一种多芳乙烯β-二酮类化合物或其药学上可接受的盐及其应用的制作方法

一种多芳乙烯
β-二酮类化合物或其药学上可接受的盐及其应用
技术领域
1.本发明属于药物技术领域，涉及一种多芳乙烯β-二酮类化合物或其药学上可接受的盐及其应用。


背景技术：

2.放疗是恶性肿瘤综合治疗中重要方式之一，基于常规长程放疗的新辅助治疗已成为治疗多种恶性肿瘤的标准方案。但长期的临床研究发现，恶性肿瘤患者对于放射性治疗的响应程度差异较大，尽管一部分患者在治疗周期结束时可以实现病理完全缓解，然而，有部分的患者不能从长程治疗中获益，少部分患者甚至出现恶化进展。如中山大学肿瘤防治中心结直肠科近年来(2014-2019年，年均收治1800例)的评估结果显示，不能获益的患者占比为30％左右，出现进展的占比达10％；另外，放射性治疗所产生的副作用在临床上也不可忽视。因此，如何提升恶性放射性治疗效果，提升患者获益率，减少放射性使用剂量等，成为恶性肿瘤临床治疗中所关注的问题。
3.当前，针对放射性治疗的增敏，主要有使用解除肿瘤低氧特征的化合物，如临床药物甘胺双唑钠(cmna)。但该药物活性偏低，使用剂量大、存在毒副作用明显等缺陷。
4.研究发现，肿瘤对放疗的耐受的机制，除了与肿瘤中低氧环境影响有关外，放疗导致的dna损伤修复机制的增强也是其重要原因。但针对性的药物当前仍然没有突破，发现具有克服这些因素的放疗增敏药物具有迫切的临床需求。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种多芳乙烯β-二酮类化合物或其药学上可接受的盐及其应用。
6.为实现上述目的，第一方面，本发明采取的技术方案如下：
7.一种多芳乙烯β-二酮类化合物或其药学上可接受的盐，其结构如式(1)所示：
8.9.式(1)中，r1＝r5＝r9＝h，r2＝r6＝ome，r7＝oh；当r3＝r4＝ome时，r8为f、cl、i中的一种；当r3和r4连接成为-och2o-时，r8为f、cl、br、i中的一种。
10.优选地，所述多芳乙烯β-二酮类化合物为以下结构式所示化合物中的一种：
[0011][0012]
第二方面，本发明采取的技术方案如下：
[0013]
一种多芳乙烯β-二酮类化合物或其药学上可接受的盐在制备放射性治疗药物中的应用，所述多芳乙烯β-二酮类化合物的结构如式(1)所示：
[0014][0015]
式(1)中，r1和r
4-r9分别为h、oh、nh2、ch2oh、ch2nh2、ome、oc2h5、ocf3、f、cl、br、i中的一种，r2和r3分别为h、oh、nh2、ch2oh、ch2nh2、ome、oc2h5、ocf3、f、cl、br、i中的一种，但当r1＝r5＝r9＝h，r2＝r3＝r4＝r6＝ome，r7＝oh时，r8不为h；当r1＝r2＝r5＝r9＝h，r3＝r4＝r6＝ome，r7＝oh时，r8不为h。
[0016]
优选地，式(1)中，r1＝r5＝r9＝h，r2、r3、r4与r6分别为ome、oc2h5、ocf3中的一种，r7为oh、ch2oh、nh2、ch2nh2中的一种，r8为ome、oc2h5、ocf3、br、cl、f或i中的一种；更优选地，式(1)中，r1＝r5＝r9＝h，r2＝r3＝r4＝r6＝ome，r7为oh，r8为ome、br中的一种。
[0017]
优选地，式(1)中，r1＝r5＝r6＝r9＝h，r2、r3、r4与r7分别为ome、oc2h5、ocf3中的一种，r8为oh、ch2oh、nh2、ch2nh2中的一种；更优选地，式(1)中，r1＝r5＝r6＝r9＝h，r2＝r3＝r4＝r7＝ome，r8为oh。
[0018]
优选地，式(1)中，r3＝r4＝r6＝r8＝h，r1、r2、r5、r7与r9分别ome、oc2h5、ocf3中的一种；更优选地，式(1)中，r3＝r4＝r6＝r8＝h，r1＝r2＝r5＝r7＝r9＝ome。
[0019]
优选地，式(1)中，r3＝r4＝r5＝r6＝r9＝h，r1、r2、r7与r8分别为ome、oc2h5、ocf3中的一种。
[0020]
优选地，式(1)中，r1＝r4＝r5＝r9＝h，r2与r3分别为oh、ome、oc2h5、ocf3中的一种，r6为h、f、cl、br、i、oh、ome、oc2h5、ocf3中的一种，r7为oh、ome、ch2oh、nh2、ch2nh2中的一种，r8为h、ome、ocf3、oc2h5、br、cl、f、i中的一种；更优选地，式(1)中，r1＝r4＝r5＝r9＝h，r2和r3分别为ome或oh，r6为h、f、br、oh、ome中的一种，r7为oh或ome，r8为h、ome、oc2h5、br中的一种。
[0021]
优选地，式(1)中，r1＝r4＝r6＝r8＝h，r2与r3分别为ome、oc2h5、ocf3中的一种，r5、r7与r9分别为ome、oc2h5、ocf3中的一种；更优选地，式(1)中，r1＝r4＝r6＝r8＝h，r2＝r3＝r5＝r7＝r9＝ome。
[0022]
优选地，式(1)中，r1＝r4＝r5＝r9＝h，r2和r3连接成为-och2o-，r6为f、cl、br、i、ome、oc2h5、ocf3中的一种，r7为oh、ch2oh、nh2、ch2nh2中的一种，r8为h、ome、oc2h5、ocf3、br、cl、f、i中的一种；更优选地，式(1)中，r1＝r4＝r5＝r9＝h，r2和r3连接成为-och2o-，r6为f、br或ome，r7为oh，r8为h、ome、br中的一种。
[0023]
优选地，所述多芳乙烯β-二酮类化合物为以下结构式所示化合物中的一种：
[0024]
优选地，所述放射性治疗药物包括肿瘤放疗增敏药物。更优选地，肿瘤包括抗生殖系统肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、神经系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、皮肤肿瘤、骨与软组织肉瘤、乳腺癌、甲状腺癌、垂体瘤中的至少一种。
[0025]
本发明提供的多芳乙烯β-二酮类化合物具有以下显著有益特征：
[0026]
1)具有放疗增敏作用，在低剂量(在细胞水平的有效浓度为纳摩尔级)下即可显著提升对多种肿瘤的放疗效果，且活性远优于我们前期报道的分子t83、t63以及其它多数已报道的增敏剂；
[0027]
2)对低氧环境肿瘤显示出更强的增敏效应；
[0028]
3)可有效抑制由放疗所致dna损伤后的修复过程，有利于促进放疗对肿瘤细胞的杀伤效应；
[0029]
4)可有效协同激活干扰素基因激活蛋白(sting)信号通路，有利于免疫系统对肿瘤细胞的清除；
[0030]
因此，本发明提供的多芳乙烯β-二酮类化合物作为放疗增敏活性成分应用于肿瘤的放射治疗中，可大幅提高肿瘤的放疗效果。
附图说明
[0031]
图1为多芳乙烯β-二酮类化合物pt33分别在hct116和sw837肿瘤细胞模型中的放疗增敏活性。
[0032]
图2为多芳乙烯β-二酮类化合物pt33在乏氧(5v/v％o2)条件下的放疗增敏活性。
[0033]
图3为多芳乙烯β-二酮类化合物pt33与放射治疗联用对hct116肿瘤细胞的协同放疗增敏作用。
[0034]
图4为多芳乙烯β-二酮类化合物pt33对小鼠下咽癌移植肿瘤的放疗的影响。
[0035]
图5为多芳乙烯β-二酮类化合物pt33对小鼠结直肠癌移植肿瘤的放疗的影响。
[0036]
图6为多芳乙烯β-二酮类化合物pt33对放疗后dna损伤的影响。
[0037]
图7为多芳乙烯β-二酮类化合物pt33对dna修复的完成时间的影响。
[0038]
图8为多芳乙烯β-二酮类化合物pt33对γ-h2ax在dna的dsb位点聚集停留时间的影响。
[0039]
图9为多芳乙烯β-二酮类化合物pt33对dna同源重组修复酶rad51入核的影响。
[0040]
图10为多芳乙烯β-二酮类化合物pt33对放疗作用下sting免疫通路的影响。
具体实施方式
[0041]
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0042]
实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043]
本文中，缩写“me”为甲基，“药学上可接受的盐”可以为多芳乙烯β-二酮类化合物与合适的非毒性有机碱或无机碱形成的盐。
[0044]
我们早期曾经发现多芳乙烯β-二酮类化合物具有抗肿瘤作用潜力
(cn200810220580.x)，但将其作为抗肿瘤化疗药物使用，其体内效应不高。此后我们将多芳乙烯β-二酮类化合物t83应用于鼻咽癌细胞模型cne2中(bmc cancer,2013,13,323)，发现在50nm t83联合4gy辐射剂量情况下，能减少40％的细胞集落生成率，相比单独使用50nm t83(8％)效果与4gy辐射剂量(25％)效果之和进一步减少7％左右，相比单独4gy辐射剂量(25％)作用下细胞集落生成率进一步减少20％左右，表明t83具有一定的协同增强效应；还将多芳乙烯β-二酮类化合物t63应用于鼻咽癌细胞模型cne2中(中国病理生理杂志,2013，29(5)，821)，发现在100nm t63联合6gy辐射剂量情况下，能减少80.2％细胞集落生成率，接近单独使用100nm t63(43％)以及6gy辐射剂量(37％)效应之和，表明在此条件下t63表现加和作用，但没有表现明显的协同增强效应；但在耐药细胞株cner模型上，在100nm t63联合6gy辐射剂量情况下，能减少87.0％细胞集落生成率，相比单独使用100nm t63(48％)以及6gy辐射剂量(18％)效应之和增强21％左右。
[0045][0046]
在此基础上，我们又进行了广泛设计与筛选，发现结构如式(1)所示的多芳乙烯β-二酮类化合物或其药学上可接受的盐对恶性肿瘤具有显著放疗增敏作用，将其作为放疗增敏活性成分可用于制备放射性治疗药物，该放射性治疗药物与放疗方法联用可以发挥较好的抗肿瘤作用，在细胞水平的有效浓度为纳摩尔级，在多种荷瘤小鼠模型中的有效剂量甚至可低至小于1毫克/千克级；
[0047][0048]
式(1)中，r1和r
4-r9分别为h、oh、nh2、ch2oh、ch2nh2、ome、oc2h5、ocf3、f、cl、br、i中的一种，r2和r3分别为h、oh、nh2、ch2oh、ch2nh2、ome、oc2h5、ocf3、f、cl、br、i中的一种，但当r1＝r5＝r9＝h，r2＝r3＝r4＝r6＝ome，r7＝oh时，r8不为h；当r1＝r2＝r5＝r9＝h，r3＝r4＝r6＝ome，r7＝oh时，r8不为h。
[0049]
在一些实施方案中，式(1)中，r1＝r5＝r9＝h，r2、r3、r4与r6分别为ome、oc2h5、ocf3中的一种，r7为oh、ch2oh、nh2、ch2nh2中的一种，r8为ome、oc2h5、ocf3、br、cl、f或i中的一种，所得多芳乙烯β-二酮类化合物表现出较强的放疗增敏活性；在其中一些优选实施方案中，
式(1)中，r1＝r5＝r9＝h，r2＝r3＝r4＝r6＝ome，r7为oh；r8为ome、br中的一种。
[0050]
在一些实施方案中，式(1)中，r1＝r5＝r6＝r9＝h，r2、r3、r4与r7分别为ome、oc2h5、ocf3中的一种，r8为oh、ch2oh、nh2、ch2nh2中的一种，所得多芳乙烯β-二酮类化合物表现出较强的放疗增敏活性；在其中一些优选实施方案中，式(1)中，r1＝r5＝r6＝r9＝h，r2＝r3＝r4＝r7＝ome，r8为oh。
[0051]
在一些实施方案中，式(1)中，r3＝r4＝r6＝r8＝h，r1、r2、r5、r7与r9分别ome、oc2h5、ocf3中的一种，所得多芳乙烯β-二酮类化合物表现出较强的放疗增敏活性；在其中一些优选实施方案中，式(1)中，r3＝r4＝r6＝r8＝h，r1＝r2＝r5＝r7＝r9＝ome。
[0052]
在一些实施方案中，式(1)中，r3＝r4＝r5＝r6＝r9＝h，r1、r2、r7与r8分别为ome、oc2h5、ocf3中的一种，所得多芳乙烯β-二酮类化合物表现出较强的放疗增敏活性。
[0053]
在一些实施方案中，式(1)中，r1＝r4＝r5＝r9＝h，r2与r3分别为oh、ome、oc2h5、ocf3中的一种，r6为h、f、cl、br、i、oh、ome、oc2h5、ocf3中的一种，r7为oh、ome、ch2oh、nh2、ch2nh2中的一种，r8为h、ome、ocf3、oc2h5、br、cl、f、i中的一种，所得多芳乙烯β-二酮类化合物表现出较强的放疗增敏活性；在其中一些优选实施方案中，式(1)中，r1＝r4＝r5＝r9＝h，r2和r3分别为ome或oh，r6为h、f、br、oh、ome中的一种，r7为oh或ome，r8为h、ome、oc2h5、br中的一种。
[0054]
在一些实施方案中，式(1)中，r1＝r4＝r6＝r8＝h，r2与r3分别为ome、oc2h5、ocf3中的一种，r5、r7与r9分别为ome、oc2h5、ocf3中的一种。在其中一些优选实施方案中，式(1)中，r1＝r4＝r6＝r8＝h，r2＝r3＝r5＝r7＝r9＝ome，所得多芳乙烯β-二酮类化合物表现出较强的放疗增敏活性。
[0055]
在一些实施方案中，式(1)中，r1＝r4＝r5＝r9＝h，r2和r3连接成为-och2o-，r6为f、cl、br、i、ome、oc2h5、ocf3中的一种，r7为oh、ch2oh、nh2、ch2nh2中的一种，r8为h、ome、oc2h5、ocf3、br、cl、f、i中的一种，所得多芳乙烯β-二酮类化合物表现出较强的放疗增敏活性；在其中一些优选实施方案中，式(1)中，式(1)中，r1＝r4＝r5＝r9＝h，r2和r3连接成为-och2o-，r6为f、br或ome，r7为oh，r8为h、ome、br中的一种。
[0056]
在一些实施方案中，式(1)中，r1＝r5＝r9＝h，r2＝r6＝ome，r7＝oh；当r3＝r4＝ome时，r8为f、cl、i中的一种；当r3和r4连接成为-och2o-时，r8为f、cl、br、i中的一种，这些多芳乙烯β-二酮类化合物均是我们新设计的化合物，表现出较强的放疗增敏活性。
[0057]
在一些实施方案中，多芳乙烯β-二酮类化合物为以下结构式所示化合物中的一种：
[0058][0059]
相较于其它多芳乙烯β-二酮类化合物，这22种化合物具有更优异的放疗增敏作用。其中，单独使用20nm pt33能使细胞集落生成率减少1％，单独使用4gy能使细胞集落生成率减少77％，二者联用能使细胞集落生成率减少91％，相比单独使用20nm pt33(1％)效果与4gy辐射剂量(77％)效果之和进一步减少13％左右，相比单独4gy辐射剂量(77％)作用下细胞集落生成率进一步减少61％左右，这表明pt33活性显著高于t83。
[0060]
本发明所述放射性治疗药物包括但不限于肿瘤放疗增敏药物。相较于常氧环境，本发明的多芳乙烯β-二酮类化合物对低氧环境(如，5v/v％o2)肿瘤细胞显示出更强的增敏效应，可作为乏氧肿瘤细胞放疗增敏剂，提高放疗效果。
[0061]
本发明中涉及的多芳乙烯β-二酮类化合物可以以药物组合物的形式存在，所述组合物含有治疗有效量的多芳乙烯β-二酮类化合物以及药学上可接受的载体。
[0062]
本发明所述“药学上可接受的载体”表示任何药学上可接受的物质，其可以是液体或固体，比如氯化钠、甘油、葡萄糖、聚乙二醇、丙二醇、d-甘露糖醇、果糖、木糖醇、磷酸二氢钠、磷酸钠等。
[0063]
本发明所述“治疗有效量”是指能够有效抑制所治疗个体的已有症状发展或减轻已有症状的量。应当理解，治疗过程中所需本发明多芳乙烯β-二酮类化合物的剂量将随所治疗病症的性质、年龄和身体状况而变。
[0064]
本发明的放疗增敏药物可以是液体，除了上述多芳乙烯β-二酮类化合物之外，本发明的放疗增敏药物还可包括生理盐水、磷酸缓冲液(例如，氯化钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠等)。
[0065]
本发明对于放疗增敏剂的使用方法不存在特别限制。例如，当本发明的放疗增敏药物是注射剂形态时，在放射治疗时可使用注射器将所述放疗增敏药物注射至目标肿瘤区域内。
[0066]
本发明提供的多芳乙烯β-二酮类化合物对于肿瘤细胞的放疗增敏作用，具有普适性，并不仅限于某种特定的肿瘤细胞，本发明所述肿瘤包括但不限于：
[0067]
生殖系统肿瘤：包括不限于宫颈癌、子宫内膜上皮癌、会阴癌、卵巢癌，前列腺癌和阴茎癌；
[0068]
消化系统肿瘤：包括不限于食管癌、胃癌、肝癌、结直肠癌和胰腺癌；
[0069]
呼吸系统肿瘤：包括不限于鼻咽癌、下咽癌、喉癌和肺癌；
[0070]
神经系统肿瘤：包括不限于星形胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤和神经纤维瘤；
[0071]
泌尿系统肿瘤：包括但不限于肾细胞癌、肾透明细胞癌、肾母细胞瘤、膀胱癌和尿道癌；
[0072]
皮肤癌：包括不限于皮肤基底细胞癌、皮肤鳞癌和黑色素瘤；
[0073]
骨与软组织肉瘤：骨肉瘤和软组织肉瘤；
[0074]
乳腺癌、甲状腺癌与垂体瘤。
[0075]
实施例1多芳乙烯β-二酮类化合物pt33-f、pt33-cl、pt33-i、ptdo-f、ptdo-cl、ptdo-br、ptdo-i的合成及结构表征
[0076]
多芳乙烯β-二酮类化合物pt33-f、pt33-cl、pt33-i、ptdo-f、ptdo-cl、ptdo-br、ptdo-i的合成按如下反应式进行：
[0077][0078]
具体为：在100ml圆底烧瓶中，将硼酐(0.35g,5mmol,1.0eq)、乙酰丙酮(1g,10mmol,2eq)溶于10ml乙酸乙酯，70℃反应3h。抽滤除去溶剂，环己烷清洗两次，得白色固体。在100ml圆底烧瓶中，将白色固体、相应的芳香醛i(20mmol,4eq)、硼酸三正丁酯(4.60g，20mmol,4.0eq)溶于20ml乙酸乙酯，70℃搅拌30min。正丁胺(73mg，1mmol,0.2eq)用5ml乙酸乙酯稀释，加入滴液漏斗缓慢滴加到反应液中，升温到85℃，继续反应24h。冷却到60℃，加入1n hcl调节ph约5，60℃搅拌继续反应30min。分液得有机层，乙酸乙酯萃取水层，合并有机层，再用水洗两遍，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗品，用柱层析分离得到中间体ii。
[0079]
将中间体ii(1mmol,1.0eq)和相应芳香醛iii(2mmol,2.0eq)溶于25ml甲苯，再加入哌啶(4.0mg,0.05mmol,0.05eq)和乙酸(4.8mg,0.08mmol,0.08eq)做催化剂。140℃搅拌过夜，用分水器分离反应过程中产生的水。tlc检测反应完全，反应液用水洗2次，除去哌啶和乙酸，减压浓缩得到粗品，用柱层析分离得到各终产物。
[0080]
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3h),3.87(s,3h),3.86(s,3h),3.85(s,6h)；hrms calcd for c
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31h25o10
f[m h]

:637.0704,found 637.0672.
[0086]
ptdoi:黄色固体，产率25％；hplc tr＝30.95min；1h nmr(400mhz,dmso),δ10.33(s,1h),7.99(s,1h),7.68(d,j＝15.4hz,1h),7.59(s,1h),7.55(d,j＝15.4hz,1h),7.41(d,j＝16.1hz,1h),7.29(s,1h),7.15(s,1h),7.10(s,2h),7.03(s,1h),6.99(d,j＝16.1hz,1h),6.09(s,2h),6.05(s,2h),3.89(s,3h),3.82(s,3h),3.73(s,3h)；hrms calcd for c
31h25o10
i[m h]

:685.0565,found 685.0578.
[0087]
实施例2式(1)所示化合物对代表性肿瘤细胞的放疗增敏活性
[0088]
选取各系统代表性肿瘤细胞株，含
①
生殖系统肿瘤包括宫颈癌(sw756)，子宫内膜上皮癌(ess-1)、卵巢癌(ovcar-5)和前列腺癌(pc-3)细胞株；
②
消化系统肿瘤包括胃癌(ags)、肝癌(huh-7)、结直肠癌(hct116)和胰腺癌(panc1)细胞株；
③
呼吸系统肿瘤包括鼻咽癌(cne2)、下咽癌(fadu)和肺癌(a549)细胞株；
④
神经系统肿瘤包括星形胶质细胞瘤(u87)、神经母细胞瘤(acn)和髓母细胞瘤(pfsk-1)细胞株；
⑤
泌尿系统肿瘤包括肾细胞癌(a704)和膀胱癌(t24)细胞株；
⑥
皮肤癌包括皮肤鳞癌(a431)和黑色素瘤(colo-829)细胞
株；
⑦
骨与软组织肉瘤包括骨肉瘤(u2os)和软组织肉瘤(ht-1080)细胞株；以及
⑧
乳腺癌细胞株(mcf-7)、甲状腺癌(htc-c3)与垂体瘤(rc-4bc)细胞株。将各细胞系生长期细胞以1000个细胞/孔的密度接种到6孔板中。24小时后，用6gy的x射线和/或50nm多芳乙烯β-二酮类化合物处理细胞，以不加化合物处理组为对照组，25μm的甘胺双唑钠(cmna)处理组作为参考组，然后培养48小时，cck8法检测各体系中肿瘤细胞的生长抑制情况。以放疗 化合物处理组各细胞死亡百分比/单独加化合物组细胞死亡百分比作为协同作用变化倍数(fc)，以不含化合物放疗组与不放疗组的各细胞死亡百分比值为单独放疗作用变化倍数(fc0)，以fc/fc0为化合物增敏比，结果见表1。
[0089]
表1各化合物在不同细胞株中与放疗联用时的增敏比(fc/fc0)
[0090][0091][0092]
由表1可见，在存在50nm各代表性分子化合物的情况下，用6gy x射线处理引发的细胞死亡率增敏比(fc/fc0)达到2.06～6.97，其中pt33-f、pt33-cl、pt33-i、ptdo-f、ptdo-cl、ptdo-br、ptdo-i、pt5、pt6、pt11、pt12、pt14、pt33、pt34、pt35、pt41、pt43、pt61、pt62、pt66、pt67以及pt68的放疗增敏效果也显著优于同浓度下的t83(fc/fc0为1.13～1.84之间)；而我们早期报道的另个分子t63，在100nm浓度下，其fc/fc0为1.00～1.49之间，显著低于pt33-f、pt33-cl、pt33-i、ptdo-f、ptdo-cl、ptdo-br、ptdo-i、pt5、pt6、pt11、pt12、pt14、pt33、pt34、pt35、pt41、pt43、pt61、pt62、pt66、pt67以及pt68的放疗增敏效果；另外，临床药物甘胺双唑钠(cmna)，虽然被报道具有放疗增敏作用，但在本实验条件下，没有体现出活性，表明本发明中所述分子，活性远高于甘胺双唑钠。
[0093]
实施例3pt33在不同肿瘤细胞模型中的增敏活性
[0094]
使用平板克隆实验表征放射治疗与药物联用对细胞克隆形成的影响。将hct116和sw837细胞以1000个细胞/孔的密度接种到6孔板中，分别在常氧与乏氧状态下(5v/v％o2)培养。24小时后，用指定剂量的x射线和/或不同浓度的药物处理细胞，然后培养10-14天，然后用甲醇固定，0.5％结晶紫染色。对含有50个以上细胞的集落进行计数，化合物的增敏能力以联用前后细胞克隆形成减少的倍数fc表示，结果如图1所示。
[0095]
图1结果表明，pt33可有效增强多种肿瘤细胞株的放疗效果，且在低氧条件下，其
增敏活性进一步增强。
[0096]
实施例4pt33在乏氧条件下的放疗增敏活性
[0097]
使用平板克隆实验表征放射治疗与药物联用对细胞克隆形成的影响。将hct116和sw837细胞以1000个细胞/孔的密度接种到6孔板中，在乏氧状态下(5v/v％o2)培养。24小时后，用指定剂量的x射线和/或药物(pt33或btz)处理细胞，然后培养10-14天，然后用甲醇固定，0.5％结晶紫染色。对含有50个以上细胞的集落进行计数，化合物的增敏能力以联用前后细胞克隆形成数，结果如图2所示。
[0098]
代表性多芳乙烯β-二酮类化合物pt33可在乏氧条件下，可有效增强肿瘤细胞株的放疗效果；另外，临床使用的蛋白酶体抑制剂btz虽然也可产生增敏效果，但其在低氧条件下，活性显著低于pt33。由此可见，本发明所提供的多芳乙烯β-二酮类化合物，在纳摩尔级低浓度下即可有效增强肿瘤细胞株的放疗效果，特别是对肿瘤缺氧细胞有更强的放疗增敏效应。
[0099]
实施例5pt33对肿瘤细胞的协同放疗增敏作用
[0100]
采用hct116细胞增殖实验模型，使用cck-8检测法分析放射治疗与药物联用对细胞增殖抑制的效应。将hct116细胞(1500个/孔)在96个孔板中培养24小时，然后用放疗x射线和/或pt33处理后继续培养72小时。细胞活力用cck-8试剂盒通过od450 nm测定。用chou-talalay法评价放射x线与药物联合应用的疗效。用于计算联合指数(combination index,ci)，ci＝c/cx d/dx c
×
d/cx
×
dx(c和d分别代表联用时达到某抑制效果时所用药物的浓度和放射的剂量，cx和dx分别代表达到同等抑制效果时单独所用药物的浓度或放射的剂量)。当ci《1说明两药联合表现出协同作用；当ci＝1说明两药联合表现出相加作用；当ci》1说明两药联合表现为拮抗作用。图3结果说明pt33与放疗联用对肿瘤细胞具有显著的协同效应。
[0101]
实施例6pt33对小鼠下咽癌移植肿瘤的放疗的影响
[0102]
用雌性balb/c裸鼠(4-5周龄，15-18g)将fadu(下咽癌)细胞移植瘤块(约5mm3)皮下种植到裸鼠右侧，建立异种移植模型。当异种移植物体积达到150mm3左右，用指定浓度的pt33(总量为1.75mg/kg/只，分7次腹腔注射给药)和放疗x射线(总剂量为14gy)交替治疗小鼠14天(第7天到第20天)。放射治疗时，除异种移植物区域以外，均采用铅板覆盖。每隔7天监测异种移植瘤生长情况，肿瘤体积的计算公式如下：肿瘤体积＝0.52
×
宽度2×
长度。治疗4周后处死，取出肿瘤并进行分析。结果如图4所示。
[0103]
图4结果证明，在放射处理后，pt33与放疗联合组肿瘤体积较生理盐水与放疗联合组显著减少，在治疗后一周即出现差异，随后pt33与放疗联合组和ns-x射线联合组体积差异逐渐增大，说明pt33在极低剂量下即可在动物模型上显著增强移植瘤的放疗效果，有效解决了现有大多数放疗增敏剂存在活性低，使用剂量大的问题。
[0104]
实施例7pt33对小鼠结直肠癌移植肿瘤的放疗的影响
[0105]
用雌性balb/c裸鼠(4-5周龄，15-18g)将hct116(结直肠癌)细胞移植瘤块(约5mm3)皮下种植到裸鼠右侧，建立异种移植模型。当异种移植物体积达到150mm3左右，用指定浓度的pt33(0.10mg/kg/次，共7次腹腔注射给药)和放疗x射线(总剂量为14gy)交替治疗小鼠14天(第7天到第20天)。放射治疗时，除异种移植物区域以外，均采用铅板覆盖。每隔7天监测异种移植瘤生长情况，肿瘤体积的计算公式如下：肿瘤体积＝0.52
×
宽度2×
长度。治
疗5周后处死，取出肿瘤并进行分析。结果如图5所示。
[0106]
图5结果证明，在放射处理后，pt33与放疗联合组肿瘤体积较生理盐水与放疗联合组显著减少，在治疗后一周即出现差异，随后pt33与放疗联合组和ns-x射线联合组体积差异逐渐增大，说明pt33在极低剂量下即可在动物模型上显著增强移植瘤的放疗效果。
[0107]
实施例8pt33增强放疗后dna损伤
[0108]
肿瘤细胞(3000个/孔)铺板培养24小时后，用pt33(ht-29:25nm；hct116:10nm)处理12小时，然后用x射线照射肿瘤细胞(ht-29:12gy；hct116:6gy)。6小时后，用胰蛋白酶消化，用dna彗星测试试剂盒检测dna拖尾情况，利用casp软件计算彗尾长度。彗尾长度的增加表示dna损伤程度增加。结果如图6所示。
[0109]
图6显示放射治疗后会造成核dna损伤；pt33加入后，可明显扩大放射所致的损伤效应。
[0110]
实施例9pt33明显延长dna修复的完成时间
[0111]
hct116肿瘤细胞(3000个/孔)铺板培养24小时，用pt33(10nm)处理12小时后，x射线照射肿瘤细胞(6gy)，不同时间后，用蛋白免疫印迹(wb)观察γ-h2ax的含量变化。结果如图7所示。
[0112]
由图7可知，pt33处理组明显延长了γ-h2ax的消失时间。由于γ-h2ax是dna双链断裂(dsb)修复起始的关键标志物，这一结果表明，pt33明显延长了dna修复的完成时间，阻断了修复进程。
[0113]
实施例10pt33明显延长γ-h2ax在dna的dsb位点聚集停留时间
[0114]
hct116肿瘤细胞实施如实施例8同样处理，在设定的时间后，用相应抗体进行免疫荧光(if)显色，结果见图8。
[0115]
图8显示，放射治疗后会γ-h2ax与dsb位点共定位在6小时左右存在，但12小时后，已经不能明显地观察到γ-h2ax及其与dsb位点的共定位情况，说明γ-h2ax招募修复因子的功能在这一时间段内完成；然而，pt33加入后，24小时后，仍然可以观察到γ-h2ax及其与的共定位。由于γ-h2ax是dna dsb修复起始的关键标志物，它在dsb位点的停留时间可以直接反映修复进程，这一结果表明pt33显著延长了γ-h2ax在dsb位点聚集停留时间，说明pt33抑制了dna修复过程。
[0116]
实施例11pt33阻断dna同源重组修复酶rad51的入核，阻断dna修复
[0117]
hct116肿瘤细胞实施如实施例8同样处理，在设定的时间后，用rad51抗体进行免疫荧光显色，观察rad51的入核情况，结果见图9。
[0118]
图9显示，在不加pt33的细胞中，rad51在细胞核内外均有分布，而加入pt33处理6小时后，核内rad51含量显著减少。由于rad51是同源重组修复的关键重组酶，它在核内中的聚集分布依赖于上游dna损伤修复信号的传递，在下游端也能说明同源重组修复的正常进行，这一结果说明，放射治疗后会使rad51被招募到dsb位点进行重组修复；但是pt33加入后，可明显阻断rad51入核，说明pt33抑制了rad51被招募的信号传递。
[0119]
实施例12pt33对放疗作用下sting免疫通路的协同激活作用
[0120]
肿瘤细胞(10000个/孔)铺板培养24小时，然后设置x射线治疗组(4gy每隔24小时照射一次，共三次，每次4分钟)、不同浓度pt33处理组以及联合治疗组，其中pt33提前给药处理12小时。最后一次照射24小时后，用qpcr检测干扰素β1的表达情况。
[0121]
结果见图10，放射治疗后会造成肾癌renca(图10上部分图，各试验组左柱状图对应ifnβ1，右柱状图对应ip10)以及结肠癌ct26(图10下部分图)中dna的损伤，并轻微激活renca与ct26细胞中sting介导的ifnβ1以及其下游因子ip10的表达。而联用pt33时，两株细胞中ifnβ1以及其下游因子ip10的表达显著增强。在renca细胞中，我们观察到明确的浓度依赖性，当放疗与pt33(250nm)联用后ifnβ1及ip10的表达分别增长58及40倍左右；在ct26细胞中，但当放疗与pt33(250nm)联用后，ifnβ1及ip10的表达分别增长50及38倍左右。这一结果表明，在放疗条件下，sting通路也可以被激活，同时被pt33进一步增强。表明，pt33可在放疗条件下提升ifnβ1及其下游因子ip10的表达，表现出优良的协同促进sting效应通路的能力。为了进一步证明pt33的活性与sting有关，我们将ct26肿瘤细胞中sting敲除后，进行类似测试，结果发现在sting被敲除的情况下，pt33的活性增强效应消失(图10下部分图)，这表明pt33稳定并增强sting效应通路的活性是sting依赖的。
[0122]
实施例13pt33的体内半衰期测试
[0123]
用雄性sd大鼠，每组三织，分别尾静脉注射2mg/kg剂量的pt33以及前期已报道分子t83，分别按不同时间取血样，用lc-ms检测血液中化合物的含量，并计算其清除半衰期(t
1/2
)。发现pt33的t
1/2
为11.9小时，远高于t83的t
1/2
(2.4小时)，表明pt33比t83具有更优良的体内代谢稳定性。
[0124]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。