一种同时表达RFP和luciferase的SARS-CoV-2假病毒系统的包装和检测方法与流程

一种同时表达rfp和luciferase的sars-cov-2假病毒系统的包装和检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种同时表达rfp和luciferase的sars-cov-2假病毒系统的包装和检测方法。


背景技术：

2.rfp(red fluorecent protein,红色荧光蛋白)基因是从海葵discoso-masp中分离出的一种新的荧光蛋白基因，其蛋白质的最大吸收光谱为583nm，不需要任何预处理便可检测到。红色荧光蛋白因其红荧光较强的组织穿透力，已被广泛用于动物、植物和酵母等真核细胞内基因表达的报告基因。
3.luciferase(荧光素酶)是自然界中能够产生生物荧光的酶的总称。荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光。然后可以通过荧光测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。
4.现有的基因过表达载体主要有慢病毒载体、还原病毒载体、类腺病毒载体、转座子载体和非整合质粒等，慢病毒载体最大的优点是侵染效率和整合效率高，足够高的滴度条件下几乎可以使全部目标细胞收到转染，包括一些很难转染的细胞型。
5.sars-cov-2病毒自2019年流行以来，对全球造成了重大的公共威胁。虽然目前已经确认sars-cov-2的序列，也了解到该病毒与sars病毒感染机制相似，都是通过与人细胞的ace2蛋白结合，从而引发感染。但对于病毒进入细胞内之后的一系列生物学反应，对人体其它组织器官的易感性，以及有效治疗方法的选择都有待进一步研究。
6.sars-cov-2通过其编码的刺突蛋白(spike蛋白，简称为s蛋白)与人类血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme,简称为ace2)结合来介导病毒侵染人类细胞的过程。sars-cov-2刺突蛋白spike及其受体ace2的结构已获得解析，spike蛋白属于冠状病毒的结构蛋白之一，由sars-cov-2的spike基因编码，以同源三聚体的形式存在于冠状病毒刺突上，参与受体识别和膜融合等病毒感染过程。在结构上，spike蛋白分为三个主要结构域：胞外区、跨膜区和胞内区，其中胞外区包括s1、s2两个结构域，s1结构域位于spike蛋白n端，含有宿主受体结构域(receptor binding domain，简称rbd)，sars-cov-2通过rbd与ace2的肽酶结构域(peptidase domain)结合，参与sars-cov-2病毒的侵染过程；s2结构域则主要介导病毒包膜与细胞膜融合。


技术实现要素：

7.本发明旨在提供一种同时表达rfp和luciferase的sars-cov-2假病毒系统的包装和检测方法，本发明构建的假病毒不仅表面能表达sars-cov-2spike蛋白，同时携带rfp和luciferase荧光素酶报告基因，可以同时利用流式方法和酶标仪分光光度分析方法来对侵染的指标进行定性和定量分析，在sars-cov-2的研究中应用广泛。
8.本发明的技术方案如下：
9.本发明提供了一种同时表达rfp和luciferase的sars-cov-2假病毒系统的包装方法，包括如下步骤：
10.(1)扩增ff luc基因，将扩增产物插入plvx-ef1a-dsred-monmer-c1质粒构建plvx-ef1a-dsred-monomer-t2a-ff-luc质粒；
11.(2)将spike cds插入pmd2.g质粒构建pmd.spike质粒；
12.(3)将所述pmd.spike质粒、慢病毒包装辅助质粒ps-pax2和所述plvx-ef1a-dsred-monomer-t2a-ff-luc质粒，利用转染试剂介导共转染细胞，包装含spike刺突蛋白的sars-cov-2假病毒。
13.本发明提供了一种同时表达rfp和luciferase的sars-cov-2假病毒系统的包装方法，具体包括如下步骤：
14.步骤一、构建plvx-ef1a-dsred-monomer-t2a-ff-luc质粒：设计上游引物ff luc 5'coding和下游引物ff luc 3'coding，以pnl4-3-luc-r-e-载体为模板，扩增ff luc基因，在扩增产物的5'端引入pmei位点、t2a序列以及noti位点，3'端引入asci位点，pcr片段经过t4 pnk磷酸化后切胶回收，将切胶回收后的产物正向插入plvx-ef1a-dsred-monmer-c1的smai位点，用t4 dna连接酶在14-18℃下进行连接，得到plvx-ef1a-dsred-monomer-t2a-ff-luc质粒；
15.步骤二、构建pmd.spike质粒：在pcdna3.1-sars2-spike载体上，用pmei和ecori切下spike cds，将切下的spike cds插入pmd2.g质粒的pmli和ecori位点之间，用t4 dna连接酶在16℃下进行连接，得到pmd.spike质粒；
16.步骤三、假新冠病毒的包装：将步骤二所述pmd.spike质粒、慢病毒包装辅助质粒pspax-2和步骤一所述plvx-ef1a-dsred-monomer-t2a-ff-luc质粒，利用转染试剂介导共转染野生型293t细胞和/或ace2转基因293t细胞，包装含spike刺突蛋白的sars-cov-2假病毒。
17.本发明提供了一种同时表达rfp和luciferase的sars-cov-2假病毒系统的包装方法，步骤一中，引物为：
18.ff luc 5'coding t2a：
19.5'gggtttaaacgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccagcggccgctgaagacgcc 3'；
20.ff luc 3'coding：
21.5'ggcgcgccttacaatttggactttccgcccttcttggc 3'。
22.本发明提供了一种同时表达rfp和luciferase的sars-cov-2假病毒系统的包装方法，所述转染试剂为lipofectamine 3000 transfection reagent。
23.本发明提供了一种同时表达rfp和luciferase的sars-cov-2假病毒系统的检测方法，将sars-cov-2假病毒侵染过表达ace2的转基因293t细胞系，进行检测分析。
24.本发明提供了一种同时表达rfp和luciferase的sars-cov-2假病毒系统的检测方法，所述检测分析包括流式检测分析和/或荧光素酶活性分析。
25.本发明提供了一种同时表达rfp和luciferase的sars-cov-2假病毒系统的检测方法，所述过表达ace2的转基因293t细胞系的构建方法如下：
26.(1)扩增人类ace2基因，将扩增产物插入载体pb513b-1构建pb-cmv-ace2-t2a-puro质粒；
27.(2)所述pb-cmv-ace2-t2a-puro质粒和含有转座酶的辅助载体pb200a-1在转染试剂介导下转染293t细胞，建立过表达ace2的转基因293t细胞系。
28.本发明提供了一种同时表达rfp和luciferase的sars-cov-2假病毒系统的检测方法，所述过表达ace2的转基因293t细胞系的具体构建方法如下：
29.步骤一、构建pb-cmv-ace2-t2a-puro质粒：设计上游引物hace2-5'coding和hace2-3'coding，以293t细胞的总rna逆转录的cdna为模板，扩增人类ace2基因并在5’端引入xbai和nhei位点，3'端引入nrui位点，pcr片段切胶回收，将切胶回收后的pcr片段插入pb513b-1的xbai和nrui位点之间，t4 dna连接酶在16℃下进行连接，得到pb-cmv-ace2-t2a-puro质粒；
30.步骤二、构建过表达ace2的转基因293t细胞系：s1所述pb-cmv-ace2-t2a-puro载体和含有转座酶的辅助载体pb200a-1，以分子mol比例3:1在转染试剂介导下转染293t细胞，用1-3μg/ml嘌呤霉素筛选抗性细胞并建立转基因细胞系。
31.本发明提供了一种同时表达rfp和luciferase的sars-cov-2假病毒的检测方法，步骤一中，引物为：
32.hace2-5'coding：
33.5'gaagattctagagctagccaccatgtcaagctcttcctggctcct 3'；
34.hace2-3'coding：
35.5'atttaatcgcgaaaggaggtctgaacatcatcagtgttttgg 3'。
36.本发明提供了一种同时表达rfp和luciferase的sars-cov-2假病毒的检测方法，其特征在于，所述转染试剂为lipofectamine 3000 transfection reagent。
37.由于采用了本发明的技术方案，有益效果如下：
38.1、本发明使用的慢病毒载体侵染效率和整合效率高，可以高效转染大部分目标细胞，包括一些很难转染的细胞型，目标基因是由ef1a启动子表达，抗性基因是由pgk启动子表达，都是持家基因的启动子，没有物种和细胞型的表达特异性，适应面很广。
39.2、本发明使用的piggybac载体是以sbi公司生产的pb系列载体为骨架，是目前最高效的转座子载体系统，没有物种和细胞型的限制，可以用多种方法高效转化各种细胞，无需包装步骤省时省力，没有序列和基因特异性问题，载体容积很大，载体相对较小，易于分子克隆操作，转染293t细胞后ace2表达水平十分稳定。
40.3、本发明的假病毒体系是基于第三代慢病毒体系，无自主复制能力，安全性好。
41.4、本发明的假病毒不仅表面能表达sars-cov-2spike蛋白，而且病毒同时携带rfp和luciferase荧光素酶报告基因，可通过观察荧光蛋白信号和检测荧光素酶活性评价假病毒感染细胞的侵染能力，可以同时利用流式方法和酶标仪分光光度分析方法来对侵染能力进行定性和定量分析，可用于中和抗体检测、sars-cov-2受体和药物筛选以及疫苗效果评价等。
附图说明
42.图1为本发明中基础质粒pnl4-3 luc r-e-的质粒图谱；
43.图2为本发明中带有rfp和luciferase荧光素酶报告基因双标记基因的目标质粒plvx-ef1a-dsred-monomer-t2a-ff-luc的质粒图谱；
44.图3为本发明中基础质粒plvx-ef1a-dsred-monomer-c1的质粒图谱；
45.图4为本发明中基础质粒pcdna3.1-sars2-spike的质粒图谱；
46.图5为本发明中辅助质粒pmd.spike的质粒图谱；
47.图6为本发明中另一辅助质粒pspax2的质粒图谱；
48.图7为本发明中转基因293t细胞和野生型293t细胞ace2表达水平的qpcr检测结果对比图；
49.图8为本发明中未浓缩假新冠病毒和侵染过表达ace2的转基因293t细胞系，流式细胞检测结果对比图；
50.图9为本发明中100
×
浓缩假新冠病毒和侵染过表达ace2的转基因293t细胞系，流式细胞检测结果对比图；
51.图10为本发明中被100
×
浓缩假新冠病毒侵染过表达ace2的转基因293t细胞系和没有被侵染的过表达ace2的转基因293t细胞系的生物发光检测结果示意图。
具体实施方式
52.下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述，其中的分子克隆步骤参照《分子克隆实验指南》相关章节进行，试剂盒试剂等相关材料均为市售商品。
53.实施例1
54.构建假新冠病毒
55.1、构建质粒
56.a、构建plvx-ef1a-dsred-monomer-t2a-ff-luc质粒
57.具体步骤如下：
58.用上游引物(ff luc 5'coding t2a，序列为：5'gggtttaaacgagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggcccagcggccgctgaagacgcc 3')和下游引物(ff luc 3'coding，序列为：5'ggcgcgccttacaatttggactttccgcccttcttggc 3')，以pnl4-3-luc-r-e-载体(如图1所示)为模板，扩增ff luc基因，在扩增产物的5'端引入pmei位点、t2a序列以及noti位点，3'端引入asci位点，pcr片段经过t4 pnk磷酸化后切胶回收，将切胶回收后的产物正向插入plvx-ef1a-dsred-monmer-c1(如图3所示)的smai位点，用t4 dna连接酶在16℃下进行连接，得到plvx-ef1a-dsred-monomer-t2a-ff-luc质粒，如图2所示。将构建的质粒转化感受态细胞stbl4，并用smai和ecori进行双酶切鉴定和基因序列测定，证实其正确性。plvx-ef1a-dsred-monomer-t2a-ff-luc质粒的核苷酸序列如seq id no.1所示。
59.b、构建pmd.spike质粒
60.具体步骤如下:
61.在pcdna3.1-sars2-spike载体(如图4所示)上，用pmei和ecori切下spike cds，将切下的spike cds插入pmd2.g质粒的pmli和ecori位点之间，用t4 dna连接酶在16℃下进行连接，得到pmd.spike质粒，如图5所示。将构建的质粒转化感受态细胞stbl4，用hindiii和ecori进行双酶切鉴定和基因序列测定，证实其正确性，构建pmd.spike质粒的核苷酸序列如seq id no.2所示。
62.c、假新冠病毒的包装及浓缩
63.在慢病毒载体体系基础上，将pmd.spike质粒、慢病毒包装辅助质粒ps-pax2(如图6所示)、plvx-ef1a-dsred-monomer-t2a-ff-luc质粒，利用lipofectamine 3000transfection reagent(invitrogen,usa)介导共转染野生型293t细胞或ace2转基因293t细胞，包装含spike刺突蛋白的假新冠病毒。在转染后24小时移去上清，换上新鲜的293t培养基，4天后收集病毒上清液，4000
◇
g，4℃离心15分钟去掉细胞残渣，分装2ml上清(即粗病毒)冻存到-80℃，其余上清加50％peg6000至终浓度8.5％，同时加4m的nacl至终浓度0.4m，颠倒混匀后放置4℃冰箱约2小时，每20-30分钟混匀一次，然后7000
◇
g，4℃离心25分钟，弃掉上清，将得到的沉淀重悬于50mm tris-hcl(ph7.4)，约浓缩100倍，分装冻存于-80℃。
64.实施例2
65.构建过表达ace2的转基因293t细胞系
66.1、构建pb-cmv-ace2-t2a-puro质粒
67.具体步骤如下：
68.用上游引物(hace2-5'coding，序列为：5'gaagattctagagctagccaccatgtcaagctcttcctggctcct 3')和下游引物(hace2-3'coding，序列为：5'atttaatcgcgaaaggaggtctgaacatcatcagtgttttgg 3')，以293t细胞的总rna逆转录的cdna为模板，扩增人类ace2基因并在5’端引入xbai和nhei位点，3'端引入nrui位点，pcr片段切胶回收，将切胶回收后的pcr片段插入pb513b-1(sbi inc.,usa)的xbai和nrui位点之间，t4 dna连接酶在16℃下进行连接，得到pb-cmv-ace2-t2a-puro质粒。将构建的质粒转化感受态细胞stbl4，用xbai和nrui进行双酶切鉴定和基因序列测定，证实其正确性。pb-cmv-ace2-t2a-puro质粒的核苷酸序列如seq id no.3所示。
69.2、构建过表达ace2的转基因293t细胞系
70.(1)构建过表达ace2的转基因293t细胞系的具体步骤如下：
71.pb-cmv-ace2-t2a-puro载体和含有转座酶的辅助载体transposase(pb200a-1，sbi公司)以分子mol比例3:1在lipofectamine 3000 transfection reagent介导下转染293t细胞，用2μg/ml嘌呤霉素筛选抗性细胞并建立转基因细胞系。
72.(2)转基因293t细胞系中ace2转录水平的检测
73.采用trizol法分别裂解提取转基因293t细胞和野生型293t细胞的总rna，逆转录得到cdna，逆转录反应体系见表1。以ace2-ex1-f(5'cacgaagccgaagacctgttctat 3')和ace2-ex2-r(5'accaccctgttgctgtagccaa 3')作为ace2基因扩增引物，gadph-ex7-f(5'gtctcctctgacttcaacagcg 3')和gadph-ex8-r(5'accaccctgttgctgtagccaa 3')作为内参引物，用faststart universal sybr green master kit(roche,cat:04913850001)在荧光定量pcr仪(bio-rad q5)上进行实时荧光定量检测(qpcr)，qpcr反应体系见表2，发现转基因293t细胞的ace2转录水平远高于野生型293t细胞，证实已成功建立了稳定过表达ace2的转基因293t细胞系，结果见图7。
74.表1逆转录20μl反应体系
75.成分用量(μl)mix4
reverse transcriptase1nuclease-free water和rna体积总共15μlrna template1μg总rna
76.其中，逆转录反应程序：25℃5min；42℃30min；85℃5min；4℃保存。获得的cdna样本分装后-80℃储存。
77.表2 qpcr反应体系
[0078] 反应体系(15μl)mix(10
×
)7.5f(10μm)0.4r(10μm)0.4ddh2o3.7cdna(1:20稀释)3
[0079]
其中，qpcr反应程序：95℃预变性10min；95℃15s，56℃～66℃30s，72℃30s，45个循环，并收集荧光信号；65℃到95℃每隔10s检测融解曲线，共61个循环。
[0080]
实施例3
[0081]
假新冠病毒侵染过表达ace2的转基因293t细胞
[0082]
过表达ace2的转基因293t细胞被传代于96孔板和12孔板中，将浓缩后和未浓缩的假新冠病毒加入培养基中，同时添加polybrene至终浓度6μg/ml，16小时之后移走上清，换成新鲜的293培养基，2天之后的细胞进行流式检测分析或荧光素酶活性分析，证实假新冠病毒是否能有效侵染过表达ace2的转基因293t细胞。
[0083]
a、流式检测分析
[0084]
具体方法如下：将12孔板中的细胞用0.025％胰酶37℃处理3-4分钟，将细胞吹散成单细胞后收集到离心管中，1100rpm室温离心5min，弃上清，加200μl sm液(含有2％胎牛血清的d-pbs)重悬于流式上样管中，同时加1μl的7-aad(标记细胞死活的染料)，70μm滤膜过滤。用bd cantoii流式细胞仪进行检测rfp(pe通道)的荧光强度，实验数据使用flowjo10软件进行分析。图8和图9显示增加了荧光素酶基因之后，rfp荧光蛋白的表达没有受到显著影响，仍然能够用流式检测方式检测到相似的表达水平。其中，图8是未浓缩病毒，滴定体积为1ml；图9是100
◇
浓缩病毒，滴定体积为10μl。
[0085]
b、荧光素酶活性检测
[0086]
具体方法如下：首先用d-pbs将96孔板中细胞洗一遍，再加100μl 0.5％triton100裂解细胞至少15min(裂解过程中要用摇床晃动)；时间到后立即吸打两下转入白色专用测量板中，然后加同体积2
×
(300μg/ml，储存液1：100稀释)配好的荧光素钾盐(终浓度为150μg/ml)，注意不要吹打，立刻上机检测，程序为luminescence 96，尽快测量，对照组为未滴定病毒的转基因293t细胞，结果见图10。
[0087]
从图10可知，假病毒侵染过表达ace2的转基因293t细胞后，荧光素酶在转基因293t细胞内能有效表达并被检测到。
[0088]
从图8、图9、图10可知，假新冠病毒侵染过表达ace2的转基因293t细胞是成功的。
[0089]
其中所用仪器、试剂等材料如下：
[0090]
1、主要仪器和试剂：
[0091]
(1)主要仪器及耗材
[0092]
超净工作台labconco a2，co2培养箱thermo heracsl sd，普通倒置显微镜olympus ckx31，荧光显微镜及成像系统olympus dp73，流式细胞仪bd facscantoⅱ/calibur，台式常温高速离心机thermo labofuge 400，贴壁12孔板corning。
[0093]
(2)主要试剂
[0094]
dmem培养基美国sigma d5796，非必需氨基酸(neaa)美国gibco07796，0.25％trypsin/edta gibco 25200056，胎牛血清(fbs)pan biotech p30-3302，l-谷氨酰胺gibco 25030081，青霉素/链霉素gibco 15070063，台盼蓝(trypan blue stain)gibco公司，实时荧光定量pcr试剂盒roche faststart universal sybr green master(rox)04913914001，逆转录试剂盒bio-rad iscript tm cdna synthesis kit 170-8891，染料7-aad，bd biosciences，cat:51-68981e
[0095]
2.主要溶液的配制
[0096]
293t培养基配制
[0097]
成份体积终浓度dmem500ml88％fbs(pan血清)57ml(10％)10％10mm neaa5.7ml(1％)0.1mmpen&strep5.7ml(1％)1mmglutamin5.7ml2mm
[0098]
3.细胞系
[0099]
lenti-293t细胞系购自clontech公司；
[0100]
4.载体系统
[0101]
pcdna3.1-sars2-spike和pnl4-3-luc-r-e-质粒由清华大学所赠，plvx-ef1a-dsred-monmer-c1购自clontech公司，pmd2.g和ps-pax2质粒实验自行保存，通用型载体，和市售载体序列一致。
[0102]
5.限制性内切酶及dna修饰酶购自neb公司，化学感受态细胞stbl4自己制备，和市售感受态细胞stbl4一样。
[0103]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。