一种基于水疱性口炎病毒的EBV疫苗及其制备方法和应用与流程

一种基于水疱性口炎病毒的ebv疫苗及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基于水疱性口炎病毒的ebv疫苗及其制备方法和应用。


背景技术：

2.ebv是第一种被鉴定的人类致癌病毒，其与多种肿瘤性及非肿瘤性疾病的发生发展密切相关。特别的，ebv相关鼻咽癌因其在广东地区高发，又被称为“广东癌”。虽然针对ebv的疫苗研发已有数十年的历史，但它们大多针对gp350这一靶标进行设计，其相关的临床试验也表明它们不能阻止ebv感染细胞，仅能降低传染性单核细胞增多症的发病率——一种与ebv急性感染相关的自限性疾病。虽然前期文献有报道将ghgl展示于颗粒化蛋白蛋白表面用于制备ebv疫苗，但目前尚未见相关的临床试验，且颗粒化蛋白这一外源性物质的临床安全性也未得到有效的评估。
3.vsv是一种单股负链rna病毒。人并非其自然宿主。人感染后常引起流感样症状以及皮肤水疱。目前尚未有人因感染水疱性口炎病毒致死的报道。进一步，由于vsv的基因组简单(仅包含5个基因)且不能整合至人类基因组，目前已有报道将埃博拉病毒的糖蛋白gg以及新型冠状病毒的糖蛋白s展示于水疱性口炎病毒表面用于疫苗研制。其中前者由merck集团生产，并已得到美国和欧盟的批准用于临床预防埃博拉病毒感染。上述证据均表明将外源性病毒糖蛋白展示于vsv表面并用于疫苗研发系安全的、且系潜在临床可用的技术方案。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种重组vsv病毒以及产生重组vsv病毒的细胞，并基于重组vsv病毒制备了靶向ebv的疫苗。
5.本发明所采取的技术方案是：
6.本发明的第一方面，提供一种重组vsv病毒，所述病毒包含ebv的关键糖蛋白作为包膜蛋白。
7.在本发明的一些实施方式中，所述ebv的关键糖蛋白为gb或ghgl。
8.本发明的第二方面，提供一种细胞，所述细胞产生本发明第一方面所述的重组vsv病毒。
9.本发明的第三方面，提供一种疫苗，由本发明第一方面所述重组vsv病毒或本发明第二方面所述细胞制备而成。
10.在本发明的一些实施方式中，所述疫苗还包含佐剂。
11.在本发明的一些优选实施方式中，所述佐剂为为铝佐剂或其余疫苗常用佐剂，如cpg、as59、弗氏佐剂、弗氏不完全佐剂等均可以达到相似的效果，优选为铝佐剂。
12.本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述重组病毒或本发明第二方面所述细胞或第三方面所述疫苗在制备产品中的应用，所述产品用于(i)～(v)至少一项中的应用：
13.(i)制备eb病毒抗体；
14.(ii)检测样品中eb病毒中糖蛋白gb或ghgl；
15.(iii)用于治疗或预防eb病毒感染及其相关疾病；
16.(iv)eb病毒特异性中和抗体诊断；
17.(v)引发体液-细胞免疫应答。
18.在本发明的一些实施方式中，所述eb病毒感染具体为感染上皮细胞或感染b淋巴细胞；优选为b淋巴细胞。
19.在本发明的一些实施方式中，所述产品为药物、诊断试剂或检测试剂。
20.本发明的第五方面，提供一种产品，所述产品包含本发明第一方面所述重组病毒或本发明第二方面所述细胞。
21.在本发明的一些实施方式中，所述产品为药物、诊断试剂或检测试剂。
22.本发明的第六方面，提供一种重组vsv病毒的构建方法，通过将gb和ghgl展示于重组vsv病毒表面。
23.在本发明的一些实施方式中，所述方法的具体步骤包括：
24.s1：将携带噬菌体t7 rna聚合酶基因的病毒感染包装细胞；
25.s2：分别将包含vsv-n、vsv-p、vsv-l、vsv-g、vsv
‑△
g的质粒混匀配制转染试剂；
26.s3：将转染试剂转染至步骤s1中的细胞，收集滤液，包装vsv
‑△
g-g病毒；
27.s4：用vsv-g转染新鲜的包装细胞，扩增vsv
‑△
g-g病毒；
28.s5：将步骤s4中的vsv
‑△
g-g感染已表达gb或ghgl的细胞进行病毒扩增，收集上清滤液，获得表面展示gb或ghgl的重组vsv病毒。
29.在本发明的一些实施方式中，所述包装细胞为bsr-t7、bhk21或vero细胞。
30.在本发明的一些实施方式中，所述质粒载体为pbs或pcaggs。
31.在本发明的一些实施方式，步骤s5所述细胞为293t、bsr-t7、bhk21或vero细胞。
32.在本发明的一些实施方式中，所述vsv-n、vsv-p、vsv-l、vsv-g、vsv
‑△
g的质量比为(2～4)：(4～5)：1：(7～9)：(4～6)。
33.在本发明的一些优选实施方式中，所述vsv-n、vsv-p、vsv-l、vsv-g、vsv
‑△
g的质量比为3：5：1：8：5。
34.本发明的有益效果是：
35.本发明首次将ebv关键糖蛋白gb和ghgl展示于vsv表面，而且将修饰后的vsv用于动物免疫，提供了一种新的ebv疫苗种类，有望诱导机体产生足够强的免疫反应以防止ebv感染宿主细胞，从而降低ebv相关肿瘤性和非肿瘤性疾病的发病率。检测发现修饰后的vsv能引起显著的、针对ebv表面糖蛋白gb和ghgl的特异性抗体；并且证实了上述产生的特异性抗体可以抑制ebv感染上皮细胞以及b淋巴细胞；也表明了基于vsv的ebv疫苗可以用于防控人群的ebv感染及其相关的肿瘤性和非肿瘤性疾病，并有很好的免疫效果。
附图说明
36.图1为重组vsv病毒的包装与扩增示意图。其中图1a为vsv的全基因组序列被整合到pbs质粒载体上(pbs-vsv)，并由t7启动子驱动的示意图；图1b为在pbs-vsv质粒载体的基础上去除vsv的糖蛋白g的核酸序列，并将其替换成gfp的核酸序列(pbs-vsv
‑△
g)的示意
图；图1c为包装vsv重组病毒的全过程。
37.图2为重组vsv病毒在细胞水平复制扩增。
38.图3为通过密度梯度离心获取高纯度重组vsv病毒。其中图3a为染色结果；图3b为蛋白浓度测定结果。
39.图4为获得的vsv-δg-gb成功展示了gb蛋白且缺失vsv-g蛋白。
40.图5为动物免疫示意图。
41.图6为vsv-δg-gb和vsv-δg-gb-g免疫能产生高水平免疫应答。其中图6a为未加佐剂的vsv-δg-gb免疫；图6b为添加铝佐剂的vsv-δg-gb-g免疫。
42.图7为vsv-δg-gb-g免疫后血清能防止病毒感染。其中图7a为vsv-δg-gb-g免疫后血清能防止病毒感染上皮细胞(hne1)；图7b为vsv-δg-gb-g免疫后血清能防止病毒感染b淋巴细胞(akata(-))。
43.图8为vsv-δg-gb和vsv-δg-gb-g免疫后血清中igg1/igg2a结果。其中图8a为不含佐剂的vsv-δg-gb免疫结果；图8b为包含铝佐剂的vsv-δg-gb-g的免疫结果。
44.图9为elisa证实vsv-δg-ghgl免疫能产生高水平免疫应答。其中图9a为不含佐剂，图9b为含有铝佐剂。
45.图10为vsv-δg-ghgl免疫后血清能防止病毒感染。其中图10a为vsv-δg-ghgl免疫后血清能防止感染上皮细胞(hne1)；图10b为vsv-δg-ghgl免疫后血清能防止感染b淋巴细胞(akata(-))；其防止病毒感染上皮细胞的作用更强。
46.图11为混合注射vsv-δg-gb-g疫苗以及vsv-δg-ghgl疫苗的血清可高效阻断病毒感染上皮细胞(hne1)以及b淋巴细胞(akata(-))。其中图11a为阻断病毒感染上皮细胞(hne1)；图11b为阻断b淋巴细胞(akata(-))。
具体实施方式
47.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
48.实施例1vsv重组病毒的包装与扩增
49.1)vsv重组病毒的包装与扩增见图1。其中如图1a中，vsv的全基因组序列被整合到pbs质粒载体上(pbs-vsv)，并由t7启动子驱动。当pbs-vsv质粒转染到细胞中后，在t7 rna聚合酶的作用下开始转录合成rna链，并由rna链末端的δ-核酶加工后得到vsv的基因组的互补链，然后以此为模板，由vsv的rna聚合酶合成vsv的基因组rna和mrna，并表达出各个病毒蛋白n、p、m、g、l等，最后组装出vsv的病毒颗粒。
50.如图1b所示，在pbs-vsv质粒载体的基础上，去除vsv的糖蛋白g的核酸序列，并将其替换成gfp的核酸序列(pbs-vsv
‑△
g)，这样包装出的vsv病毒颗粒将是个裸露的病毒粒子，在病毒的囊膜表面缺失vsv的糖蛋白g(vsv
‑△
g)。因而，以此为基础，在包装vsv
‑△
g的同时，在细胞中表达ebv的糖蛋白(例如gb，ghgl等)，vsv
‑△
g在出芽的过程中会将展示在细胞膜表面的ebv糖蛋白gb、ghgl等包装到vsv
‑△
g病毒的囊膜上，得到展示有ebv糖蛋白gb、gb-g或者ghgl的vsv重组病毒(vsv
‑△
g-gb，vsv-δg-gb-g，vsv
‑△
g-ghgl)。
51.如图1c所示，展示了包装vsv重组病毒的全过程。主要包括初代转染、初代感染、噬斑纯化、母代病毒扩增、ebv糖蛋白展示等步骤：
52.1.初代转染：用痘病毒vtf7-3感染bsr-t7细胞，提供t7 rna聚合酶，然后将分别表达vsv病毒蛋白n、p、l、g的质粒pbs-vsv-n、pbs-vsv-p、pbs-vsv-l、pcaggs-vsv-g和vsv的基因组质粒pbs-vsv
‑△
g共转染到bsr-t7细胞中，t7 rna聚合酶转录出vsv的基因组的互补链，n、p、l蛋白组装成vsv的rna聚合酶，合成出vsv的基因组rna，并转录出vsv病毒蛋白的mrna，合成vsv的病毒蛋白，并最终包装出重组vsv病毒vsv
‑△
g-g，收集细胞和上清，反复冻融三次后破碎细胞，释放出细胞中的病毒粒子，离心去除细胞碎片，上清液用0.22μm滤膜过滤，去除痘病毒，然后将病毒液冻存于-80℃冰箱备用。
53.2.初代感染：由于病毒vsv
‑△
g-g的基因组中缺失vsv的糖蛋白g基因，因而vsv
‑△
g-g只能单次感染目标细胞，感染目标细胞后产生的子代病毒表面缺失vsv的糖蛋白g，丧失了再次感染宿主细胞的能力。因而，在扩增vsv
‑△
g-g病毒时，要提前在目标细胞中表达vsv的糖蛋白g，通过反式补充的方式展示到子代病毒表面，完成病毒的传代与扩增。
54.3.噬斑纯化：在vero细胞中提前表达vsv的糖蛋白g，24小时后，将vsv
‑△
g-g病毒液进行梯度稀释，感染vero细胞，感染1小时后弃去病毒液，加入含有低熔点琼脂的培养基，待琼脂凝固之后，放入37℃培养箱继续培养，期间观察vero细胞的病变情况，等到有明显的噬斑出现时，挑取单个噬斑，再进行扩增，达到纯化病毒的目的。
55.4.母代病毒扩增：选择合适的目标细胞如293t细胞，进行扩大培养，然后表达vsv的糖蛋白g，24小时后感染经过噬斑纯化的病毒vsv
‑△
g-g，再过24-48小时后观察细胞病变情况，待细胞全部变圆死掉时，收集细胞上清，离心去除细胞残渣，并用0.22μm的滤膜过滤，将病毒液保存于-80℃冰箱备用。
56.5.展示ebv的糖蛋白gb或ghgl：选择合适的目标细胞如293t细胞，表达ebv的糖蛋白gb或者ghgl(gl协助gh展示到细胞膜表面)，24小时后感染病毒vsv
‑△
g-g，感染1小时后弃去病毒液，用pbs洗去未吸附的病毒，更换新鲜的培养基培养，24-48小时后观察细胞病变情况，待细胞全部死亡，收集细胞上清，离心去除细胞残渣，并用0.22μm的滤膜过滤，得到展示有ebv糖蛋白的vsv重组病毒vsv
‑△
g-gb，vsv-δg-gb-g和vsv
‑△
g-ghgl。
57.具体实施过程如下：
58.1、包装重组病毒vsv
‑△
g-g
59.(1)铺bsr-t7细胞到10cm碟中，用含10％血清的dmem培养基，于37℃培养过夜，待细胞密度达到80％～90％。弃去培养基，用不含血清的dmem培养基稀释痘病毒vtf7-3，按照moi＝5的用量感染bsr-t7细胞1小时，期间要摇晃培养皿2～3次，使其均匀感染，充分吸附。痘病毒vtf7-3感染bsr-t7细胞后会在细胞内表达t7 rna聚合酶。
60.(2)痘病毒感染期间，配制转染试剂。按照pbs-vsv-n：pbs-vsv-p：pbs-vsv-l：pcaggs-vsv-g：pbs-vsv
‑△
g＝3μg：5μg：1μg：8μg：5μg的比例将相应的质粒加入到500μl的opti-mem中混匀，另外将lipo2000按照1：2的比例加入到另一支500μl的opti-mem中，用枪吹打混匀，静置5分钟。将配置好的500μl质粒-opti-mem和500μl lipo2000-opti-mem用枪吹打混匀，静置20分钟。
61.(3)待痘病毒感染1小时后，弃去上清病毒毒液，补充5ml opti-mem，将配置好的转染试剂均匀滴加到培养皿中，轻轻摇匀。转染4～6小时后，弃去上清，更换含10％血清的
dmem培养基，于37℃培养48小时左右，期间观察细胞的病变情况。
62.(4)转染48小时之后，收集细胞和上清液，并反复冻融三次，使得细胞破碎，释放出细胞内的病毒。500g离心10分钟取出细胞碎片，上清液用0.22μm的滤膜过滤，去除痘病毒，将病毒液冻存于-80℃冰箱备用。
63.2、扩增初代重组病毒vsv
‑△
g-g
64.(1)铺bsr-t7细胞到10cm碟中，用含10％血清的dmem培养基，于37℃培养过夜，待细胞密度达到80％～90％。
65.(2)配制转染试剂，取8μg pcaggs-vsv-g质粒加入到500μl opti-mem中，另外将lipo2000按照1：2的比例(16μl)加入到另一支500μl的opti-mem中，用枪吹打混匀，静置5分钟。将配置好的500μl质粒-opti-mem和500μl lipo2000-opti-mem用枪吹打混匀，静置20分钟。
66.(3)弃去bsr-t7细胞的培养基，补充5ml opti-mem，将配置好的转染试剂均匀滴加到培养皿中，轻轻摇匀。转染4～6小时后，弃去上清，更换含10％血清的dmem培养基，于37℃培养24～48小时。(4)弃去培养基，加入步骤1中收集的病毒液5ml，感染1小时，期间要摇晃培养皿2～3次，使其均匀感染，充分吸附。然后弃去上清病毒液，更换含5％血清的dmem培养基，于37℃培养24～72小时，期间观察细胞的病变情况，并用荧光显微镜观察gfp的表达情况。如图2所示，感染24小时后大量细胞明显表达gfp荧光蛋白。
67.(5)待大部分细胞出现细胞病变时，收集上清病毒液，500g离心10分钟去除细胞碎片，上清病毒液用0.22μm的滤膜过滤后，冻存于-80℃冰箱备用。
68.3、噬斑纯化
69.(1)铺vero细胞到6孔板中，用含10％血清的dmem培养基，于37℃培养过夜，待细胞密度达到80％～90％。
70.(2)配制转染试剂，每孔的质粒转染量为2μg。取2μg pcaggs-vsv-g质粒加入到100μlopti-mem中，另外将lipo2000按照1:2的比例(4μl)加入到另一支100μl的opti-mem中，用枪吹打混匀，静置5分钟。将配置好的100μl质粒-opti-mem和100μl lipo2000-opti-mem用枪吹打混匀，静置20分钟。
71.(3)弃去vero细胞的培养基，补充1ml opti-mem，将配置好的转染试剂均匀滴加到培养皿中，轻轻摇匀。转染4～6小时后，弃去上清，更换含10％血清的dmem培养基，于37℃培养20～24小时。
72.(4)取步骤2中收集的病毒液，按照10倍梯度稀释，每个稀释度取500μl病毒液用于感染vero细胞。
73.(5)转染20～24小时后，弃去vero细胞的培养基，加入梯度稀释的病毒液，感染1小时，期间要摇晃培养皿2～3次，使其均匀感染，充分吸附。然后弃去上清病毒液，更换含5％血清的软琼脂培养基，防止培养基流动，于37℃培养48～72小时，期间观察细胞的病变情况，并用荧光显微镜观察gfp的表达情况。
74.(6)待孔板中出现明显的噬斑时，用枪头挑取单个噬斑，连同琼脂培养基一起加入到ep管中，用100μl dmem培养基重悬，该病毒悬液即为噬斑纯化的重组病毒样品。
75.4、扩增重组病毒vsv
‑△
g-g
76.(1)铺293t细胞到15cm碟中，用含10％血清的dmem培养基，于37℃培养过夜，待细
胞密度达到80％～90％。
77.(2)配制转染试剂，每碟的质粒转染量为30μg。取30μg pcaggs-vsv-g质粒加入到500μl opti-mem中，另外将pei按照1：2的比例(60μl)加入到另一支500μl的opti-mem中，用枪吹打混匀，静置5分钟。将配置好的500μl质粒-opti-mem和500μl pei-opti-mem用枪吹打混匀，静置20分钟，均匀滴加到293t细胞的培养皿中，转染4～6小时后，更换新的含10％血清的dmem培养基。
78.(3)转染20～24小时后，弃去培养基，经噬斑纯化的病毒vsv
‑△
g-g用15ml dmem重悬混匀，感染293t细胞1小时，期间要摇晃培养皿2～3次，使其均匀感染，充分吸附。然后弃去上清病毒液，更换含5％血清的dmem培养基。于37℃培养48～72小时，期间观察细胞的病变情况，并用荧光显微镜观察gfp的强度。
79.(4)待大部分细胞出现细胞病变时，收集上清病毒液，500g离心10分钟去除细胞碎片，上清病毒液用0.22μm的滤膜过滤后，冻存于-80℃冰箱备用。
80.5、展示ebv糖蛋白gb
81.(1)铺293t细胞到15cm碟中，用含10％血清的dmem培养基，于37℃培养过夜，待细胞密度达到80％～90％。
82.(2)配制转染试剂，每碟的质粒转染量为30μg。取30μg pcaggs-ebv-gb质粒加入到500μl opti-mem中，另外将pei按照1：2的比例(60μl)加入到另一支500μl的opti-mem中，用枪吹打混匀，静置5分钟。将配置好的500μl质粒-opti-mem和500μl pei-opti-mem用枪吹打混匀，静置20分钟，均匀滴加到293t细胞的培养皿中，转染4～6小时后，更换新的含10％血清的dmem培养基。
83.(3)转染20～24小时后，弃去培养基，取扩增好的vsv
‑△
g-g病毒液15ml，感染293t细胞1小时，期间要摇晃培养皿2～3次，使其均匀感染，充分吸附。然后弃去上清病毒液，用pbs洗两遍，更换含5％血清的dmem培养基。于37℃培养48～72小时，期间观察细胞的病变情况，并用荧光显微镜观察gfp的强度。
84.(4)待大部分细胞出现细胞病变时，收集上清病毒液，此时vsv病毒表面即展示有ebv的糖蛋白gb，即为重组病毒vsv
‑△
g-gb。500g离心10分钟去除细胞碎片，上清病毒液用0.22μm的滤膜过滤后，冻存于-80℃冰箱备用。
85.6、展示ebv糖蛋白ghgl
86.(1)铺293t细胞到15cm碟中，用含10％血清的dmem培养基，于37℃培养过夜，待细胞密度达到80％～90％。
87.(2)配制转染试剂，每碟的质粒转染量为30μg。取15μg pcaggs-ebv-gh和15μgpcaggs-ebv-gl质粒加入到500μl opti-mem中，另外将pei按照1：2的比例(60μl)加入到另一支500μl的opti-mem中，用枪吹打混匀，静置5分钟。将配置好的500μl质粒-opti-mem和500μl pei-opti-mem用枪吹打混匀，静置20分钟，均匀滴加到293t细胞的培养皿中，转染4～6小时后，更换新的含10％血清的dmem培养基，gl将协助gh展示到细胞膜表面。
88.(3)转染20～24小时后，弃去培养基，取扩增好的vsv
‑△
g-g病毒液15ml，感染293t细胞1小时，期间要摇晃培养皿2～3次，使其均匀感染，充分吸附。然后弃去上清病毒液，用pbs洗两遍，更换含5％血清的dmem培养基。于37℃培养48～72小时，期间观察细胞的病变情况，并用荧光显微镜观察gfp的强度。
89.(4)待大部分细胞出现细胞病变时，收集上清病毒液，此时vsv病毒表面即展示有ebv的糖蛋白ghgl，即为重组病毒vsv
‑△
g-ghgl。500g离心10分钟去除细胞碎片，上清病毒液用0.22μm的滤膜过滤后，冻存于-80℃冰箱备用。
90.7、还可以提供一种构建vsv-δg-gb-g的方法，具体为将gb的信号肽置换为cd5及将胞内段替换成vsv-g的胞内段，增加gb在vsv表面的展示水平。将ebv-gb跨膜区与胞内段置换为vsv-g跨膜区与胞内段的重组型ebv糖蛋白gb(gb-g)。具体步骤如下：
91.(1)铺293t细胞到15cm碟中，用含10％血清的dmem培养基，于37℃培养过夜，待细胞密度达到80％～90％。
92.(2)配制转染试剂，每碟的质粒转染量为30μg。取30μg pcaggs-ebv-gb-g质粒加入到500μl opti-mem中，另外将pei按照1：2的比例(60μl)加入到另一支500μl的opti-mem中，用枪吹打混匀，静置5分钟。将配置好的500μl质粒-opti-mem和500μl pei-opti-mem用枪吹打混匀，静置20分钟，均匀滴加到293t细胞的培养皿中，转染4～6小时后，更换新的含10％血清的dmem培养基。
93.(3)转染20～24小时后，弃去培养基，取扩增好的vsv
‑△
g-g病毒液15ml，感染293t细胞1小时，期间要摇晃培养皿2～3次，使其均匀感染，充分吸附。然后弃去上清病毒液，用pbs洗两遍，更换含5％血清的dmem培养基。于37℃培养48～72小时，期间观察细胞的病变情况，并用荧光显微镜观察gfp的强度。
94.(4)待大部分细胞出现细胞病变时，收集上清病毒液，此时vsv病毒表面即展示将信号肽置换为cd5及将胞内段置换为vsv-g的重组型ebv糖蛋白gb(gb-g)，即为重组病毒vsv
‑△
g-gb-g。500g离心10分钟去除细胞碎片，上清病毒液用0.22μm的滤膜过滤后，冻存于-80℃冰箱备用。
95.实施例2vsv重组病毒的纯化与鉴定
96.1、vsv重组病毒的纯化与鉴定
97.(1)将扩增得到的病毒液vsv
‑△
g-gb、vsv
‑△
g-gb-g和vsv
‑△
g-ghgl分别用高速离心机浓缩，在4℃条件下，100000g，离心2小时，沉淀用1ml pbs重悬。
98.(2)用密度梯度制备仪制备20％～50％的蔗糖密度梯度，将浓缩的vsv
‑△
g-gb和vsv
‑△
g-ghgl病毒液，在4℃条件下，40000g，超速离心16小时，用20％～50％的蔗糖密度梯度进行分离，可以看到离心管中出现一条明显的白色条带，即为病毒样品层。
99.(3)用密度梯度分离仪分层取出超速离心之后的样品，分别取少量样品，用考马斯亮蓝染色实验分析每层样品的分布情况，根据vsv病毒n、p、m、l蛋白的特征条带加以确认。如图3所示，重组vsv病毒经蔗糖密度梯度离心后，分层取样进行考马斯亮蓝实验，结果表明重组vsv病毒主要集中分布在第7、8管样品中，根据vsv病毒n、p、m、l蛋白的特征条带分析表明，ebv的gb同样分布在第7、8管样品中，表明ebv的gb蛋白成功展示到重组vsv病毒表面。
100.(4)收集包含重组病毒的样品，用pbs重悬，然后在4℃条件下，100000g，离心2小时，进行脱糖处理，沉淀用pbs重悬，即为纯化得到的重组病毒样品vsv
‑△
g-gb，vsv-δg-gb-g和vsv
‑△
g-ghgl。
101.(5)取少量的病毒液样品，进行western blot实验和elisa实验，检测重组病毒展示gb，gb-g和ghgl的量。如图4所示，纯化的野生型的vsv病毒可以明显检测到其糖蛋白g；纯化的重组vsv病毒vsv
‑△
g检测不到其糖蛋白g；重组vsv病毒vsv
‑△
g经转染回补vsv的糖蛋
白g之后再经纯化，又可检测到其糖蛋白g；重组vsv病毒vsv
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g经转染回补ebv的糖蛋白gb之后再经纯化，可以检测到ebv的gb蛋白。
102.(6)取少量病毒液样品，抽提病毒的基因组rna，用rt-q-pcr测定其基因组核酸含量，通过与已知滴度的野生型病毒对比，换算出重组病毒的相对滴度。
103.实施例3小鼠免疫
104.1、vsv-δg-gb，未加佐剂
105.1)取40只balb/c小鼠，在8周龄时开始免疫，并于初次免疫后第3周，第6周分别给予一次加强免疫(见图5)；
106.2)准备200μl如下疫苗，在腹部经皮下注射给药：vsv-δg-1e6，vsv-δg-gb-1e5，vsv-δg-gb-1e6，vsv-δg-gb-1e7，vsv-δg-gb-1e8；
107.3)分别在免疫前、初次免疫后两周、每次加强免疫后两周经眼眦后静脉丛采血，每次采血5～6滴，收集至1.5ml ep管；
108.4)37℃孵育30min；18000rcf，4℃，离心30min；
109.5)上清转移至新的ep管中，56℃灭活30min；
110.6)-80℃保存，留待后用；
111.2、vsv-δg-gb-g，加铝佐剂
112.1)取20只c57小鼠，在6周龄时开始免疫，并于初次免疫后第3周，第6周分别给予一次加强免疫(见图5)；
113.2)准备200μl如下疫苗，在腹部经皮下注射给药：pbs 佐剂(adj)，vsv-δg-1e9 佐剂(adj)，vsv-δg-gb-g-1e8 佐剂(adj)，vsv-δg-gb-g-1e9 佐剂(adj)；
114.3)分别在免疫前、初次免疫后两周、每次加强免疫后两周经眼眦后静脉丛采血，每次采血6～8滴，收集至1.5ml ep管；
115.4)室温静置2～4小时；1500rcf，4℃，离心30min；
116.5)血清转移至新的ep管中，56℃灭活30min；
117.6)-80℃保存，留待后用；
118.3、vsv-δg-ghgl，未加佐剂
119.1)取40只balb/c小鼠，在8周龄时开始免疫，并于初次免疫后第3周，第6周分别给予一次加强免疫(见图5)；
120.2)准备200μl如下疫苗，在腹部经皮下注射给药：vsv-δg-1e6，vsv-δg-ghgl-1e5，vsv-δg-ghgl-1e6，vsv-δg-ghgl-1e7，vsv-δg-ghgl-1e8；
121.3)分别在免疫前、初次免疫后两周、每次加强免疫后两周经眼眦后静脉丛采血，每次采血5～6滴，收集至1.5ml ep管；
122.4)37℃孵育30min；18000rcf，4℃，离心30min；
123.5)上清转移至新的ep管中，56℃灭活30min；
124.6)-80℃保存，留待后用；
125.4、vsv-δg-ghgl，加铝佐剂
126.1)取40只balb/c小鼠，在8周龄时开始免疫，并于初次免疫后第3周，第6周分别给予一次加强免疫(见图5)；
127.2)准备200μl如下疫苗，在腹部经皮下注射给药：pbs 佐剂，vsv-δg-1e9，vsv-δ
g-1e9 佐剂，第一批vsv-δg-ghgl-1e8，第一批vsv-δg-ghgl-1e8，第二批vsv-δg-ghgl-1e8，第二批vsv-δg-ghgl-1e8 佐剂，第二批vsv-δg-ghgl-1e9，第二批vsv-δg-ghgl-1e9 佐剂，第二批vsv-δg-ghgl-0.5e9 vsv-δg-gb-opt-0.5e9，第二批vsv-δg-ghgl-1e9 vsv-δg-gb-opt-0.5e9 佐剂；
128.3)分别在免疫前、初次免疫后两周、每次加强免疫后两周经眼眦后静脉丛采血，每次采血6～8滴，收集至1.5ml ep管；
129.4)室温静置2～4小时；1500rcf，4℃，离心30min；
130.5)血清转移至新的ep管中，56℃灭活30min；
131.6)-80℃保存，留待后用。
132.实施例4血清抗体滴度检测
133.1)取经过纯化后的ebv gb或ebvghgl蛋白，使用pbs稀释至1ng/μl；
134.2)取高黏附96孔板，每孔加入100μl稀释后蛋白，于4℃孵育过夜；
135.3)配置洗板液：含有0.1％tween-20的pbs(pbst)；
136.4)配制封闭液：使用pbst溶解牛血清球蛋白(bsa)，终浓度为5％(w/v)；
137.5)弃上清，用洗板液清洗各孔；
138.6)每孔加入350μl封闭液，37℃孵育1小时；
139.7)使用封闭液按如下倍数倍比稀释血清：100，300，900，2700，8100，24300，72900，218700；
140.8)弃上清，用洗板液清洗各孔；
141.9)每孔加入100μl稀释后血清，37℃孵育1小时；
142.10)弃上清，用洗板液清洗各孔；
143.11)每孔加入100μl稀释后抗体(根据实验需要，抗体分别为抗小鼠总igg,igg1,igg2a,igg2b,igg2c,igg3)，37℃孵育1小时；
144.12)弃上清，用洗板液清洗各孔；
145.13)每孔加入100μltmb底物后，加入100μl 1：12(v/v)稀盐酸终止反应；
146.14)使用读板仪读取od450，od630，结果见图6，图8，图9。
147.图6显示小鼠接受vsv-δg-gb(图6a)和vsv-δg-gb-g(图6b)免疫后血清中总igg滴度的结果。结果表明，免疫后小鼠产生针对ebvgb的特异抗体，且抗体滴度随免疫原增加而增加；且加强免疫可以有效提高抗体滴度。
148.图8显示小鼠接受vsv-δg-gb(图8a)和vsv-δg-gb-g(图8b)两次加强免疫后血清中igg1与igg2a比值的结果。结果表明，该疫苗免疫后能产生较为接近的igg1和igg2a亚型抗体，提示一种平衡的细胞-体液免疫应答特征。
149.图9显示小鼠接受未加佐剂的vsv-δg-ghgl(图9a)免疫或添加铝佐剂的vsv-δg-ghgl(图9b)免疫后血清中总igg滴度的结果。结果表明，免疫后小鼠产生针对ebvghgl的特异抗体，且抗体滴度随免疫原增加而增加；且加强免疫可以有效提高抗体滴度。
150.实施例5血清中和保护效果检测
151.1、上皮细胞株hne1中和实验
152.1)使用含有10％胎牛血清的rpmi 1640培养基培养细胞，培养温度37℃，并补充5％co2；
153.2)取生长状态良好的细胞行细胞计数；
154.3)取96孔板，每孔铺5000个细胞，培养过夜；
155.4)准备含akata-ebv病毒的细胞培养基，按如下倍数稀释的血清：10，20，40，80，160，320，640，1280，得到血清-病毒混合物；将混合物置于37℃，5％co2环境中孵育1小时；
156.5)弃细胞上清，将上述血清-病毒混合物加至细胞，在37℃，5％co2环境中孵育1～2小时；
157.6)弃细胞上清，加入200μl含10％胎牛血清的rpmi 1640培养基于37℃，5％co2环境中培养24小时；
158.7)弃细胞上清，加入胰蛋白酶消化细胞，并用等体积含10％胎牛血清的rpmi 1640培养基终止消化；
159.8)使用流式细胞仪检测细胞绿色荧光蛋白读值。
160.2、b淋巴细胞株akata(-)中和实验
161.1)使用含有10％胎牛血清的rpmi 1640培养基培养细胞，培养温度37℃，并补充5％co2；
162.2)取生长状态良好的细胞行细胞计数；
163.3)取96孔板，每孔铺10000个细胞，每孔50μl体积；
164.4)准备含akata-ebv病毒的细胞培养基，按如下倍数稀释的血清：10，20，40，80，160，320，640，1280，得到血清-病毒混合物；将混合物置于37℃，5％co2环境中孵育1小时；
165.5)将上述血清-病毒混合物加至细胞，在37℃，5％co2环境中孵育24小时；
166.6)使用流式细胞仪检测细胞绿色荧光蛋白读值。
167.图7显示使用vsv-δg-gb-g两次加强免疫后血清体外中和实验结果。结果表明，免疫后血清有弱的上皮细胞中和抗体(图7a)以及强的淋巴细胞中和抗体(图7b)。
168.图10显示使用含有铝佐剂的vsv-δg-ghgl两次加强免疫后血清体外中和实验结果。结果表明，免疫后血清有强的上皮细胞中和抗体(图10a)以及弱的淋巴细胞中和抗体(图10b)。
169.图11显示，与单纯使用含有铝佐剂的vsv-δg-ghgl两次加强免疫后血清相比，合并使用vsv-δg-gb-g免疫可在不明显影响上皮细胞中和抗体滴度的情况下加强淋巴细胞中和抗体水平，提示两种疫苗混合应用具有协同效应。
170.上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。