生产毛喉素的重组酿酒酵母菌及构建方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及生产毛喉素的重组酿酒酵母菌及构建方法及用途。


背景技术：

2.毛喉素(forskolin)，一种半日花烷型的杂环二萜类天然产物，存在于毛喉鞘蕊花coleus forskohlii的根软木组织中。由于毛喉素作为腺苷酸环化酶的激活剂，提高了细胞内环磷酸腺苷(camp)的浓度，所以毛喉素目前已经被研究发现的医药应用价值有：缓解青光眼、治疗哮喘、抗肿瘤、抗hiv、治疗心力衰竭及降压、减肥的功效等。由于植物原材料有限，毛喉素的生产显得供不应求，而毛喉素的化学合成过程步骤繁琐，且对环境不友好。
3.随着合成生物学的发展，以分子生物学为手段，对基因进行改造，构建外源代谢途径或调节内源途径，以廉价的碳源作为底物，通过大规模发酵生产萜类化合物，既避免了植物提取法对资源的浪费，又避免了化学合成法复杂的工序，减少了对环境的危害等问题。因此，利用合成生物学方法来生产萜类化合物越来越重要。目前，利用合成生物学方法，通过分子生物学手段，基因改造微生物可以实现目标产物的有效积累，但从系统代谢角度进行毛喉素生物合成路径优化来生产毛喉素还未见报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种生产毛喉素的重组酿酒酵母菌。
5.本发明的第二个目的是提供一种生产毛喉素的重组酿酒酵母菌的构建方法。
6.本发明的第三个目的是提供一种生产毛喉素的重组酿酒酵母菌发酵生产毛喉素的用途。
7.本发明的技术方案概述如下：
8.生产毛喉素的重组酿酒酵母菌的构建方法，包括如下步骤：
9.(1)向酿酒酵母中导入含有优化的泪柏醚合酶编码基因tcftps2和优化的泪柏醚合酶编码基因tcftps3的表达盒，得到重组菌1；
10.所述优化的泪柏醚合酶编码基因tcftps2的核苷酸序列如seq id no.1所示；
11.所述优化的泪柏醚合酶编码基因tcftps3的核苷酸序列如seq id no.2所示；
12.(2)向重组菌1中导入截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶编码基因thmg1、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因bts1和法呢基焦磷酸合酶编码突变基因erg20
f96c
表达盒，得到重组菌2；
13.所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶编码基因thmg1的核苷酸序列如seq id no.3所示；
14.所述牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因bts1的核苷酸序列如seq id no.4所示；
15.所述法呢基焦磷酸合酶编码突变基因erg20
f96c
的核苷酸序列如seq id no.5所
示；
16.(3)向重组菌2中导入含有优化的细胞色素p450酶编码基因cfcyp76ah15、优化的细胞色素p450酶编码基因cfcyp76ah11、优化的细胞色素p450酶编码基因cfcyp76ah16，优化的细胞色素p450还原酶编码基因cfcpr和优化的乙酰基转移酶编码基因cfact1-8的表达盒，得到重组菌3；
17.所述优化的细胞色素p450酶编码基因cfcyp76ah15的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述优化的细胞色素p450酶编码基因cfcyp76ah11的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述优化的细胞色素p450酶编码基因cfcyp76ah16的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述优化的细胞色素p450还原酶编码基因cfcpr的核苷酸序列如seq id no.9所示；所述优化的乙酰基转移酶编码基因cfact1-8的核苷酸序列如seq id no.10所示；
18.(4)向重组菌3中导入含优化的泪柏醚合酶编码基因tcftps2、优化的泪柏醚合酶编码基因tcftps3、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶编码基因thmg1、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因bts1和法呢基焦磷酸合酶编码突变基因erg20
f96c
的表达盒得到重组菌4；
19.(5)向重组菌4中导入含有cfcyp76ah15～t66cpr～t30cyb5、fcyp76ah11～t66cpr～t30cyb5、cfcyp76ah16～t66cpr～t30cyb5和cfact1-8表达盒，得到重组菌5；
20.所述t66cpr是cfcpr从n端截短了60个氨基酸后获得；
21.所述t30cyb5是细胞色素cyb5从c端截短了30个氨基酸后获得，细胞色素cyb5的核苷酸序列如seq id no.11所示；
22.(6)向重组菌5中导入内质网调控因子ino2表达盒，得到重组菌6；
23.所述内质网调控因子ino2的核苷酸序列如seq id no.12所示；
24.(7)向重组菌6中导入含有6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因zwf1，磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因gnd1，乙醛脱氢酶编码基因ald6和乙酰辅酶a合酶编码基因acs的表达盒，得到重组菌7；
25.所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因zwf1的核苷酸序列如seq id no.13所示；所述磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因gnd1的核苷酸序列如seq id no.14所示；所述乙醛脱氢酶编码基因ald6的核苷酸序列如seq id no.15所示；所述乙酰辅酶a合酶编码基因acs的核苷酸序列如seq id no.16所示。
26.酿酒酵母优选酿酒酵母saccharomyces cerevisiae w303-1a。
27.上述方法构建的生产毛喉素的重组酿酒酵母菌。
28.上述重组酿酒酵母菌发酵生产毛喉素的用途。
29.实验证明，本发明的生产毛喉素的重组酿酒酵母，发酵使得毛喉素摇瓶产量达到18.37mg/l以上，为人工合成毛喉素奠定了基础。
附图说明
30.图1为毛喉素hplc-ms检测图，其中a是液相图，b为质谱图。
具体实施方式
31.下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
32.下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
33.本发明所用的酿酒酵母saccharomyces cerevisiae w303-1a(atcc：208352)(购买时间，2016.6，网址：https://www.atcc.org/)为出发菌株。
34.酿酒酵母的公开是为了使本领域技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限定。其它酿酒酵母也可以用于本发明。
35.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
36.实施例1、重组酿酒酵母菌1(重组菌1)的构建
37.向酿酒酵母w303-1a中导入含有优化的泪柏醚合酶编码基因tcftps2和优化的泪柏醚合酶编码基因tcftps3的表达盒，得到重组菌1；
38.(1)模块构建
39.泪柏醚合酶编码基因tcftps2和泪柏醚合酶编码基因tcftps3均来源于毛喉鞘蕊花(coleus forskohlii)，针对酿酒酵母进行密码子优化，由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成。得到优化的泪柏醚合酶编码基因tcftps2(seq id no.1)和优化的泪柏醚合酶编码基因tcftps3(seq id no.2)连接在大肠杆菌质粒puc18(商业化质粒)上。
40.利用表1引物对及模板分别pcr扩增hol，p
tef1
，tcftps2，t
adh1
，p
tdh3
，tcftps3，t
tdh2
，ura3，hor片段；将片段hol，tcftps2，p
tef1
，t
adh1
，p
tdh3
片段融合，得到模块hol-p
tef1-tcftps2-t
adh1-p
tdh3
；将片段tcftps3，t
tdh2
，ura3，hor片段融合，得到模块tcftps3-t
tdh2-ura3-hor。
41.表1重组菌pcr扩增片段
[0042][0043]
[0044]
(2)酿酒酵母感受态制备
[0045]
将酿酒酵母saccharomyces cerevisiae w303-1a的单菌落接种于3ml ypd液体培养基中，在30℃，220rpm的摇床中培养12h；将培养的酵母种子液转接到新的3ml ypd液体培养基中，30℃，在220rpm的转速下培养5h；取1ml菌液于提前灭过菌的2ml离心管中，4000rpm离心机离心3min，弃上清，收集菌体；1ml无菌水洗涤一次，4000rpm离心机离心3min，弃上清，收集菌体。然后将1ml 100mm liac水溶液加入菌体中混匀，室温静置5min。将静置结束后的细胞4000rpm离心3min，用移液枪除去liac液体。将鲑鱼精dna(市售，solarbio，10mg/ml)进行开水煮沸5min，然后快速放入准备好的冰上冷却。
[0046]
(3)酿酒酵母转化
[0047]
a依次向菌体沉淀离心管中加入120μl peg3350(50g peg3350/100ml水)、18μl 1.0m liac水溶液、将开水煮沸后冷却的5μl鲑鱼精dna、17μl hol-p
tef1-tcftps2-t
adh1-p
tdh3
片段和20μl tcftps3-t
tdh2-ura3-hor片段，体系共180μl。
[0048]
b然后温和地用移液枪吹打1min，使其混匀；将上述混匀的离心管放置42℃水浴锅热激30min后，4000rpm离心机离心3min，除去上清；继续加入干净的1ml ypd液体培养基，30℃，220rpm摇床进行复苏培养2h；将复苏好的离心管在4000rpm转速下离心3min，弃去上层培养基，再用1ml无菌水洗涤两次；最后向含有菌体的离心管中加入200μl的无菌水并混匀，涂布于缺尿嘧啶的sc选择性固体培养基平板上，放置于30℃恒温培养箱中培养2天，待单菌落长出。挑取转化子过夜培养，提基因组，并pcr验证，得到正确目的片段的为正确克隆，命名为重组酿酒酵母菌1，简称重组菌1。
[0049]
实施例2、重组酿酒酵母菌2(重组菌2)的构建
[0050]
向重组菌1中导入截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶编码基因thmg1(seq id no.3)、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因bts1(seq id no.4)和法呢基焦磷酸合酶编码突变基因erg20
f96c
(seq id no.5)表达盒，得到重组菌2，
[0051]
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶编码基因thmg1(酿酒酵母saccharomyces cerevisiae)；
[0052]
牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因bts1来源(酿酒酵母saccharomyces cerevisiae)；
[0053]
法呢基焦磷酸合酶编码突变基因erg20
f96c
的原始基因来源(酿酒酵母saccharomyces cerevisiae))。
[0054]
(1)模块构建
[0055]
利用表2引物对及模板分别pcr扩增lpp1up，p
pgk1
，thmg1，t
pgk1
，p
tdh3
，bts1，erg20(f96c)up，erg20(f96c)-t
erg20
，his3，lpp1down；
[0056]
将片段lpp1up、p
pgk1
、thmg1、t
pgk1
、p
tdh3
融合获得lpp1up-p
pgk1-thmg1-t
pgk1-p
tdh3
，将片段bts1、erg20(f96c)up、erg20(f96c)-t
erg20
融合获得bts1～erg20
f96c-t
erg20
，将片段his3，lpp1down融合获得his3-lpp1down。erg20(f96c)up与erg20(f96c)融合后变成erg20
f96c
)
[0057]
表2重组菌pcr扩增片段
[0058][0059]
(2)重组菌1酿酒酵母感受态制备
[0060]
按照实施例1中步骤(2)的方法制备重组菌1酿酒酵母感受态细胞。
[0061]
(3)酿酒酵母转化
[0062]
a依次向重组菌1感受态细胞中加入120μl peg3350(50g peg3350/100ml水)、18μl 1.0m liac水溶液、将开水煮沸后冷却的5μl鲑鱼精dna、18μllpp1up-p
pgk1-thmg1-t
pgk1-p
tdh3
片段和10μl bts1～erg20
f96c-t
erg20
，9μlhis3-lpp1down片段，体系共180μl。
[0063]
b同实施例1中步骤(3)中的b相同，但是重组菌涂布于缺组氨酸的sc选择性固体培养基平板上，筛选正确的克隆命名为重组酿酒酵母菌2(重组菌2)。
[0064]
实施例3、重组酿酒酵母菌3(重组菌3)的构建
[0065]
向重组菌2中导入含有优化的细胞色素p450酶编码基因cfcyp76ah15(seq id no.6)、优化的细胞色素p450酶编码基因cfcyp76ah11(seq id no.7)、优化的细胞色素p450酶编码基因cfcyp76ah16(seq id no.8)，优化的细胞色素p450还原酶编码基因cfcpr(seq id no.9)和优化的乙酰基转移酶编码基因cfact1-8(seq id no.10)的表达盒，得到重组菌3；
[0066]
细胞色素p450酶编码基因cfcyp76ah15(毛喉鞘蕊花(coleus forskohlii))
[0067]
细胞色素p450酶编码基因cfcyp76ah11(毛喉鞘蕊花(coleus forskohlii))
[0068]
细胞色素p450酶编码基因cfcyp76ah16(毛喉鞘蕊花(coleus forskohlii))
[0069]
细胞色素p450还原酶编码基因cfcpr(毛喉鞘蕊花(coleus forskohlii))
[0070]
乙酰基转移酶编码基因cfact1-8(毛喉鞘蕊花(coleus forskohlii))
[0071]
(1)模块构建
[0072]
优化的毛喉素合成相关的p450酶编码基因cfcyp76ah15、cfcyp76ah11、cfcyp76ah16、细胞色素p450还原酶编码基因cfcpr和乙酰基转移酶cfact1-8均来源于毛喉鞘蕊花(coleus forskohlii)，均由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成，针对酿酒酵母进行密码子优化，并连接在大肠杆菌质粒puc18上，保存在大肠杆菌中。
[0073]
利用表3引物对及模板分别pcr扩增dppa，p
tef2
，cfcpr，t
adh2
，p
tef1
，cfcyp76ah15，t
pgk1
，p
pgk1
，cfcyp76ah11，t
adh1
，p
tdh3
，cfcyp76ah16，t
cyc1
，p
fba1
，cfact1-8，t
tdh2
，trp1，dppdown片段，将dppa，p
tef2
，cfcpr，t
adh2
片段融合，得到模块dppa-p
tef2-cfcpr-t
adh2
；将p
tef1
，cfcyp76ah15，t
pgk1
，p
pgk1
片段融合，得到模块p
tef1-cfcyp76ah15-t
pgk1-p
pgk1
；将cfcyp76ah11，t
adh1
，p
tdh3
片段融合，得到模块cfcyp76ah11-t
adh1-p
tdh3
；将cfcyp76ah16，t
cyc1
，p
fba1
，cfact1-8片段融合，得到模块cfcyp76ah16-t
cyc1-p
fba1-cfact1-8；将t
tdh2
，trp1，dppdown片段融合，得到模块t
tdh2-trp1-dppdown。
[0074]
表3重组菌pcr扩增片段
[0075]
[0076][0077]
(2)重组菌2酿酒酵母感受态制备
[0078]
按照实施例1中步骤(2)的方法制备重组菌2酿酒酵母感受态细胞。
[0079]
(3)酿酒酵母转化
[0080]
a依次向重组菌2感受态细胞中加入120μl peg3350(50g peg3350/100ml水)、18μl 1.0m liac水溶液、将开水煮沸后冷却的5μl鲑鱼精dna、8μl dppa-p
tef2-cfcpr-t
adh2
片段、8μl p
tef1-cfcyp76ah15-t
pgk1-p
pgk1
片段、8μl cfcyp76ah11-t
adh1-p
tdh3
片段、6μl cfcyp76ah16-t
cyc1-p
fba1-cfact1-8片段和7μl t
tdh2-trp1-dppdown片段，体系共180μl。
[0081]
b同实施例1中步骤(3)中的b，但是重组菌涂布于缺色氨酸的sc选择性固体培养基平板上，筛选正确的克隆命名为重组酿酒酵母菌3(重组菌3)。
[0082]
实施例4、重组酿酒酵母菌4(重组菌4)的构建
[0083]
向重组菌3中导入含优化的泪柏醚合酶编码基因tcftps2、优化的泪柏醚合酶编码基因tcftps3、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶编码基因thmg1、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因bts1和法呢基焦磷酸合酶编码突变基因erg20
f96c
表达盒得到重组菌4；
[0084]
(1)模块构建
[0085]
除左右同源臂，其他部分均参照实施例1和实施例2，本实施例使用的同源臂δ2，δ1
均来自酿酒酵母atcc208352基因组,筛选标记基因hygr(seq id no.17)由武汉金开瑞生物工程有限公司通过化学合成的方法合成，针对酿酒酵母酵母进行密码子优化，并连接在大肠杆菌质粒puc18上，保存在大肠杆菌中。
[0086]
利用表4中引物对及模板分别pcr扩增δ2，p
tef1-tcftps2-t
adh1-p
tdh3
，tcftps3，t
cyc1
，p
pgk1-thmg1-t
pgk1-p
tdh3
，bts1～erg20(f96c)-t
erg20
，hyg，δ1片段；
[0087]
将δ2，p
tef1-tcftps2-t
adh1-p
tdh3
片段融合，得到模块δ2-p
tef1-tcftps2-t
adh1-p
tdh3
；将tcftps3，t
cyc1
，p
pgk1-thmg1-t
pgk1-p
tdh3
片段融合，得到模块tcftps3-t
cyc1-p
pgk1-thmg1-t
pgk1-p
tdh3
；将hyg，δ1片段融合，得到模块hyg-δ1。
[0088]
表4重组菌pcr扩增片段
[0089][0090]
(2)重组菌3酿酒酵母感受态制备
[0091]
按照实施例1中步骤(2)的方法制备重组菌3酿酒酵母感受态细胞。
[0092]
(3)酿酒酵母转化
[0093]
a依次向重组菌3感受态细胞中加入120μl peg3350(50g peg3350/100ml水)、18μl 1.0m liac水溶液、将开水煮沸后冷却的5μl鲑鱼精dna、10μlδ2-p
tef1-tcftps2-t
adh1-p
tdh3
片段、10μl tcftps3-t
cyc1-p
pgk1-thmg1-t
pgk1-p
tdh3
片段、10μl bts1～erg20(f96c)-t
erg20
片段和7μl hyg-δ1片段，体系共180μl。
[0094]
b同实施例1中步骤(3)中的b，但是重组菌涂布于含有潮霉素的ypd培养基平板上，筛选正确的克隆命名为重组酿酒酵母菌4(重组菌4)。
[0095]
实施例5、重组酿酒酵母菌5(重组菌5)的构建
[0096]
向重组菌4中导入含有cfcyp76ah15～t66cpr～t30cyb5、cfcyp76ah11～t66cpr～t30cyb5、cfcyp76ah16～t66cpr～t30cyb5和cfact1-8表达盒，得到重组菌5；
[0097]
所述t66cpr是cfcpr从n端截短了60个氨基酸后获得；
[0098]
所述t30cyb5是细胞色素cyb5从c端截短了30个氨基酸后获得，细胞色素cyb5的核苷酸序列如seq id no.11所示；
[0099]
cfcyp76ah15人工合成、cfcyp76ah11人工合成、cfcyp76ah16人工合成、cfcpr人工合成、cfact1-8版段，人工合成。
[0100]
细胞色素cyb5基因的来源(原始来源，黄花蒿，artemisia annua)
[0101]
(1)模块构建
[0102]
利用表5中的引物对及模板分别pcr扩增片段rdna2，p
pgk1
，cfcyp76ah15，t66cpr，t30cyb5，融合片段获得模块rdna2-p
pgk1-cfcyp76ah15～t66cpr～t30cyb5；pcr扩增片段t
adh1
，p
tef1
，cfcyp76ah11，t66cpr，融合片段获得模块t
adh1-p
tef1-cfcyp76ah11～t66cpr；pcr扩增片段t30cyb5，t
adh2
，p
tdh3
，cfcyp76ah16，融合片段获得模块t30cyb5-t
adh2-p
tdh3-cfcyp76ah16；pcr扩增片段t66cpr～t30cyb5，t
pgk1
，p
tef2
，融合片段获得模块t66cpr～t30cyb5-t
pgk1-p
tef2
；pcr扩增片段cfact1-8，t
cyc1
，g418(人工合成seq id no.18)，rdna1，融合片段获得模块cfact1-8-t
cyc1-g418-rdna1。
[0103]
表5重组菌pcr扩增片段
[0104]
[0105][0106]
(2)重组菌4酿酒酵母感受态制备
[0107]
按照实施例1中步骤(2)的方法制备重组菌4酿酒酵母感受态细胞。
[0108]
(3)酿酒酵母转化
[0109]
a依次向重组菌4感受态细胞中加入120μl peg3350(50g peg3350/100ml水)、18μl 1.0m liac水溶液、将开水煮沸后冷却的5μl鲑鱼精dna、8μl rdna2-p
pgk1-cfcyp76ah15～t66cpr～t30cyb5片段、8μl t
adh1-p
tef1-cfcyp76ah11～t66cpr片段、7μl t30cyb5-t
adh2-p
tdh3-cfcyp76ah16片段、6μl t66cpr～t30cyb5-t
pgk1-p
tef2
片段和8μl cfact1-8-t
cyc1-g418-rdna1片段，体系共180μl。
[0110]
b同实施例1中步骤(3)中的b，但是重组菌涂布于含有g418的ypd培养基平板上，筛选正确的克隆命名为重组酿酒酵母菌5(重组菌5)。
[0111]
实施例6、重组酿酒酵母菌6(重组菌6)的构建
ald6-t
tdh2-p
pgk1
；pcr扩增zwf1，t
adh2
，p
tdh3
，gnd1片段，融合片段获得模块zwf1-t
adh2-p
tdh3-gnd1；pcr扩增t
adh1
，met17，trp1down片段，融合片段获得模块t
adh1-met17-trp1down。
[0127]
表7重组菌pcr扩增片段
[0128][0129][0130]
(2)重组菌6酿酒酵母感受态制备
[0131]
按照实施例1中步骤(2)的方法制备重组菌6酿酒酵母感受态细胞。
[0132]
(3)酿酒酵母转化
[0133]
a依次向重组菌6感受态细胞中加入120μl peg3350(50g peg3350/100ml水)、18μl 1.0m liac水溶液、将开水煮沸后冷却的5μl鲑鱼精dna、10μl trp1up-p
tef1-acs-t
cyc1
片段、9μl p
adh2-ald6-t
tdh2-p
pgk1
片段、9μl zwf1-t
adh2-p
tdh3-gnd1片段和9μl t
adh1-met17-trp1down
片段，体系共180μl。
[0134]
b同实施例1中步骤(3)中的b，但是重组菌涂布于缺甲硫氨酸的sc选择性固体培养基平板上，筛选正确的克隆命名为重组酿酒酵母菌7。
[0135]
实施例8、重组酿酒酵母菌发酵生成毛喉素
[0136]
(1)重组酿酒酵母菌培养及产物提取
[0137]
将实施例1-7分别得到的重组菌1-7，连同酿酒酵母saccharomyces cerevisiae w303-1a，在sc选择性固体培养基上活化；然后将各个重组菌接种到试管ypd液体培养基中，过夜培养，待od
600
长到约为4.0，接种到含30mlypd液体培养基的摇瓶中，使初始od
600
为0.1，30℃，220rpm发酵4d后，测毛喉素产量。
[0138]
毛喉素的提取方法为:
[0139]
细胞外的毛喉素提取，5ml发酵液和500μl正己烷混合，用涡旋振荡器振荡1h,然后12000g离心5min，收集正己烷层，烘干然后用甲醇复溶。
[0140]
胞内的毛喉素按照如下方式提取：将细胞与0.5ml正己烷及0.25ml直径为0.5mm的玻璃珠混合，涡旋震荡1h破碎细胞，然后12000g离心5min，收集正己烷，烘干然后用甲醇复溶。
[0141]
(2)毛喉素的hplc-ms检测
[0142]
毛喉素检测液质联用进行检测(hplc-ms)。在hypersil c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm；elite analytical instruments co.，ltd.，中国大连)
[0143]
毛喉素的hplc-ms检测方法为：乙腈-水(50：50，v/v)用作流动相。检测波长为210nm。ms操作条件如下：信号源类型，esi；离子极性，正；所有光谱都是在50/1300的m/z范围内获得的；干气流，8.0l/min；干燥温度250℃；雾化器压力为1.2bar；探头电压 4.5kv。
[0144]
(3)检测结果(各重组菌为胞内胞外总产物)
[0145]
a.酿酒酵母saccharomyces cerevisiae w303-1a没有检测到毛喉素；
[0146]
b.重组菌1：提取重组菌1的发酵产物，没有检测到毛喉素；
[0147]
c.重组菌2：提取重组菌2发酵产物，没有检测到毛喉素；
[0148]
d.重组菌3：提取重组菌3发酵产物，检测到毛喉素的含量为0.09mg/l；
[0149]
e.重组菌4：提取重组菌4发酵产物，检测到毛喉素的含量为1.73mg/l；
[0150]
f.重组菌5：提取重组菌5发酵产物，检测到毛喉素的含量为4.28mg/l；
[0151]
g.重组菌6：提取重组菌6发酵产物，检测到毛喉素的含量为11.12mg/l；
[0152]
h.重组菌7：提取重组菌7发酵产物，检测到毛喉素的含量为18.37mg/l。
[0153]
(4)实施例所用培养基
[0154]
ypd液体培养基：葡萄糖终浓度为20g/l，酵母浸粉终浓度为10g/l，蛋白胨终浓度为20g/l，以蒸馏水配制。ypd固体培养基则在ypd液体培养基中加20g/l的琼脂粉。
[0155]
sc选择性固体培养基：葡萄糖终浓度为2g/l，无氨基酵母氮源(ynb)终浓度为6.7g/l，氨基酸混合物终浓度为0.2g/l，20g/l的琼脂粉,以蒸馏水配制，缺失氨基酸混合物指去掉氨基酸混合物中的对应成份。
[0156]
氨基酸混合物：甘氨酸，2.0g；丙氨酸，2.0g；甲硫氨酸，2.0g；赖氨酸，2.0g；精氨酸，2.0g；丝氨酸，2.0g；天冬酰胺，2.0g；天冬氨酸，2.0g；苯丙氨酸，2.0g；半胱氨酸，2.0g；脯氨酸，2.0g；酪氨酸，2.0g；谷氨酸，2.0g；缬氨酸，2.0g；苏氨酸，2.0g；丝氨酸，2.0g；异亮
氨酸，2.0g；肌醇，2.0g；谷酰胺，2.0g；对氨基苯甲酸0.2g；腺嘌呤，0.5g；亮氨酸10g；甲硫氨酸，2g；色氨酸，2g；组氨酸，2g；尿嘧啶，2g。