一种具有调节过敏性体质功能的菌株及其应用的制作方法

1.本发明属于益生菌抗过敏技术领域，具体涉及一种具有调节过敏性体质功能的菌株及其应用。


背景技术：

2.过敏已经成为危害婴幼儿健康的头号原因，严重危害了婴幼儿的成长发育和身体健康。婴幼儿过敏是由婴幼儿未发育完全的免疫系统对于外界环境中的过敏原的不恰当应答所引起的一种影响婴幼儿生长发育及身体健康的急性反应疾病。免疫系统对于过敏原的过度反应会导致婴幼儿的肠道、皮肤、呼吸和神经系统等的异常反应，严重时可危及生命。
3.目前，乳酸菌在调节婴儿过敏体质上已经有了广泛的应用，主要形式包括单独给服和加入到水解蛋白乳粉中两种形式。常用的菌株包括双歧杆菌和乳酸杆菌等。目前益生菌对婴幼儿过敏性疾病湿疹的治疗功效已被认可。bertelsen 在对挪威40，614名患者进行调查时，发现引用益生菌乳品的儿童其患过敏性湿疹的概率都要低于对照组，而益生菌使用与哮喘发病率的降低则没有显著联系。双歧杆菌对于过敏性疾病调节的应用则少于鼠李糖乳杆菌lgg，但仍有功效。f ields等人对于加入乳双歧杆菌的深度水解配方乳粉的抗过敏性进行研究，发现加入后患儿腹泻和呕吐现象得到了明显的缓解。
4.在益生菌调节过敏性疾病中，组合益生菌也常被用到，且通过对菌株的复合，可达到更好的调节过敏的效果。elodie等人通过对于唾液乳杆菌、长双歧杆菌以及鼠李糖乳杆菌的配比进行细胞实验，证明了该复合菌组具有免疫调节及抗过敏效果。schmidt通过跟踪实验发现，持续摄入鼠李糖乳杆菌lgg及双歧杆菌亚种bb-12六个月可以有效地降低婴儿湿疹的发病率。动物双歧杆菌乳亚种b b12 dsm1595与屎肠球菌l3 lmgp-27496作用于过敏性鼻炎患儿能够减少患儿过敏症状的评分及抗组胺药物和皮质类固醇的使用。allen等人则通过让1010 母亲从妊娠第36周至婴幼儿6个月时服用包含乳酸杆菌和双歧杆菌的益生菌并母乳喂养，发现医生均能够预防特应性普通食物过敏，降低湿疹儿童的早期发病率。
5.目前，婴幼儿抗过敏菌株已经越来越多的被应用到市场及生活中来。因此在对于未来抗过敏益生菌的研发方面，我们应该着手于开发新型安全有效的益生菌，并提升其功能性及鲁棒性，从而达到更好的阻击过敏的结果。
6.因此，如何提供一种具有调节过敏性体质功能的菌株及其应用是本领域亟待解决的问题。


技术实现要素：

7.本发明公开了一种具有调节过敏性体质功能的益生菌及其应用。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.一种具有调节过敏性体质功能的菌株，该菌株为鼠李糖乳杆菌(lactobacill us rhamnosus)，菌株编号lr-123保藏编号为cctcc no：m 2021770，保藏时间为2021年06月25日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学。
10.一种具有调节过敏性体质功能的菌株在制备抗过敏制剂中的应用；
11.一种具有调节过敏性体质功能的菌株在制备口服抗过敏制剂中的应用；
12.一种具有调节过敏性体质功能的菌株在制备益生菌制剂中的应用；
13.一种调节过敏性体质的药物，包括：保藏编号为cctcc no：m 2021770 的活菌；活菌菌浓≥106cfu/g或106cfu/ml；
14.优选的，还包括：其他适配的助剂。
15.综上所述，发明公开了一种具有调节过敏性体质功能的菌株及其应用。本发明筛选到lr-123菌株，对致敏个体服用后能够上调foxp3的表达量，treg 细胞的表达起到促进作用，下调了stat3的表达量，抑制了炎症反应的发生，同时对肠道起到保护作用维持了肠道形态。同过敏组相比，抑制了肠道中肥大细胞的聚集以及组织胺的释放，为益生菌抗过敏技术领域做出贡献。
附图说明
16.图1血清中总ige含量的影响；横坐标从左至右依次为致敏组、健康组、lgg 和lr-123；纵坐标为血清中总ige含量。
17.图2 balb/c小鼠空肠组织的甲苯胺蓝染色；a为健康组，b为致敏组，c为lr
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123。
18.图3 foxp3蛋白表达量；a依次为健康组脾脏、致敏组脾脏、lr-123组脾脏、健康组回肠、致敏组回肠、lr-123组回肠foxp和β-action的western bolot的检测结果；b为表达量数据化结果。
19.图4 stat3蛋白表达量；a依次为健康组脾脏、致敏组脾脏、lr-123组脾脏、健康组回肠、致敏组回肠、lr-123组回肠stat3和β-action的western bolot的检测结果；b为表达量数据化结果。
具体实施方式
20.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.本技术通过筛选得到一种具有调节过敏性体质功能的菌株，该菌株为鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)，菌株编号lr-123，保藏时间为2021年06月25日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no： m 2021770，保藏地点为中国.武汉.武汉大学。
22.筛选过程简述：研究以传代稳定性、表面疏水性、产酸能力及抑制ccl17 分泌，对611株菌进行功能性进行筛选，并对筛选后的10株潜在抗过敏益生菌进行16s菌株鉴定。然后从益生菌在体内是否能够存活定殖以及发挥功能，对其肠上皮细胞的黏附能力、耐酸能力、耐胆盐能力、对脐静脉内皮细胞的毒性和调节tgf-β分泌能力进行表征，以期筛选出具能够稳定传代、稳定在肠道内定殖、耐酸耐胆盐并能够对th17/treg分化进行调节的特异性针对过敏性疾病的潜在益生菌，并通过动物实验对获得菌株抑制过敏小鼠因过敏导致的脾脏指数升高的作用进行了表征，最后筛选出效果最好的菌株鼠李糖乳杆菌lr-123。
23.实施例1
24.益生菌菌悬液的制备
25.实验之前，将阳性对照菌鼠李糖乳杆菌lgg及待测菌lr-1232％接种量分别接种于10ml mrs液体培养基，37℃恒温厌氧培养24h。
26.小鼠模型及实验分组
27.将3周龄的spf级balb/c雌性小鼠随机分为4组，每组8只小鼠，共用鼠104只。具体分组为：致敏组1组，lgg菌阳性对照1组，健康对照组1组， lr-123待测菌1组。
28.其中，小鼠先在spf级鼠房内适应性培养两天后按不同分组对小鼠灌胃，其中lr-123待测菌组及lgg组对小鼠灌喂100μl/10g bw的新鲜菌液，健康对照组及致敏组则灌胃等体积的蒸馏水。
29.致敏组、lgg菌阳性对照、健康对照组和lr-123待测菌组，灌胃3天后对小鼠进行断尾采血，第四天用100μl的卵清蛋白与弗氏完全佐剂的1：1完全乳化液体对小鼠进行腹腔注射完成第一次致敏，三天后用100μl的卵清蛋白与弗氏不完全佐剂的1：1完全乳化液体对小鼠腹腔注射完成第二次致敏。18天后对小鼠断尾采血，后开始对小鼠进行激发，每隔24小时对小鼠注射50mg的卵清蛋白，共注射3次，最后一次激发后收集小鼠粪便，并对小鼠断颈处死并解剖，收集小鼠的血液、脾脏及肠道。
30.小鼠血清中总ige的测量
31.采用商用试剂盒，将在4℃环境中静置过夜的血清稀释后取50μl加入到酶标板中。将实际置于室温平衡30分钟后对洗涤液25倍稀释、标准品梯度稀释，配置生物素抗原及亲和素-hrp。后将50μl样品及50μl生物素抗原加入至酶标包被板中，盖上封板膜后37℃避光孵育30分钟。后用洗涤液洗涤5次，每次停留30秒，拍干后每孔加入50μl亲和素-hrp37℃避光孵育30分钟，再次洗涤五次。分别加入显色剂a 50μl及显色剂b 50μl，37℃避光孵育10分钟后加入终止液，并于10分钟内将酶标板与450nm波长下测量各孔的od值。随后使用软件elisacalc对标准曲线进行拟合分析，拟合模型采用四参数的logistic曲线，结果如图1所示。
32.小鼠肠道甲苯胺蓝染色
33.解剖后，将4％的多聚甲醛固定的小鼠的空肠组织脱水后采用石蜡包埋，并做10μm的组织横截面切片。于-20℃遇冷的丙酮中固定10分钟后自来水冲洗5 分钟。甲苯胺蓝染色8分钟后用双蒸水清洗掉多余染液，1％盐酸氯化钠浸泡10 分钟，双蒸水清洗1分钟。95％及100％酒精各脱水2分钟后，将切片置于二甲苯与无水乙醇1：1混合液中2分钟，置于二甲苯中4分钟并重复一次，后擦净切片，加入中性树胶后盖上盖玻片封固晚后置于白光显微镜中观察。结果如图2 所示。
34.foxp3及stat3的western blot检测
35.以β-action为内参研究对th17/treg细胞分化的蛋白foxp3和stat3的蛋白表达量进行了western blot验证。每组取4只小鼠的脾脏或者肠道组织混样测量。
36.首先对蛋白质进行抽提，向样本中加入等体积的含有1％pmsf的裂解液后冰上静置5分钟后12000rpm 4℃离心10分钟，取上清备用。
37.对待测蛋白质进行定量。取0.5g/l的bsa蛋白标准液按照0、1、2、4、8、 12、16、20μl体积分别加入酶标板，并用pbs缓冲液补齐体系至20μl。样品孔中加入1μl待测蛋白与19μl
的pbs缓冲液。在样品孔和标线孔中每孔加入200μl的bca工作液(a液：b液＝50：1)，混匀后37℃静置20分钟，与酶标仪中读取od570读数为蛋白含量数据。
38.按照表1中的比率配置聚丙烯酰胺凝胶，先配置分离胶，灌胶前加入aps 和temed混匀后水层密封，聚合完全后倒掉水层加入浓缩胶，灌胶前加入ap s和temed,插入梳子，制胶完成后加入沸水煮沸5分钟的混有5倍loading b uffer的蛋白样品20μl，含40μg蛋白，加入5μl蛋白marker，于电泳槽中8 0v恒压电泳2.5小时。
39.表1 聚丙烯酰胺凝胶配方
[0040][0041]
电泳结束后，将整块胶剥落于转印液中浸泡10分钟，在转印负极铺入一层海绵后铺入5层滤纸、凝胶及pvdf膜，使膜正面与凝胶接触，在铺上5层滤纸及海绵，形成“三明治”形状。夹紧转印夹，插入转印槽，加入转印缓冲液，接通电极，80v电压下转印1.5小时。转印结束后去除pvdf膜，进入tbst中摇床摇动5分钟后将pvdf膜转入％5tbst缓冲液配置的脱脂奶粉中，摇床摇动1小时完成封闭。
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用5％的脱脂奶粉按照表2条件稀释抗体后倒入杂交袋中，与封闭好的pv df膜仪器压膜机封口后进行一抗孵育。
[0043]
表2 一抗孵育条件
[0044][0045][0046]
将pvdf膜取出，tbst摇床清洗5分钟，重复四次。将pvdf膜转入到加入按照表3配置的二抗工作液中，封膜机封口后进行二抗孵育。
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表3 二抗孵育条件
[0048][0049]
去除pvdf膜，用tbst摇床漂洗5分钟，重复6次。在保鲜膜上将擦干p vdf膜上均匀
撒上ecl发光液，静置5分钟，覆盖保鲜膜，转入暗盒中在暗室曝光。扫描后的胶片利用gel-pro-analyzer软件进行目标条带分析。结果如图3、图4所示。
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结果分析
[0051]
鼠李糖乳杆菌lr-123对于抗过敏效果由于对血清中总ige含量的影响优于目前已商用的成熟菌株鼠李糖乳杆菌lgg。
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同时对肠道起到保护作用维持了肠道形态。同过敏组相比，抑制了肠道中肥大细胞的聚集以及组织胺的释放。
[0053]
在脾脏和回肠中分别上调了foxp3的表达量，对treg细胞的表达起到促进作用，下调了stat3的表达量，抑制了炎症反应的发生，促进过敏宿主的耐受的形成。
[0054]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0055]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。