一种裂蹄木层孔菌的miR-CM1及其应用的制作方法

一种裂蹄木层孔菌的mir-cm1及其应用
技术领域：
1.本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种来自裂蹄木层孔菌的mir-cm1的分离和鉴定，尤其涉及mir-cm1的应用。


背景技术：

2.皮肤是人体的第一道防线，最易受到外界环境的影响而导致皮肤受损和老化。其中，诱发皮肤衰老的最重要因素就是紫外线。太阳的紫外线辐射导致皮肤老化，其特点是表皮角化不良伴异常增生，胶原减少，失去弹性，皱纹等。紫外线照射能够引起基质金属蛋白酶在光照损伤部位中表达，降解皮肤胶原蛋白。此外，紫外线可以通过活性氧介导炎症导致衰老。现代社会，随着人们对护肤重要性不断了解，对护肤知识不断增加，护肤已成为一种日常，且防晒产品已经逐渐作为人们日常使用的化妆品之一。因此，探究和开发抗衰老的护肤品的原料和机制有着较大的现实意义前景。
3.mical2是一种单加氧酶，可直接结合并增强f-肌动蛋白的解聚。在缺乏肌动蛋白的情况下，它还作为nadph氧化酶产生h2o2，它参与调节细胞骨架动力学和相关的基本生物学过程。mical2还参与血管生成、囊泡转运和囊泡转运；并且与多种肿瘤的发生和发展有关。过氧化氢(h2o2)、紫外线等都能导致持续的活性氧(ros)刺激，从而导致人皮肤细胞衰老。
4.裂蹄木层孔菌是一种典型的药用真菌，含有多糖，多酚，黄酮等化合物。越来越多的研究表明，裂蹄木层孔菌在抗肿瘤，保肝，减轻炎症反应，控制血糖等方面发挥着显著的调控作用。例如，从它身上分离的多糖可以抑制细胞中各种炎症因子的表达。此外，其水溶性提取物在特应性皮炎中发挥免疫调节作用。裂蹄木层孔菌提取物被列入已使用化妆品原料目录(2021年版)。目前，裂蹄木层孔菌提取物现已经被用于各种护肤品和化妆品的配方中。
5.microrna(mirna)是一类长度约为19-25nt的内源性非编码rna。mirna参与基因转录后调控，能够调节细胞和机体的生长，发育，并与人类的疾病相关。越来越多的研究表明，外源性的植物mirnas可以调节哺乳动物靶基因的表达，实现跨界调控。例如，张辰宇发现金银花中的mir2911可以被小鼠吸收，通过靶向甲流病毒而抑制病毒复制。本技术发现裂蹄木层孔菌中的mirna能够对人源的皮肤细胞进行跨界调节，发挥抵抗衰老的活性。这在抗衰护肤品的研发中有巨大的潜在应用价值。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种裂蹄木层孔菌的mir-cm1及其应用，其中mir-cm1可控制mical2基因的下调表达，进一步改变下游皮肤衰老标志物的表达，在抗衰护肤品的开发和应用中有潜在的价值。
7.本发明提供的技术方案之一，是一种来自裂蹄木层孔菌的mirna，具体为mir-cm1，具有seq id no.1所示的核苷酸序列；
8.进一步地，所述mir-cm1的前体序列mir-cm1，具有seq id no.2所示的核苷酸序列；
9.进一步地，编码所述前体序列mir-cm1的dna，具有seq id no.3所示的核苷酸序列。
10.本发明提供的技术方案之二，是上述mir-cm1的应用；
11.进一步地，所述应用是mir-cm1在调控mical2基因表达中的应用；
12.更进一步地，所述mical2基因在ncbi数据库中的gene id:9645；
13.进一步地，所述应用是mir-cm1在护肤品、化妆品或美妆产品中的应用，以及在制备预防或治疗光老化产品中的应用；所述mir-cm1可以靶向mical2的3’utr，降低mical2的表达(匹配结果如图2所示)。
14.本发明提供的技术方案之三，是含有上述mir-cm1的皮肤外用剂；
15.进一步地，所述皮肤外用剂包括但不限于护肤品、化妆品、或涂抹剂等；
16.所述涂抹剂包括但不限于油剂、水剂、膏剂或凝胶剂等；
17.进一步地，所述的mir-cm1在皮肤外用剂中的添加量为0.2％-5％(重量百分比)；
18.进一步地，所述皮肤外用剂以水、精华液、凝胶、乳液、肌底液或霜中至少一种形式存在；
19.进一步地，一种含有mir-cm1的乳液，包含如下成分(按重量百分比计)：edta二钠0.01-0.05％，甘油2-5％，黄原胶0.05-0.2％，对羟基苯乙酮0.1-0.3％，montanov l-乳化剂0.5-3％，arlacel 170乳化剂0.5-3％，甘油硬脂酸酯0.1-0.5％，鲸蜡硬脂醇0.5-3％，辛酸/癸酸甘油三酯2-6％，聚二甲基硅氧烷0.5-3％，甲基丙二醇0.1-0.5％，聚乙烯亚胺-1500 0.5-3％，透明质酸钠0.5-3％，mir-cm10.2-5％，余量为去离子水；
20.优选地，mir-cm1的添加量为0.5-1％；
21.优选地，所述含有mir-cm1的乳液，包含如下成分(按重量百分比计)：edta二钠0.03％，甘油4％，黄原胶0.1％，对羟基苯乙酮0.2％，montanov l-乳化剂1％，arlacel170乳化剂1％，甘油硬脂酸酯0.3％，鲸蜡硬脂醇1％，辛酸/癸酸甘油三酯4％，聚二甲基硅氧烷1％，甲基丙二醇0.35％，聚乙烯亚胺-1500 1％，透明质酸钠1％，mir-cm1 0.75％，余量为去离子水。
22.本发明提供的技术方案之四，是上述含有mir-cm1的皮肤外用剂的应用，特别是上述含有mir-cm1的乳液的应用，所述乳液可以抵抗紫外线诱导的衰老，增加皮肤紫外辐照部位的胶原含量。
23.本发明的有益效果：
24.本发明筛选出了一种新型裂蹄木层孔菌mirna(mir-cm1)及其前体mir-cm1，其中mir-cm1有良好的抗衰活性。mir-cm1可以与mical2的3’utr结合，调控靶基因mical2的表达，进一步改变下游皮肤衰老标志物的表达。因此，将mir-cm1在光老化的皮肤细胞或者组织中应用，可以抵抗紫外线辐照诱导的衰老。
25.本发明提供了一种mir-cm1基础护肤品的配方，且证实其具有抗衰功效。为抗衰老护肤品的开发提供新的研究方向和研发基础。
26.本发明公开的mir-cm1，可以为裂蹄木层孔菌提取物抗衰老护肤品的研究提供机制支持，为抗衰老护肤品研发提供更广阔的空间。
附图说明：
27.图1为mir-cm1前体mir-cm1的二级结构。
28.图2为mir-cm1与mical2的3’utr的匹配情况。
29.图3mir-cm1对mical2的调控情况
30.其中，a：转染mir-cm1 mimics条件下mical2的mrna表达含量变化结果图；b：转染mir-cm1 mimics和mir-cm1mutant条件下的mical2-3’utr荧光素酶活性变化结果图。
31.nc为阴性对照；mimics为类似物参照；mutant为突变体。
32.图4在皮肤细胞中应用mir-cm1时衰老相关标志物的变化
33.其中，a:ros相对表达量的变化水平；b：sod活性的变化水平；c衰老相关的β-半乳糖苷酶的相对表达量的变化水平。
34.图5在小鼠皮肤中应用mir-cm1护肤品前后胶原含量的变化。
35.其中，a：马松染色；b：胶原含量统计图。
具体实施方式
36.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
37.下列实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径中获得。
38.在本发明中，mir代表mirna；
39.本发明所使用的的裂蹄木层孔菌(phellinus linteus)购自北纳生物(bncc)，菌株编号bncc109781。
40.实施例1mirna的筛选和鉴定
41.1.样品的制备
42.rna样品的提取可来自于裂蹄木层孔菌的溶胞物，或者来自于裂蹄木层孔菌的外泌体。对于溶胞物：于pbs中高压剪切裂蹄木层孔菌，经高速离心获取上清液，此上清液即为裂蹄木层孔菌的溶胞物。对于外泌体：裂蹄木层孔菌的外泌体是通过将裂蹄木层孔菌均质后，经差速离心法获得。首先在3000
×
g下离心30分钟以去除死细胞，收集上清液并以10000
×
g离心60分钟以去除细胞碎片。所得上清液在150000
×
g下进一步离心90分钟，将外泌体(沉淀部分)悬浮在pbs缓冲液中。
43.2.rna提取和质量检测
44.利用trizol(赛默飞，美国)法提取外泌体样品的总rna。用琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整度，电泳显示28s和18s条带清晰，无降解；用超微量分光光度计(天根，背景)检测rna的浓度和纯度，od260/280值在1.8～2.2之间，od260/230≥2.0，表明rna纯度合格。rna样品浓度≥200ng/μl，总量≥2μg。rna初步检测质量合格，以保证下游高质量small rna-seq文库的构建。进行进一步质控和mirna测序。
45.3.文库构建：
46.检验合格的rna用于构建mirna文库，取适量总rna进行接头连接反应，利用成熟
mirna的5’端有一个磷酸基团，3’端为羟基，这一区别于其他rna的结构，在t4 rna连接酶2和t4 rna连接酶的作用下，在两端加上已知序列的3’接头和5’接头。对于已连接5’和3’接头的rna，利用与接头上序列互补的逆转录合成第一链的cdna。以上一步反应产物作为模板，利用pcr合成、扩增mirna的双链文库。利用聚丙烯酰氨凝胶电泳来分离插入片段大小在22-24nt的mirna文库。对构建好的测序文库进行质检和定量评估是否适合上机。
47.4.上机测序
48.对于质检合格的样品经过稀释后，根据不同样品测序通量要求，按相应比例对样品进行上机。采用illumina高通量测序平台，双端测序策略对文库进行测序。
49.5.生物信息分析(包含新mirna预测及表达分析)
50.为了保证信息分析质量，对测序得到的原始测序序列(raw reads)进行过滤，得到clean reads用于后续分析。利用fastx-toolkit软件进行质量过滤。对质控后的序列进行小rna长度分布统计，mirna集中在21nt或22nt。此外，将质控后的序列与mirbase数据库中对应物种的成熟mirna序列进行blast比对，以及与rfam数据库和参考基因组比对，以便对测序结果进行初步评价。对不同类型small rna分类注释结果。
51.新mirna预测及表达分析。由于mirna前体的发卡结构可以用来预测mirna，因此可以将mirna比对到基因组序列上并截取其两侧序列进行rna二级结构预测，并结合dicer酶结合位点以及二级结构的自由能等信息预测得到新的mirna。采用mirdeep2软件，将reads和参考基因组进行比对，根据reads和基因组比对的结果，结合近缘物种的同源mirna序列，比如rnafold等rna二级结构，预测识别该物种的新mirna成熟体(star mirna与mature mirna)和前体序列，并统计各样本新mirna的表达情况。
52.经过上述分离与鉴定，获得的一种来自裂蹄木层孔菌的新型mirna，命名为mir-cm1。其二级结构如图1所示，由图可知，其形成类似mirna前体的稳定茎环结构，其成熟序列如序列表seq id no.1所示，其前体序列如序列表seq id no.2所示，其前体序列的编码基因如序列表seq id no.3所示。
53.seq id no.1(mir-cm1成熟序列)：uaccaugggaguggacgua(19bp)。
54.实施例2 mir-cm1靶向调节mical2表达
55.将mir-cm1与mical2的3’utr进行匹配，匹配情况如图2所示，即mir-cm1能够与mical2的3’utr发生特异性结合。
56.1.实时荧光定量pcr检测基因表达
57.1)细胞样品的制备
58.人类永生化表皮细胞(hacat细胞)培养在添加10％的胎牛血清(bi，以色列)和100u/ml的青霉素链霉素混合液(美仑，中国)的dmem(gibco，美国)中培养，并在37℃下在5％浓度的co2培养箱中生长；
59.实验组：向上述经过培养的hacat细胞中通过lipo2000转染试剂(赛默飞，美国)转染mir-cm1 mimics，48h后收集细胞样品。转染说明：以24孔板为例，其他培养材料参考说明书转染规模调整，所有数量和体积均是按每孔计算。细胞接种于500μl不含抗生素的培养基中，使其在转染时长至50％融合。转染时，每孔细胞用量如下：用50μl opti-mem培养基稀释20pmol mir-cm1 mimics，轻轻混匀。取1μl lipo2000在50μl opti-mem培养基中稀释，室温孵育5分钟。将前两步溶液混合(使总体积为100μl)，轻轻混匀，室温放置20分钟，形成100μl
转染液。在每孔细胞中加入100μl转染液，轻轻摇匀。(本发明涉及转染步骤如未特别说明均采用此方法)。
60.对照组：上述人类永生化表皮细胞(hacat细胞)正常培养不做任何处理。
61.mir-cm1 mimics即mir-cm1类似物，mir-cm1 mimics类似物为双链序列：正义链序列为：5'-uaccaugggaguggacgua-3'(同mir-cm1，seq id no.1 19bp)；反义链序列为：5'-cguccacucccaugguauu-3'(seq id no.4)。
62.2)提取总rna
63.利用trizol(赛默飞，美国)法提取样品的总rna。rna样品的完整度和纯度检测同实施例1步骤2。
64.3)逆转录
65.利用hifairⅲ1st strand cdna shnthesis supermix for qpcr(gdna digester plus)(翌圣，上海)试剂盒进行逆转录合成cdna。去除基因组残留基因组dna及逆转录体系如下：
66.在rnase-free离心管中配制如下混合液，轻轻吹打混匀。42℃孵育2min。
[0067][0068]
逆转录反应体系配制(20μl体系)
[0069][0070]
25℃，5min；55℃，15min；85℃，5min。-20℃保存获得的cdna。
[0071]
4)qpcr实验
[0072]
利用hieff unicon universal blue qpcr sybr green master mix(翌圣，上海)进行qpcr。
[0073]
用于检测的引物如下：
[0074]
mical2上游引物：tgacagccaagaagcagagcct(seq id no.5)；
[0075]
mical2下游引物：ggtagttggtggcaaagtctgc(seq id no.6)。
[0076]
采用β-actin为内参基因：
[0077]
β-actin上游引物：caccattggcaatgagcggttc(seq id no.7)；
[0078]
β-actin下游引物：aggtctttgcggatgtccacgt(seq id no.8)。
[0079]
将cdna原液稀释4倍，在冰上配制qpcr反应体系(20μl)：
[0080][0081]
充分混匀后，吸取反应液20μl至反应孔中，封好热封膜，短暂离心。在pcr仪上检测。qpcr反应程序如下：预变性阶段，95℃，2min；40个循环阶段(包括变性，退火/延伸)，变性95℃，10s，退火/延伸60℃，30s；熔解曲线阶段(仪器默认设置)；获得实验数据用于后续结果分析。
[0082]
实验至少重复三次。以内参基因做参考，计算mical2的相对表达量。结果(图3-a)显示转染mir-cm1 mimics的hacat细胞mical2的表达显著低于对照组。
[0083]
2.双荧光素酶报告基因检测
[0084]
1)细胞样品制备
[0085]
人胚肾细胞株293t细胞(hek-293t)在添加10％的胎牛血清(bi，以色列)和100u/ml的青霉素链霉素混合液(美仑，中国)的dmem(gibco，美国)中培养，并在37℃下在5％浓度的co2培养箱中生长。
[0086]
利用lipo2000转染试剂(赛默飞，美国)将mir-cm1 nc、mir-cm1 mimics、mir-cm1 mutant分别与双荧光素酶报告质粒共转染至细胞hek-293t细胞，48h后收集细胞样品；对照组仅转染双荧光素酶报告质粒。
[0087]
mir-cm1 nc即mir-cm1阴性对照，其序列如(seq id no.9)；
[0088]
mir-cm1 mutant即mir-cm1突变体，将mir-cm1mimics序列进行突变，其序列如(seq id no.10)；
[0089]
mical2基因3’utr部分序列与psicheck2载体连接获得双荧光素酶报告质粒，mical2 3’utr部分序列如(seq id no.11)。质粒构建交予北京擎科生物科技有限公司。
[0090]
2)荧光素活性变化检测
[0091]
利用dual-lumi双萤光素酶报告基因检测试剂盒(碧云天，上海)进行萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶的检测。
[0092]
通过检测mir-cm1对mical2荧光素酶活性变化，结果(如图3-b所示)发现(将对照组设置为1)，mir-cm1 mimics转染能够极显著下调荧光素酶活性，而使用mir-nc和mir-cm1 mutant转染荧光素酶活性与对照组相比并无显著差异，可知mical2为mir-cm1靶基因。
[0093]
由此可见本技术中mir-cm1对mical2的表达有抑制作用，mir-cm1调控mical2的表达。
[0094]
实施例3 mir-cm1调控紫外辐照导致的细胞衰老中相关标志物的表达
[0095]
1.细胞样品制备
[0096]
hacat细在添加10％的胎牛血清(bi，以色列)和100u/ml的青霉素链霉素混合液(美仑，中国)的dmem(gibco，美国)中培养，并在37℃下在5％浓度的co2培养箱中生长；
[0097]
向上述经过培养的hacat细胞中通过lipo2000转染试剂(赛默飞，美国)转染mir-cm1 mimics进行预保护，预保护24h后，吸弃旧培养基，用pbs清洗3次，加入适量磷酸盐缓冲液(pbs)覆盖细胞。使用uva源的紫外线灯管(飞利浦，荷兰)以10j/cm2剂量进行照射。随后，弃掉pbs，补充新鲜培养基，继续培养6小时后收样检测(mir-cm1组)。
[0098]
其中，对照组hacat细胞正常培养不做处理(无mir-cm1预保护，无紫外照射)；模型组(model组)不进行预保护，仅紫外照射；mir-cm1组进行预保护，且紫外照射。
[0099]
2.细胞衰老相关的功能实验
[0100]
1)ros表达量检测
[0101]
利用活性氧检测试剂盒(索莱宝，北京)进行不同处理组细胞内活性氧的水平检测。结果如图4a所示。
[0102]
2)sod活性检测
[0103]
收集细胞，用预冷的pbs洗涤1-2遍。沉淀用预冷的pbs冰水浴中进行匀浆。随后匀浆液4℃离心，取上清液作为待测样品。
[0104]
利用cuzn/mn-sod活性检测试剂盒(wst-8法)(碧云天，上海)进行不同处理组细胞超氧化物岐化酶(sod)活性检测。结果如图4b所示。
[0105]
3)衰老相关的β-半乳糖苷酶表达量检测
[0106]
利用β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒(碧云天，上海)进行不同处理组细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶(sa-β-gal)染色。对于6孔板，吸除细胞培养液，加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定10分钟。吸除细胞固定液，用pbs洗涤细胞3次，每次3分钟。吸除pbs，每孔加入1毫升染色工作液37℃孵育过夜，用保鲜膜封住6孔板防止蒸发。普通光学显微镜下观察，拍照。结果如图4c所示。
[0107]
通过细胞衰老相关的功能实验，结果(如图4所示)发现，mir-cm1能够极显著地抑制紫外线辐照导致的细胞衰老，降低ros和sa-β-gal水平，提高sod活性。
[0108]
实施例4 mir-cm1护肤乳液增加紫外辐照导致的小鼠皮肤衰老中胶原的表达1)mir-cm1护肤乳液的配制
[0109]
mir-cm1护肤品基础乳液的配方：按重量百分比计算，edta二钠0.03％，甘油4％，黄原胶0.1％，对羟基苯乙酮0.2％，montanov l-乳化剂1％，arlacel170乳化剂1％，甘油硬脂酸酯0.3％，鲸蜡硬脂醇1％，辛酸/癸酸甘油三酯4％，聚二甲基硅氧烷1％，甲基丙二醇0.35％，聚乙烯亚胺-1500 1％，透明质酸钠1％，mir-cm1 0.75％，余量为去离子水。
[0110]
根据上述配方，按照如下方法进行配置：
[0111]
首先，将edta二钠，甘油，黄原胶，对羟基苯乙酮，montanov l-乳化剂，arlacel 170乳化剂，甘油硬脂酸酯，鲸蜡硬脂醇，辛酸/癸酸甘油三酯，聚二甲基硅氧烷，甲基丙二醇预先混合乳化得到基础乳液；
[0112]
随后，将聚乙烯亚胺-1500和透明质酸钠预先混合成溶液，向该溶液中加入mir-cm1(所采用的mir-cm1是根据序列表seq id no.1所示的核苷酸序列进行合成获得的核酸分子)，轻柔混合，静置25min得到包含mir-cm1的混合溶液；
[0113]
最后，于40℃以下将包含mir-cm1的混合溶液加入到基础乳液中，得到mir-cm1护肤乳液。
[0114]
2)小鼠光老化模型的建立
[0115]
将昆明小鼠(雌性，6-8周)随机分为三组(n＝5)，背部脱毛处理。各组小鼠正常饲养；其中，对照组不给予任何处理；mir-cm1组和model组进行紫外辐照(uva辐照，频率为每周三次，剂量为8j/cm2，持续4周)，mir-cm1组每次辐照后给予步骤1)制备的护肤乳液涂抹治疗；model组每次辐照后，给予不含mir-cm1的护肤乳液(制备方法同步骤1)，仅去除mir-cm1成分)涂抹治疗。4周后对所有小鼠实施安乐死。收集背部皮肤组织，固定在福尔马林中。
[0116]
3)masson染色
[0117]
按照标准程序，将组织脱水并包埋在石蜡中。获取4μm厚的切片，使用masson三色染色试剂盒(索莱宝，北京)染色。
[0118]
masson三色染色又称马松染色，是结缔组织染色中最经典的一种方法，是胶原纤维染色权威而经典的技术方法。所谓三色染色通常是指染胞核和能选择性的显示胶原纤维和肌纤维。该法染色原理与阴离子染料分子的大小和组织的渗透有关：分子的大小由分子量来体现，小分子量易穿透结构致密、渗透性低的组织，而大分子量则只能进入结构疏松的、渗透性高的组织。苯胺蓝的分子量很大，因此masson染色使胶原纤维呈蓝色(被苯胺蓝所染)。统计马松染色后蓝色面积即可用来评估皮肤组织胶原含量，通过imagej软件来统计蓝色面积占比，统计结果如图5右所示。
[0119]
通过动物衰老相关的功能实验，结果(如图5所示)发现，紫外辐照后，胶原含量下降，而mir-cm1护肤乳液保护可以抵抗由于紫外线辐照导致的胶原含量的下降，说明mir-cm1护肤乳液能够极显著地抑制紫外线辐照导致的皮肤衰老，增加治疗组胶原的含量。
[0120]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。