＝9.0hz,10h),1.02(d,j＝5.9hz, 12h),0.89(s,3h).
[0159]
步骤二：合成化合物3
[0160]
称取化合物2(2.8g，7.3mmol)溶于二氧六环(20ml)溶液中，0℃下缓慢滴入氯化氢的二氧六环(18ml，73mmol)溶液，室温搅拌6h。停止反应，减压除去溶剂，得白色固体，直接用于下步反应。
[0161]
步骤三：合成化合物4
[0162]
将上步所得固体溶于无水二氯甲烷(20ml))中，0℃下滴加三乙胺(1.2ml，8.8 mmol)，搅拌10min后，再缓慢滴加叔丁基异氰酸酯(868mg，8.8mmol)，室温反应4 h。停止反应，加入饱和氯化铵溶液(20ml)淬灭，用乙酸乙酯(30ml
×
3)萃取，饱和食盐水(30ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(dcm： meoh＝20:1)得到白色固体化合物4(1.8g，两步总产率为65％)。1h nmr(400mhz, chloroform-d)δ5.09(d,j＝10hz,1h),4.49(s,1h),4.17(d,j＝10.3hz,1h),3.89(d,j＝ 10.2hz,1h),3.80(ddd,j＝10.2,3.4,1.5hz,1h),3.75(s,3h),1.48(d,j＝1.5hz,1h), 1.35(d,j＝9.0hz,10h),0.99(d,j＝5.9hz,12h),0.88(s,3h).
[0163]
步骤四：合成化合物5
[0164]
将化合物4(1.5g，4.0mmol)溶于四氢呋喃(20ml)中，0℃下缓慢滴加1m氢氧化钠溶液(8ml，8mmol)，室温反应2h后，加入乙酸乙酯(20ml)，待分层后取水相，加入1m盐酸溶液(10ml)调节ph至酸性，过滤，用水洗涤得白色固体化合物5(1.2g，82％)。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ5.08(d,j＝10hz,1h),4.50(s,1h), 4.16(d,j＝10.3hz,1h),3.88(d,j＝10.2hz,1h),3.82(ddd,j＝10.2,3.4,1.5hz,1h), 1.47(d,j＝1.5hz,1h),1.38(d,j＝9.0hz,10h),1.01(d,j＝5.9hz,12h),0.91(s,3h).
[0165]
步骤五：合成化合物7
[0166]
称取原料6(20g，72mmol)溶于无水四氢呋喃(250ml)中，在氮气氛围下于-78℃下，
缓慢滴加双三甲基硅基氨基锂(154ml，154mmol)，搅拌1h后，再缓慢滴加溴乙腈(5.1ml，76mmol)的四氢呋喃(30ml)溶液，搅拌3h后，加入冷的甲醇(12 ml)溶液和醋酸(12ml)的四氢呋喃(80ml)溶液淬灭，缓慢升温至室温，减压除去溶剂，用乙酸乙酯(300ml)萃取，饱和食盐水(200ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(pe：ea＝5:1)得到无色液体7(18g，77％)。1h nmr (300mhz,chloroform-d)δ5.12(d,j＝8.8hz,1h),4.44
–
4.28(m,1h),3.76(s,3h),3.75 (s,3h),2.82(dq,j＝17.8,4.8,3.3hz,3h),2.25
–
2.06(m,2h),1.44(s,9h).
[0167]
步骤六：合成化合物8
[0168]
将所得化合物7(10.6g，33.7mmol)溶于甲醇(250ml)中，加入六水合氯化钴 (4.8g，20.23mmol)，0℃下分批加入硼氢化钠(7.7g，202.3mmol)固体，室温反应过夜。停止反应，加入饱和氯化铵溶液(100ml)淬灭，硅藻土过滤，减压除去溶剂，用乙酸乙酯(200ml)萃取，饱和食盐水(200ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(pe：ea＝1:2)得白色泡沫状固体化合物8(4.8g，50％)。1h nmr (300mhz,chloroform-d)δ6.12(s,1h),5.49(s,1h),4.31(d,j＝10.7hz,1h),3.74(s,3h), 3.41
–
3.27(m,2h),2.56
–
2.32(m,2h),2.13(ddd,j＝14.4,10.7,3.7hz,1h),1.98
–
1.75 (m,2h),1.43(s,9h).
[0169]
步骤七：合成化合物9
[0170]
将化合物8(650mg，2.8mmol)溶于甲苯(2.5ml)中，0℃下滴入氨水(2.5ml， 3.4mmol)，室温反应过夜。停止反应，减压除去溶剂，用乙酸乙酯(10ml)萃取，饱和食盐水(10ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(ea)得白色固体化合物9(704mg，93％)。1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ7.64(s,1h),7.28(s, 1h),7.04
–
6.96(m,1h),6.92(d,j＝8.4hz,1h),3.89(ddd,j＝10.7,8.4,4.3hz,1h),3.14 (dt,j＝8.8,4.6hz,2h),2.29
–
2.07(m,2h),1.88(ddd,j＝14.7,10.8,3.8hz,1h),1.72
–ꢀ
1.57(m,1h),1.53
–
1.42(m,1h),1.37(s,9h).
[0171]
步骤八：合成化合物10
[0172]
将化合物9(100mg，0.37mmol)、醋酸钯(1mg)溶于水(0.5ml)和乙腈(0.5ml) 中，氮气置换三次，0℃下缓慢滴加二氯乙腈(60μl)，室温搅拌10min后，60℃反应 2h。停止反应，加入乙酸乙酯(5ml)稀释，用乙酸乙酯(10ml)萃取，饱和食盐水 (10ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(ea)得白色固体化合物10(77mg，82％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.82(d,j＝8.3hz,1h),7.73 (s,1h),4.72(q,j＝8.1hz,1h),3.21
–
3.09(m,2h),2.35
–
2.23(m,1h),2.18(dddd,j＝ 12.1,8.9,5.9,3.4hz,1h),2.03(dt,j＝15.7,8.2hz,1h),1.72(ddt,j＝23.8,12.2,8.5hz, 2h),1.41(s,9h).
[0173]
步骤九：合成化合物11
[0174]
取化合物10(70mg，0.28mmol)溶于二氧六环溶液中，0℃下缓慢滴入氯化氢的二氧六环(0.7ml，2.8mmol)溶液，室温搅拌6h。停止反应，减压除去溶剂，得白色固体，直接用于下步反应。
[0175]
步骤十：合成化合物s1
[0176]
将化合物11(50mg，0.26mmol)、化合物5(97mg，0.26mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(5ml)中，0℃下加入n,n,n
′
,n
′‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(118mg，0.31mmol)和n-甲基吗啉(0.1ml，0.78mmol)，维持0℃反应3h。加入饱和氯化铵溶液(5ml)淬
灭，用乙酸乙酯(10ml
×
3)萃取，饱和食盐水(10ml) 洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(ea)得到白色固体化合物 s1(80mg，61％)。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ5.12(d,j＝10hz,1h),4.79(q,j ＝8.1hz,1h),4.46(s,1h),4.10(d,j＝11hz,1h),3.87(d,j＝11hz,1h),3.79(ddd,j＝ 10.2,3.4,1.5hz,1h),3.31
–
3.15(m,2h),2.28
–
2.20(m,1h),2.19-2.05(m,1h),1.96(dt, j＝15.7,8.2hz,1h),1.66(ddt,j＝19.4,10.2,8.5hz,2h),1.43(d,j＝1.5hz,1h),1.31(d, j＝9.2hz,10h),0.95(d,j＝8.0hz,12h),0.89(s,3h).ms(ei,m/z):503(m

1).
[0177]
采用实施例1的合成方法，可以合成化合物(i-i)：
[0178][0179]
具体合成的化合物如表1所示。
[0180]
表1使用实施例1的合成方法合成的化合物
[0181]
[0182]
[0183]
[0184]
[0185]
[0186]
[0187]
[0188]
[0189]
[0190]
[0191]
[0192]
[0193]
[0194]
[0195]
[0196]
[0197]
[0198]
[0199]
[0200]
[0201]
[0202]
[0203]
[0204]
[0205]
[0206]
[0207]
[0208]
[0209]
[0210]
[0211]
[0212]
[0213]
[0214]
[0215]
[0216]
[0217]
[0218][0219]
实施例2：合成化合物s39
[0220][0221]
步骤一：合成化合物13
[0222]
称取三光气(930mg，3.1mmol)溶于无水二氯甲烷(5ml)中，氮气保护下于0℃下加入原料3(1g，3.1mmol)，搅拌5min后，缓慢滴入三乙胺(0.9ml，6.2mmol)，室温搅拌2h后，移至0℃下缓慢滴入异丁醇(0.6ml，6.2mmol)，室温反应过夜。停止反应，加入饱和氯化铵溶液(10ml)淬灭，硅藻土过滤，减压除去溶剂，用二氯甲烷(10ml)萃取，饱和食盐水(10ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(dcm：meoh＝20:1)得到无色液体化合物13(734mg，62％)。1h nmr(300 mhz,chloroform-d)δ4.68
–
4.62(m,1h),4.24(d,j＝4.8hz,1h),4.17(d,j＝8.1hz,1h), 3.87(s,3h),3.54(dd,j＝12.6,4.8hz,1h),3.33(dd,j＝13.2,5.1hz,1h),1.60
–
1.52(m, 5h),1.03
–
0.98(m,17h),0.92(s,3h).
[0223]
步骤二：合成化合物14
[0224]
将化合物13(500mg，1.3mmol)溶于四氢呋喃(5ml)中，0℃下缓慢滴加1m氢氧化钠溶液(2.6ml，2.6mmol)，室温反应2h后，加入乙酸乙酯(10ml)，待分层后取水相，加入1m盐酸溶液(5ml)调节ph至酸性，过滤，用水洗涤得白色固体化合物5(420mg，88％)。1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ4.69
–
4.64(m,1h),4.20(d,j＝ 4.5hz,1h),4.12(d,j＝7.8hz,1h),3.58(dd,j＝12.8,4.3hz,1h),3.30(dd,j＝13.2,4.8 hz,1h),1.62
–
1.54(m,5h),1.05
–
0.97(m,17h),0.88(s,3h).
[0225]
步骤三：合成化合物s39
[0226]
将化合物11(50mg，0.26mmol)、化合物14(95mg，0.26mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(5ml)中，0℃下加入n,n,n
′
,n
′‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(118mg，0.31mmol)和n-甲基吗啉(0.1ml，0.78mmol)，维持0℃反应3h。加入饱和氯化铵溶液(5ml)淬灭，用乙酸乙酯(10ml
×
3)萃取，饱和食盐水(10ml) 洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制
砂，柱层析纯化(ea)得到白色固体化合物 s1(94mg，72％)。1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ4.69
–
4.64(m,2h),4.20(d,j＝4.5 hz,1h),4.12(d,j＝7.8hz,1h),3.58(dd,j＝12.8,4.3hz,1h),3.45
–
3.30(m,3h),2.12
–ꢀ
2.08(m,5h),1.62
–
1.54(m,5h),1.05
–
0.97(m,17h),0.88(s,3h).ms(ei,m/z):504 (m

1).
[0227]
采用实施例2的合成方法，可以合成化合物(i-ii)：
[0228][0229]
具体合成的化合物如表2所示。
[0230]
表2使用实施例2的合成方法合成的化合物
[0231]
[0232]
[0233]
[0234]
[0235]
[0236]
[0237]
[0238]
[0239]
[0240]
[0241]
[0242][0243]
实施例3：合成化合物s173
[0244][0245]
步骤一：合成化合物15
[0246]
称取化合物8(2.0g，7.0mmol)溶于二氧六环溶液中，0℃下缓慢滴入氯化氢的二氧
六环(17.6ml，70mmol)溶液，室温搅拌6h。停止反应，减压除去溶剂，得白色固体，直接用于下步反应。
[0247]
步骤二：合成化合物16
[0248]
将化合物5(1.7g，4.5mmol)、化合物15(1.0g，4.5mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(20ml)中，0℃下加入n,n,n
′
,n
′‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(2.1 g，5.4mmol)和n-甲基吗啉(1.5ml，13.5mmol)，维持0℃反应3h。加入饱和氯化铵溶液(20ml)淬灭，用乙酸乙酯(30ml
×
3)萃取，饱和食盐水(30ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(ea)得到白色固体化合物16(1.5g， 62％)。1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ4.62
–
4.57(m,1h),4.44(d,j＝4.2hz,1h), 4.25(s,1h),3.56(s,3h),3.59(dd,j＝12.0,4.1hz,1h),3.49
–
3.34(m,3h),2.16
–
2.08(m, 5h),1.45
–
1.37(m,9h),1.05
–
0.97(m,14h),0.88(s,3h).ms(ei,m/z):536(m

1).
[0249]
步骤三：合成化合物17
[0250]
取化合物16(1.0g，1.8mmol)溶于甲醇(20ml)中，在氮气氛围下于0℃下缓慢分批次加入硼氢化钠(141mg，3.6mmol)，移至室温反应过夜。在0℃下加入饱和氯化铵溶液(10ml)淬灭，减压除去溶剂，用乙酸乙酯(20ml
×
3)萃取，饱和食盐水 (20ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(pe：ea＝1：2) 得到白色固体化合物17(711mg，78％)。1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ4.39(d,j＝ 2.9hz,1h),4.20(s,1h),3.92(dd,j＝4.8,2.1hz,1h),3.53
–
3.48(m,3h),3.42(dd,j＝ 12.5,4.4hz,1h),3.36
–
3.27(m,3h),2.15
–
2.06(m,5h),1.43
–
1.36(m,9h),1.04
–
0.95 (m,14h),0.89(s,3h).ms(ei,m/z):508(m

1).
[0251]
步骤四：合成化合物18
[0252]
取化合物17(600mg，1.2mmol)溶于无水二氯甲烷(10ml)中，缓慢加入戴斯马丁试剂(602mg，1.4mmol)，移至室温反应5h。在0℃下加入饱和碳酸氢钠(5ml) 和饱和亚硫酸钠溶液(5ml)淬灭，减压除去溶剂，硅藻土过滤，用二氯甲烷(10ml
×
3) 萃取，饱和碳酸氢钠(10ml)、饱和食盐水(10ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(pe：ea＝1：2)得到白色固体化合物18(460mg，76％)。1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ4.41(dd,j＝5.2,2.3hz,1h),4.39(d,j＝2.9hz,1h), 4.20(s,1h),3.41(dd,j＝12.6,4.4hz,1h),3.37
–
3.29(m,3h),2.12
–
2.04(m,5h),1.41
–ꢀ
1.35(m,9h),1.02
–
0.94(m,14h),0.88(s,3h).ms(ei,m/z):506(m

1).
[0253]
步骤五：合成化合物s173
[0254]
取三甲基碘化亚砜(220mg，1.0mmol)和氢化钠(42mg，1.0mmol)溶于无水四氢呋喃(10ml)中，在氮气氛围下回流反应2h，待反应完全后，维持55℃缓慢滴加化合物18(400mg，0.8mmol)的四氢呋喃(10ml)溶液，继续反应2h。减压除去溶剂，用乙酸乙酯(20ml
×
3)萃取，饱和食盐水(20ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(pe：ea＝1：2)得到无色液体化合物s173(216mg，52％)。1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ4.35(d,j＝3.2hz,1h),4.20(s,1h),3.66(ddd,j＝8.9, 4.6,2.1hz,1h),3.53
–
3.48(m,3h),3.42(dd,j＝12.5,4.4hz,1h),3.09
–
3.02(m,1h), 2.66
–
2.59(m,2h),2.15
–
2.06(m,3h),1.74
–
1.68(m,2h),1.43(s,9h),1.04
–
0.95(m, 14h),0.90(s,3h).ms(ei,m/z):520(m

1).
[0255]
采用实施例3的合成方法，可以合成化合物(i-iii)：
[0256][0257]
具体合成的化合物如表3所示。
[0258]
表3使用实施例3的合成方法合成的化合物
[0259]
[0260]
[0261]
[0262]
[0263]
[0264]
[0265]
[0266]
[0267]
[0268]
[0269]
[0270][0271]
实施例4：合成化合物s238
[0272][0273]
步骤一：合成化合物20
[0274]
将氢化钠(11.8g，296mmol)悬浮于四氢呋喃(450ml)中，0℃下缓慢滴加化合物19(5.0g，65.7mmol)的四氢呋喃(50ml)溶液，搅拌10min后移至室温反应1h，再在0℃下缓慢滴加二碳酸二叔丁酯(32ml，145mmol)，室温反应4h。用饱和碳酸氢钠溶液(50ml)淬灭，减压除去溶剂，加入石油醚(200ml)，室温搅拌30min，过滤得白色固体化合物20(14.3g，79％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.44(s,2h), 1.45(s,18h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ179.6,154.2,85.3,27.8.ms(ei,m/z):278 (m

1).
[0275]
步骤二：合成化合物21
[0276]
将化合物20(4.0g，14.5mmol)溶解与四氢呋喃(20ml)中，在0℃下缓慢加入氢化钠(696mg，17.4mmol)，搅拌1h后加入三氟乙酸酐(2.2ml，15.9mmol)，维持0℃搅拌1h后，加入异丙胺(1.4ml，15.9mmol)的四氢呋喃(15ml)溶液，室温反应过夜。加入饱和氯化铵溶液(10ml)淬灭，减压除去溶剂，用乙酸乙酯(20ml
×
3) 萃取，饱和食盐水(20ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化 (pe：ea＝10:1)得到淡黄色固体化合物21(3.1g，99％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6) δ10.53(s,1h),9.68(d,j＝7.2hz,1h),4.43
–
4.31(m,1h),1.44(s,9h),1.20(s,3h),1.18 (s,3h).
13
c nmr(125mhz,dmso-d6)δ187.2,153.5,84.8,51.0,28.4,23.1.ms(ei,m/z): 219(m

1).
[0277]
步骤三：合成化合物22
[0278]
将化合物3(1.0g，3.1mmol)和化合物21(685mg，3.1mmol)溶于二氯甲烷中 (10ml)，0℃下加入三乙胺(1.1ml，7.7mmol)，搅拌10min后再分批加入氯化汞(1.2 g，4.6mmol)，室温反应过夜。硅藻土过滤，用二氯甲烷(10ml
×
3)萃取，饱和食盐水(10ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(pe：ea＝2:1) 得到白色固体化合物22(621mg，43％)。1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ4.44
–
4.37 (m,1h),4.21(d,j＝5.6hz,1h),3.65(s,3h),3.53
–
3.45(m,3h),1.64(dd,j＝8.4,4.0hz, 1h),1.45(s,9h),1.21(s,3h),1.19(s,3h),1.01
–
0.97(m,10h),0.95(s,3h),0.91(s,3h).
[0279]
步骤四：合成化合物23
[0280]
将化合物22(600mg，1.3mmol)溶于四氢呋喃(8ml)中，0℃下缓慢滴加1m氢氧化钠溶液(2.6ml，2.6mmol)，室温反应2h后，加入乙酸乙酯(10ml)，待分层后取水相，加入1m盐酸溶液(4ml)调节ph至酸性，过滤，用水洗涤得白色固体化合物23(510mg，88％)。1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ4.43
–
4.36(m,1h),4.27(d,j ＝5.6hz,1h),3.52
–
3.43(m,3h),
1.65(dd,j＝8.3,4.1hz,1h),1.46(s,9h),1.20(s,3h), 1.18(s,3h),1.01
–
0.95(m,13h),0.92(s,3h).
[0281]
步骤四：合成化合物24
[0282]
将化合物11(210mg，1.1mmol)、化合物23(500mg，1.1mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(6ml)中，0℃下加入n,n,n
′
,n
′‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(502mg，1.3mmol)和n-甲基吗啉(0.4ml，3.3mmol)，维持0℃反应3h。加入饱和氯化铵溶液(10ml)淬灭，用乙酸乙酯(10ml
×
3)萃取，饱和食盐水(10ml) 洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(ea)得到白色固体化合物 16(368mg，57％)。1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ4.51(dd,j＝7.2,3.2hz,1h),4.43
ꢀ–
4.36(m,1h),4.27(d,j＝5.6hz,1h),3.52
–
3.43(m,5h),2.10
–
1.98(m,5h),1.65(dd,j ＝8.3,4.1hz,1h),1.46(s,9h),1.20(s,3h),1.18(s,3h),1.01
–
0.95(m,13h),0.92(s,3h).
[0283]
步骤五：合成化合物s238
[0284]
称取化合物24(300mg，0.5mmol)溶于二氧六环(3ml)溶液中，0℃下缓慢滴入氯化氢的二氧六环(1.3ml，5mmol)溶液，室温搅拌6h。停止反应,加入饱和碳酸氢钠调节ph至8，用二氯甲烷(5ml
×
3)萃取，饱和食盐水(5ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(dcm：meoh＝15:1)得到白色固体化合物s238(158mg，65％)。1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ4.53(dd,j＝7.4,3.3hz,1h), 4.42
–
4.34(m,1h),4.26(d,j＝5.8hz,1h),3.53
–
3.44(m,5h),2.11
–
1.99(m,5h),1.63 (dd,j＝8.6,4.0hz,1h),1.21(s,3h),1.18(s,3h),0.99
–
0.94(m,13h),0.91(s,3h).ms (ei,m/z):488(m

1).
[0285]
采用实施例4的合成方法，可以合成化合物(i-iv)：
[0286][0287]
具体合成的化合物如表4所示。
[0288]
表4使用实施例4的合成方法合成的化合物
[0289]
[0290]
[0291]
[0292]
[0293]
[0294]
[0295]
[0296][0297]
实施例5：化合物s373的合成
[0298][0299]
步骤一：合成化合物25
[0300]
将化合物3(1.0g，3.1mmol)、丙二酸(327mg，3.1mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(20ml)中，0℃下加入n,n,n
′
,n
′‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(1.3 g，3.4mmol)和n-甲基吗啉(1.0ml，9.3mmol)，维持0℃反应3h。加入饱和氯化铵溶液(20ml)淬灭，用乙酸乙酯(30ml
×
3)萃取，饱和食盐水(30ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(dcm：meoh＝20:1)得到白色固体化合物25(627mg，55％)。1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ4.24
–
4.20(m,2h),3.69(s, 3h),3.50(dd,j＝10.7,3.2hz,1h),3.31(dd,j＝12.4,4.3hz,1h),3.15(s,2h),1.61
–
1.57 (m,1h),1.03
–
0.96(m,13h),0.94(s,3h).
[0301]
步骤二：合成化合物26
[0302]
将化合物25(600mg，1.6mmol)、叔丁胺(0.17ml，1.6mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(10ml)中，0℃下加入n,n,n
′
,n
′‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲 (730mg，1.9mmol)和n-甲基吗啉(0.53ml，4.8mmol)，维持0℃反应3h。加入饱和氯化铵溶液(10ml)淬灭，用乙酸乙酯(20ml
×
3)萃取，饱和食盐水(20ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(pe：ea＝1:1)得到白色固体化合物26(453mg，67％)。1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ4.19
–
4.16(m,2h),3.62 (s,3h),3.51(dd,j＝10.9,4.3hz,1h),3.33(dd,j＝12.0,4.1hz,1h),3.10(s,2h),1.62
–ꢀ
1.59(m,1h),1.37(s,9h),1.05
–
0.98(m,13h),0.95(s,3h).
[0303]
步骤三：合成化合物27
[0304]
将化合物26(400mg，0.95mmol)溶于四氢呋喃(6ml)中，0℃下缓慢滴加1m 氢氧化钠溶液(2.0ml，2.0mmol)，室温反应2h后，加入乙酸乙酯(10ml)，待分层后取水相，加入1m盐酸溶液(4ml)调节ph至酸性，过滤，用水洗涤得白色固体化合物27(351mg，92％)。1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ4.17
–
4.12(m,2h),3.48(dd, j＝10.7,4.1hz,1h),3.34(dd,j＝11.6,4.0hz,1h),3.17(s,2h),1.61
–
1.57(m,1h),1.36 (s,9h),1.02
–
0.97(m,13h),0.95(s,3h).
[0305]
步骤四：合成化合物s373
[0306]
将化合物27(350mg，0.86mmol)、化合物11(320mg，0.86mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(10ml)中，0℃下加入n,n,n
′
,n
′‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(380mg，1.0mmol)和n-甲基吗啉(0.12ml，1.0mmol)，维持0℃反应3h。加入饱和氯化铵溶液(10ml)淬灭，用乙酸乙酯(20ml
×
3)萃取，饱和食盐水(20ml) 洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(ea)得到白色固体化合物 s373(210mg，45％)。1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ4.51(t,j＝3.2hz,1h),4.39
–ꢀ
4.35(m,2h),3.36
–
3.30(m,2h),3.07(s,2h),2.15
–
2.12(m,1h),2.09
–
2.04(m,4h), 1.38(s,9h),1.26(d,j＝4.6hz,1h),1.06
–
0.99(m,13h),0.96(s,3h).ms(ei,m/z):545 (m

1).
[0307]
采用实施例5的合成方法，可以合成化合物(i-v)：
[0308]
[0309]
具体合成的化合物如表5所示。
[0310]
表5使用实施例5的合成方法合成的化合物
[0311]
[0312]
[0313]
[0314]
[0315][0316]
实施例6：化合物s273的合成
[0317][0318]
步骤一：合成化合物30
[0319]
将化合物3(1.0g,3.1mmol)溶于二氯甲烷(20ml)中，加入三乙胺(0.5ml,3.5 mmol)，搅拌30min后，在0℃下缓慢滴加n-氰基羰亚胺二苯酯(886mg,3.7mmol) 的二氯甲烷溶液(10ml)，室温搅拌3h。加入饱和氯化铵溶液(10ml)，减压除去溶剂，用乙酸乙酯(20ml
×
3)萃取，饱和食盐水(20ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(pe：ea＝5:1)得到淡黄色固体化合物30(554mg， 42％)。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.28(dd,j＝8.7hz,2h),7.02
–
6.98(m,3h), 4.21(d,j＝4.6hz,1h),3.68(s,3h),3.42
–
3.99(m,1h),3.28
–
3.23(m,2h),1.66
–
1.63 (m,1h),1.01
–
0.99(m,1h),0.97
–
0.95(m,12h),0.91(s,3h).
[0320]
步骤二：合成化合物31
[0321]
将化合物30(500mg，1.2mmol)溶于四氢呋喃(5ml)中，0℃下缓慢滴加1m氢氧化钠溶液(2.5ml，2.4mmol)，室温反应2h后，加入乙酸乙酯(10ml)，待分层后取水相，加入1m盐酸溶液(5ml)调节ph至酸性，过滤，用水洗涤得白色固体化合物31(410mg，83％)。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.29(dd,j＝8.6hz,2h),7.02
ꢀ–
6.96(m,3h),4.23(d,j＝4.6hz,1h),3.40
–
3.97(m,1h),3.29
–
3.25(m,2h),1.67
–ꢀ
1.65(m,1h),1.03
–
1.00(m,1h),0.99
–
0.94(m,12h),0.91(s,3h).
[0322]
步骤三：合成化合物s273
[0323]
将化合物11(94mg，0.49mmol)、化合物31(200mg，0.49mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(10ml)中，0℃下加入n,n,n
′
,n
′‑
四甲基-o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(225mg，0.59mmol)和n-甲基吗啉(0.2ml，1.5mmol)，维持0℃反应3h。加入饱和氯化铵溶液(5ml)淬
灭，用乙酸乙酯(20ml
×
3)萃取，饱和食盐水(20ml) 洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，制砂，柱层析纯化(ea)得到白色固体化合物 s273(174mg，65％)。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ(300mhz,chloroform-d)δ7.35 (d,j＝3.5hz,2h),7.26
–
7.22(m,2h),7.12(d,j＝4.3hz,1h),4.79
–
4.72(m,1h),4.22(d, j＝4.8hz,1h),4.19(d,j＝8.8hz,1h),3.63(dd,j＝13.5,3.8hz,1h),3.52
–
3.34(m,3h), 2.11
–
2.01(m,5h),1.09
–
0.88(m,15h),0.84(s,3h).ms(ei,m/z):548(m 1).
[0324]
采用实施例6的合成方法，可以合成化合物(i-vi)：
[0325][0326]
具体合成的化合物如表6所示。
[0327]
表6使用实施例6的合成方法合成的化合物
[0328]
[0329]
[0330]
[0331]
[0332]
[0333]
μl)，随后将病毒-药物混合液吸取100μl/孔加入其中。
[0347]
7)根据细胞病变观察药物抗病毒能力：将细胞放入37℃co2培养箱中持续培养 48小时，使用倒置显微镜观察细胞病变，记录、统计分析结果。
[0348]
8)接种细胞：取处于对数生长期的huh 7细胞，使用0.25％胰酶-edta消化细胞，接种于孔板中。
[0349]
9)药物处理：使用通式i的化合物分别处理huh 7细胞，药物处理浓度为20μm。
[0350]
10)收集细胞：48小时后收集细胞，western blot检测蛋白表达。
[0351]
结果显示，s1-s393化合物相对于对照组对sars-cov-2感染的vero e6细胞能较好的抑制细胞病变的情况发生。证明s1-s393化合物对sars-cov-2有一定的抑制作用。
[0352]
实施例9：抗流感病毒实验
[0353]
1)细胞与病毒株
[0354]
madin-darby犬肾(mdck)细胞得自atcc，流感a/hawaii/70/2019(h1n1)、流感a/hong kong/45/2019(h3n2)由国家流感中心提供
[0355]
2)实验过程
[0356]
将mdck细胞接种于96孔板中，每孔细胞数为2
×
105/ml，待细胞长成单层后，感染一定数量的病毒(100tcid
50
)，在37℃下吸附2h后，用mem进行冲洗，换上不同浓度梯度的小分子化合物(0-500μg/ml)的维持液，在37℃，5％的二氧化碳的环境下进行孵育，同时设不含受试小分子化合物的病毒对照组和正常细胞对照组。当病毒对照组的细胞病变(cpe)达到4 时，观察并记录各组的cpe结果。抗病毒的活性采用 reed&muench方法计算，ec
50
＝antilog[a (50-b)/(c-b)
×
d]，其中a：log＜50％累加抑制剂的药物浓度；b：＜50％累加抑制率；c：＞50％累加抑制率；d：log稀释倍数。
[0357]
实施例10：抗sars-cov-2病毒实验
[0358]
1)细胞与病毒株
[0359]
非洲绿猴肾细胞(vero e6)得自atcc，2019betacov/wuhan/wiv04/2019由中国科学院武汉病毒研究所分离得到
[0360]
2)实验过程
[0361]
将vero e6细胞种于96孔板中，每孔3
×
105个细胞，在37℃，5％的二氧化碳的培养箱中过夜培养。待细胞长成单层后，用pbs洗涤一次，加入sars-cov-2病毒 (moi＝0.03)，吸附2h后弃病毒液，用pbs洗3次后加入含有梯度稀释的小分子化合物的2％低熔点琼脂糖-dmem(4％fbs)培养基。在37℃，5％的二氧化碳的培养箱中培养4天后采用4％的多聚甲醛固定15min，清洗3次，加入0.8％结晶紫染色10min，清洗三次并烘干。采用酶联荧光斑点分析仪(ctl，immunospot s6 universal)进行图片采集并对噬斑进行统计。根据噬斑数绘制剂量反应曲线，计算半数有效浓度ec
50
。
[0362]
细胞毒性实验
[0363]
取处于指数生长期的mdck细胞和vero细胞种在96孔板上，每孔2
×
104个细胞，然后给予受试小分子化合物，质量浓度范围为0-2000μg/ml，在37℃，5％的二氧化碳的培养箱中培养2天。mdck细胞和vero细胞的毒性试验采用cpe法，受试小分子化合物对细胞的半数细胞毒性浓度cc
50
采用reed&muench方法计算，cc
50
＝ antilog[a (50-b)/(c-b)
×
d]，其中a：log＜50％累加抑制剂的药物浓度；b：＜50％累加抑制率；c：＞50％累加抑制率；d：log稀
释倍数。
[0364]
表6为本发明化合物对流感病毒、sars-cov-2病毒的活性和细胞毒性结果：
[0365]
其中，si＝cc
50
/ec
50
；
[0366]
a:ec
50
《1μm,b:ec
50
＝10μm-1μm,c:ec
50
》10μm；
[0367]
α:si》50,β:si＝1-50,γ:si《1；
[0368]
表6化合物s1-s393对h1n1、h3n2和sars-cov-2的活性和细胞毒性
[0369]
[0370]
[0371]
[0372][0373]
上述细胞实验证明本发明化合物可以有效地抑制流感病毒和sars-cov-2病毒，对其他rna病毒可能也有相同的结果，该系列化合物能够应用在制备抗rna病毒药物中。