一种具有ACE抑制作用的活性多肽及其应用的制作方法

一种具有ace抑制作用的活性多肽及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体的说，涉及一种具有ace抑制作用的活性多肽及其应用。


背景技术：

2.高血压是最常见的心血管疾病之一，也是导致脑卒中、冠心病、心力衰竭等疾病的重要危险因素。根据2020年世界卫生组织的统计，全世界约有11.3 亿人患有高血压，已经严重威胁人类的健康。血管紧张素转换酶(angiotensin-i converting enzyme,ace)是一种二肽羧基金属蛋白酶，在肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,ras)和激肽释放酶-激肽系统 (kallikrein-kinin system,kks)中起着重要的调控作用。ace抑制剂可通过抑制ace活性，阻止血管紧张素i转化为血管紧张素ii，维持血管紧张素缓激肽的活性来降低血压。目前，常用于治疗高血压的ace抑制剂有卡托普利、依那普利、福辛普利、拉米普利等。虽效果明显，但长期服用副作用较大，包括咳嗽、味觉变形、皮疹、肾脏功能下降以及患肺癌风险增加等。因此，研究重点已转向寻找对健康有益且无副作用的天然ace抑制剂。
3.食品源活性肽具有易溶解性、无致敏性和良好的admet(absorption, distribution,metabolism,excretion and toxicity)特性，因而越来越受到人们的关注。近年来，具有多种功能的食品源生物肽被发现，例如ace抑制肽，抗炎肽，二肽基肽酶iv抑制肽和抗氧化肽等。目前，国内外学者已发现大量动植物中含有抑制ace的生物活性肽，尤其是在各种常食用动物当中，如鸡、鸭、鱼、猪、牛等。
4.新西兰白兔作为我国饲养最多的食用兔类，是一种高营养价值的功能性肉类食品。兔肉富含蛋白质、矿物质、维生素、卵磷脂和多不饱和脂肪酸，可以为消费者提供生物活性物质，经常食用可以对控制心血管疾病和其他慢性疾病起到关键作用。目前，国内外对兔肉的研究主要聚焦于营养价值，尚无有关兔肉源ace抑制肽及其作用机制的研究报道。


技术实现要素：

5.为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种来源于兔肉、对ace的活性具有持续稳定的抑制作用、具有良好降血压效果的ace抑制肽。
6.本发明目的是这样实现的：
7.一、一种具有ace抑制作用的活性多肽，其关键在于：其氨基酸序列为 trp-ala-gly-pro(wagp)。
8.二、一种上述具有ace抑制作用的活性多肽在制备ace抑制药物中的应用。
9.三、一种上述的具有ace抑制作用的活性多肽在制备降血压药物中的应用。
10.四、一种具有ace抑制作用的药物，其关键在于：其活性成分含有上述的具有ace抑制作用的活性多肽。
11.五、一种具有降血压作用的药物，其关键在于：其活性成分含有上述的具有ace抑
制作用的活性多肽。
12.有益效果：
13.本发明一种具有ace抑制作用的活性多肽，对ace的活性具有持续稳定的抑制作用，并具有良好的降血压效果，因此可作为活性成分用于食品、保健品以及降血压药物中，具有良好的潜力和应用前景。
附图说明
14.图1为馏分f-4的反相高效液相色谱图；
15.图2为不同浓度的活性多肽在体外胃肠消化前后的ace抑制活性；
16.图3为单次口服生理盐水、卡托普利(20mg/kg)和wgap(25、50和100 mg/kg)对高血压大鼠收缩压影响的线型图(数据为平均值
±
标准差(n＝6)；
×
表示p《0.05卡托普利组与生理盐水组，
××
表示p《0.01卡托普利组与生理盐水组，*表示p《0.05 25mg/kg wgap组与生理盐水组，**表示p《0.01 25mg/kgwgap组与生理盐水组，#表示p《0.05 50mg/kg wgap组与生理盐水组，##表示p《0.01 50mg/kg wgap组与生理盐水组，
△
表示p《0.05 100mg/kg wgap组与生理盐水组，
△△
表示p《0.01 100mg/kg wgap组与生理盐水组)。
具体实施方式
17.下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
18.实施例
19.一、ace抑制肽的制备将兔肉剁碎，用蒸馏水将浓度配至50mg/ml，并使用组织匀浆器匀浆2min。匀浆液在沸水浴中灭活10min。冷却后，使用五种不同的酶(碱性蛋白酶：50℃，ph7.0；胃蛋白酶：37℃，ph2.0；胰蛋白酶：37℃， ph8.0；复合蛋白酶：50℃，ph7.0；菠萝蛋白酶：55℃，ph7.0)在最佳条件下水解2、3、4、5或6小时，酶与兔肉的质量比为1:10。在水解过程中，反应混合物的ph值通过加入0.5n naoh或0.5n hcl来保持。然后将混合物煮沸10 分钟以终止反应，迅速冷却到室温，并调整到ph7.0。然后用tgl-20离心机在 4℃条件下以10,000r/min离心20min。用滤纸过滤上清液，在冻干机中冻干，得到兔肉蛋白水解物(rmph)。测量每个rmph的ace抑制活性，将活性最高的rmph储存在-20℃以备进一步研究。随后采用超滤法、sephadex g-15凝胶过滤层析(gfc)、高效液相色谱(rp-hplc)对酶解物中功效组分进行筛选，最终找出f4-4具有最强ace抑制活性(最终结果如图1)；然后采用液相色谱-串联质谱(hplc-ms/ms)对功效肽组分进行鉴定，确定多肽氨基酸序列为trp-ala-gly-pro，即wgap。
20.二、ace抑制活性检测测定wgap对ace活性的抑制作用。在37℃下，将20μl的wgap溶液与ace溶液(20μl，25mu/ml)在50mm硼酸盐钠缓冲液(含0.3m nacl，ph8.3)中预孵化10分钟。然后将马脲酰组氨酰亮氨酸(hhl) 溶液(20μl，5mm)加入到反应混合物中，并在37℃下孵育30min。加入100 μl的1m hcl终止反应。再加入乙酸乙酯(1ml)，摇动后，并在10,000r/min 和4℃条件下离心10min。取上层，在60℃下真空蒸发至干。将残余物溶于100 μl一级水，在228nm处测量吸光度。ace的抑制活性根据公式计算：
21.ace抑制活性(％)＝(a
对照
–a样品
)/(a
对照
–a空白
)
22.其中a
对照
是没有抑制剂时的吸光度，a
样品
是反应混合物的吸光度，a
空白
是缓冲液的吸
光度。ic
50
值被定义为对ace活性造成50％抑制的抑制剂的浓度。
23.结果显示，多肽wgap表现出的ace抑制ic
50
为140.70
±
4.51μm。
24.三、体外的消化稳定性将wgap溶解在0.1m kcl中，并用1m hcl调节到ph值2.0。加入胃蛋白酶(e/s 2％，w/w)，在37℃水浴中消化多肽2h。通过在100℃下加热10min停止反应，用2m naoh快速调节ph值至8.0。然后加入胰蛋白酶(e/s 2％，w/w)，在37℃孵育3小时。再次在100℃下灭活 10分钟。冷却到室温后，将水解液调整到ph7.0，并以10,000r/min离心10分钟。最后，对上清液的ace抑制活性进行检测，并与消化前的肽进行比较。结果如图2所示，用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，wgap的ace抑制活性没有明显变化(p》0.05)。这些结果表明，wgap对胃肠道消化有抵抗力，可在体内表现出降血压的作用。
25.四、体内的抗高血压作用雄性sd大鼠(10周，体重250
±
20g)由中国重庆医科大学实验动物中心提供，在标准条件下(12小时光照/黑暗周期，22
±
1℃) 饲养，自由采食和饮水。调理一周后，大鼠腹腔注射15mg/kg l-n-硝基精氨酸，每天一次，持续四周，以在实验开始前建立高血压模型。随后，将大鼠随机分为5个治疗组，每组6只：阳性对照组、阴性对照组、高、中、低剂量组。阳性对照组的大鼠口服卡托普利(20mg/kg)，阴性对照组的大鼠口服生理盐水。高、中、低剂量组的大鼠分别以100、50和25mg/kg体重的剂量口服wgap。使用无创血压测量分析系统在给药后0、2、4、6、8、10和12小时测量收缩压 (sbp)。结果如图3所示，阴性对照组(0.9％生理盐水)在给药后12小时内没有表现出sbp的下降，而阳性对照组(卡托普利，20mg/kg)则表现出明显的下降(p《0.01)。卡托普利给药6小时后，sbp下降了41.79
±
2.34mmhg(p ＜0.01)。然而，wgap处理组(25、50和100mg/kg)仅在4小时后就表现出 sbp的下降(p＜0.01)，分别为23.45
±
1.63、32.85
±
1.94和42.66
±
2.87mmhg (图3)，表明wgap的吸收比卡托普利好。此外，sbp的变化程度是呈wgap 剂量依赖性的。12h后，大鼠的sbp在高剂量wgap组中明显降低了 13.80
±
1.24mmhg(p＜0.01)，在卡托普利组中降低了9.28
±
0.76mmhg(p＜0.05)，但与阴性对照组相比，中剂量和低剂量wgap组没有明显差异(p＞0.05)。
26.因此，wgap在高血压大鼠口服后能显著降低sbp，是一种潜在的天然ace 抑制肽。
27.最后需要说明的是，上述描述仅仅为本发明的优选实施例，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。