一种电泳脱除壳聚糖中蛋白质的方法与流程

1.本发明属于医药高分子材料领域，涉及一种壳聚糖提纯技术，具体涉及一种电泳脱除壳聚糖中蛋白质的方法。


背景技术：

2.壳聚糖是一种天然高分子碱性多糖，其不仅具有良好的生物相容性和可降解性，还具有抑菌、止血和促进创伤组织生长等特性，这些优良的性质使得壳聚糖在医学领域有着广泛的应用。由于生物机体的免疫排斥作用，用于医学领域的壳聚糖需要经过脱蛋白的处理，《组织工程医疗器械产品壳聚糖》(yy/t 1699
‑
2020)中规定壳聚糖蛋白质残留量应不大于0.2wt％。常用的脱蛋白方法主要有碱法、酶法和微生物发酵法。
3.碱法是目前使用最多的壳聚糖脱蛋白方法，其通常是利用高浓度的碱在高温条件下反复处理壳聚糖，以达到脱除蛋白质的目的。如专利cn110746520a公开了一种新型壳聚糖生产用高效制备方法，该方法利用10wt％naoh溶液在40
‑
60℃条件下浸泡虾壳粉20
‑
24h，处理两次来脱除蛋白质。碱法虽然生产工艺简单，也能取得较好的脱蛋白效果，但在处理过程中所产生的大量废水废渣会造成环境的破坏，对废水废渣的处理也会显著的增加生产成本。针对碱法存在的问题，许多学者开发出了多种辅助处理方式，在脱蛋白过程中利用超声、微波等辅助手段来提高碱处理的效率、降低碱液的用量。如专利cn106995504a公开了一种超声振荡电加热虾壳提取甲壳素的方法，该方法在脱蛋白过程中使用超声振荡，可显著提高脱蛋白的速率。但这些辅助手段不仅增加了处理成本，且没有改变碱法污染环境的本质。
4.酶法是通过添加蛋白酶来水解壳聚糖中的蛋白质，链霉菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶等都被研究过用于蛋白质的去除。如专利cn111138563a公开了一种利用雪蟹壳制造壳聚糖的制备方法，该方法向蟹壳中加入风味蛋白酶，在45～55℃条件下反应2～5小时，利用风味蛋白酶来脱除蟹壳中的蛋白质。与碱法相比，酶法具有绿色环保的优点，但该方法生产成本较高，专利中生产24g壳聚糖约需消耗2g的风味蛋白酶。
5.生物发酵法主要是通过真菌或细菌发酵来去除蛋白质，如专利cn110004197a公开了一种高效微生物发酵制备壳聚糖的方法，该方法将虾壳、土豆、葡萄糖等物质混合制备土豆培养基，用米曲霉菌在培养基上发酵来去除蛋白质。生物发酵法具有生产成本不高、绿色环保等优点，但该方法所需的生产时间较长，专利中米曲霉菌发酵的时间长达3～4天，不能很好的满足工业化生产的需求。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种电泳脱除壳聚糖中蛋白质的方法，即解决了处理成本高昂的问题，又解决了处理过程中对环境污染、生产周期较长的问题。
7.本发明提供的技术方案具体如下：
8.一种电泳脱除壳聚糖中蛋白质的方法，包括以下步骤：
9.步骤1、将壳聚糖粉末加入到酸性水溶液中，搅拌使壳聚糖粉末完全溶解，得壳聚糖酸性水溶液；
10.步骤2、向所得壳聚糖酸性水溶液中加入碱，搅拌使壳聚糖析出，得壳聚糖碱性分散液；
11.步骤3、向所得壳聚糖碱性分散液中加入十二烷基硫酸钠，搅拌至十二烷基硫酸钠完全溶解，静置1
‑
2.5小时，得到混合溶液；
12.步骤4、将步骤3中所得混合溶液过滤，收集滤渣；
13.步骤5、将所得滤渣放入电泳装置中，加入十二烷基硫酸钠配置的电泳液进行电泳；
14.步骤6、将步骤5中电泳后的壳聚糖收集过滤，用去离子水洗净，烘干后得提纯后的壳聚糖。
15.优选的，步骤1中，所述酸性水溶液为盐酸或醋酸。
16.优选的，步骤2中，所述的碱为碱金属氢氧化物。
17.优选的，步骤3的混合溶液中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.5～2wt％。
18.优选的，步骤5的所述电泳液中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.05～0.5wt％。
19.优选的，步骤5中，所述电泳装置由电泳槽、电源、电极和一面开口的容器组成，壳聚糖置于容器之中，开口用纱布封住，以便电泳完成后收集壳聚糖。
20.优选的，步骤5中，阳极材料和阳极材料间距为10～20cm。
21.优选的，步骤5中，电泳采用恒电压直流电。
22.优选的，步骤5中，阳极材料和阴极材料间施加的电压为100～500v。
23.优选的，步骤5中，电泳所用的时间为1～6h。
24.本发明的原理如下：
25.十二烷基硫酸钠是一种阴离子表面活性剂，能够断开分子内和分子间氢键，并与蛋白质结合，使整个蛋白带上负电荷。带负电的蛋白质和不带电的壳聚糖能够在电场的作用下分离，从而达到脱除壳聚糖中蛋白质的目的。
26.本发明有益效果如下：
27.本发明得到的壳聚糖完全满足《组织工程医疗器械产品壳聚糖》(yy/t 1699
‑
2020)中对于壳聚糖蛋白质含量不大于0.2wt％的要求，制得的壳聚糖能够达到医用级的水平，能够在医用材料方面得到广泛发应用。同时本发明开始溶解时采用少量酸，后面通过碱液调整至中性得到悬浮液，整体来说所用酸碱量非常少，避免了大量的环境污染和后续酸碱处理工艺。本发明电泳只需要1
‑
6个小时，周期短，工艺可以随启随停，无需生物发酵法那样长时间准备周期。本发明所用电泳在其他技术领域本身为成熟技术，稍加改造即可用于本发明，所以本发明生产成本低廉，工艺稳定性好，因此，本发明开创了一种全新的适用于生产的工艺路线，使得本发明能够大批量工业化生产。
附图说明
28.图1是本发明所用电泳装置示意图。
29.图2是不同电压下电泳3h脱蛋白后壳聚糖蛋白质质量分数。
[0030]1‑
阴极，2
‑
阳极，3
‑
容器，4
‑
壳聚糖，5
‑
纱布，6
‑
电源，7
‑
电泳液，8
‑
电泳槽。
具体实施方式
[0031]
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
[0032]
如图1所述，本发明进行电泳采用的电泳装置包括电泳槽8、电源6、电极和单侧开口的容器3，所述电极包括阴极1和阳极2，阳极和阴极分别与电源的正负极相连，然后相互平行的安装在电泳槽内，电泳槽8内盛装有电泳液7，所述容器为单侧开口容器，可以为卧式的圆柱壳体容器或者长方体容器，电泳时，将壳聚糖4置于容器3内，然后用在开口端采用纱布5及类似滤网封住，防止壳聚糖扩散流失，容器置于电泳液内并且位于阴极和阳极之间，容器的开口端对准阳极，施加电场后，带电的蛋白质在电场作用下透过纱布移动到阳极处，而壳聚糖由于纱布阻挡留在容器内，完成壳聚糖上蛋白质脱除。
[0033]
实施例1
[0034]
称取2g壳聚糖粉末于250ml锥形瓶中，加入198ml去离子水和2ml醋酸，搅拌至壳聚糖完全溶解；然后向溶液中滴加1m/l氢氧化钠溶液，边加边搅拌，直至溶液ph约为12；再向锥形瓶中加入2g十二烷基硫酸钠，搅拌至十二烷基硫酸钠完全溶解，静置2h；将锥形瓶中的溶液过滤，取滤渣置于电泳装置中，电泳液为0.1wt％十二烷基硫酸钠溶液，阴极和阳极之间的距离设置为10cm，阴极和阳极之间的电压设置为400v，电泳3h；将电泳后的壳聚糖用去离子水洗净，烘干后即得产物。
[0035]
实施例2
[0036]
称取2g壳聚糖粉末于250ml锥形瓶中，加入198ml去离子水和2ml醋酸，搅拌至壳聚糖完全溶解；然后向溶液中滴加1m/l氢氧化钠溶液，边加边搅拌，直至溶液ph约为12；再向锥形瓶中加入2g十二烷基硫酸钠，搅拌至十二烷基硫酸钠完全溶解，静置2h；将锥形瓶中的溶液过滤，取滤渣置于电泳装置中，电泳液为0.1wt％十二烷基硫酸钠溶液，阴极和阳极之间的距离设置为10cm，阴极和阳极之间的电压设置为300v，电泳3h；将电泳后的壳聚糖用去离子水洗净，烘干后即得产物。
[0037]
实施例3
[0038]
称取2g壳聚糖粉末于250ml锥形瓶中，加入198ml去离子水和2ml醋酸，搅拌至壳聚糖完全溶解；然后向溶液中滴加1m/l氢氧化钠溶液，边加边搅拌，直至溶液ph约为12；再向锥形瓶中加入2g十二烷基硫酸钠，搅拌至十二烷基硫酸钠完全溶解，静置2h；将锥形瓶中的溶液过滤，取滤渣置于电泳装置中，电泳液为0.1wt％十二烷基硫酸钠溶液，阴极和阳极之间的距离设置为10cm，阴极和阳极之间的电压设置为200v，电泳3h；将电泳后的壳聚糖用去离子水洗净，烘干后即得产物。
[0039]
实施例4
[0040]
称取2g壳聚糖粉末于250ml锥形瓶中，加入198ml去离子水和2ml醋酸，搅拌至壳聚糖完全溶解；然后向溶液中滴加1m/l氢氧化钠溶液，边加边搅拌，直至溶液ph约为12；再向锥形瓶中加入2g十二烷基硫酸钠，搅拌至十二烷基硫酸钠完全溶解，静置2h；将锥形瓶中的溶液过滤，取滤渣置于电泳装置中，电泳液为0.1wt％十二烷基硫酸钠溶液，阴极和阳极之间的距离设置为10cm，阴极和阳极之间的电压设置为200v，电泳2h；将电泳后的壳聚糖用去离子水洗净，烘干后即得产物。
[0041]
参照《组织工程医疗器械产品壳聚糖》(yy/t 1699
‑
2020)中规定的检测方法，对实施例1
‑
3所制备的壳聚糖的蛋白质含量进行检测。实验结果如下：
[0042]
表1实施例1
‑
4蛋白质脱除效果表
[0043][0044]
根据上述表格结果可知脱除后壳聚糖中蛋白质含量低于0.2wt％，到了《组织工程医疗器械产品壳聚糖》(yy/t 1699
‑
2020)中对于壳聚糖蛋白质含量不大于0.2wt％的要求，制得的壳聚糖能够达到医用级的水平，能够在医用材料方面得到广泛发应用。总体来说，本脱蛋白方法取得的效果能够达到甚至优于现有的碱法、酶法、生物发酵法等方法，且本方法具有更加环保、廉价、高效等优点。
[0045]
以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。