分泌抗FGL1单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
1.本发明属于免疫化学、肿瘤生物学和细胞生物学技术领域，尤其涉及分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。


背景技术：

2.抑制受体（irs）的上调表达对于平衡共刺激受体活性和限制t细胞激活至关重要，可以防止自身免疫、自身炎症和组织损伤。然而，肿瘤可以劫持这些免疫检查点的作用，对cd4 和cd8 t细胞诱导的抗肿瘤免疫反应产生保护作用。最近的癌症免疫治疗方法通过靶向抑制受体来克服免疫耐受，重新激活细胞毒性t细胞对肿瘤的反应，从而逆转这种衰竭。
3.hepassocin，又称肝细胞源性纤维蛋白原相关蛋白1（hfrep-1）和纤维蛋白原样蛋白1（fgl1），是一种肝脏特异性分泌蛋白，是erep蛋白家族的一员，主要在肝脏中表达，并首次从人肝细胞癌中克隆得到。人成纤维蛋白原家族（frep）信号通路在癌症的发生进程和调节免疫细胞功能方面发挥着关键作用。
4.人fgl1蛋白为分泌蛋白，共含有312个氨基酸，包括22个氨基酸信号肽和290个氨基酸成熟蛋白质。淋巴细胞激活基因3（lag3）为免疫抑制受体，其配体为主要组织相容性复合体ii型（mhc-ii），此外fgl1独立于mhc-ii，是lag3的主要功能配体（wang et al. fibrinogen-like protein 1 is a major immune inhibitory ligand of lag-3，cell (2019)，https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.11.010）。
5.fgl1能够抑制抗原特异性t细胞激活，其在癌症患者血浆中的表达升高表明治疗效果预后不良。除了在癌症进展中的作用，fgl1对肝细胞也有恢复功能，其在部分肝切除术后、肝再生过程中表达量上升，并能刺激原代肝细胞摄取3h-胸苷，促进肝细胞增殖，对爆发性肝衰竭大鼠损伤的肝脏有保护作用（yu, ht.et al. (2009) j. biol. chem.284：13335.）。上述研究表明，fgl1在肝再生和肝保护中起着重要作用。因此，制备一种高特异性和灵敏度的fgl1抗体及fgl1检测试剂盒在临床诊断中具有重要的意义。
6.目前，市面上能够特异性并高灵敏度地检测fgl1的抗体及相关试剂盒极少。提供特异性强、灵敏度高、应用范围广的抗fgl1单克隆抗体及检测试剂盒，已成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，所述杂交瘤细胞可以分泌高灵敏度、强特异性的单克隆抗体，与fgl1蛋白具有良好的亲和能力，在相关的检测中具有重要的应用价值。
8.为达此目的，本发明采用如下技术方案：第一方面，本发明提供了分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为鼠抗人fgl1单克隆抗体杂交瘤细胞系mj9-1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23015，保藏日
期为2021年7月19日。
9.本发明提供了分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为鼠抗人fgl1单克隆抗体杂交瘤细胞系mj9-4，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23016，保藏日期为2021年7月19日。
10.本发明中，所述分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株以人源fgl1蛋白作为免疫原免疫小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，经筛选后得到，其可以分泌灵敏度高、特异性好的单克隆抗体。
11.本发明中，所述免疫原为人fgl1蛋白，其氨基酸序列如seq id no: 1所示。
12.seq id no: 1：ledcaqeqmrlraqvrlletrvkqqqvkikqllqenevqfldkgdentvidlgskrqyadcseifndgyklsgfykikplqspaefsvycdmsdgggwtviqrrsdgsenfnrgwkdyengfgnfvqkhgeywlgnknlhflttqedytlkidladfeknsryaqyknfkvgdeknfyelnigeysgtagdslagnfhpevqwwashqrmkfstwdrdhdnyegncaeedqsgwwfnrchsanlngvyysgpytaktdngivwytwhgwwyslksvvmkirpndfipnvihhhhhh。
13.本发明中，所述分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株的筛选方法如下：（1）构建真核表达载体，在293t细胞中瞬转表达，验证蛋白可以表达后，转染至293f细胞中进行表达，收集培养物并纯化，得到fgl1重组蛋白；（2）使用所得fgl1重组蛋白免疫小鼠，血清效价检测合格后，取脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合。经培养、筛选后，得到可以稳定分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
14.第二方面，本发明提供了抗fgl1单克隆抗体，所述抗fgl1单克隆抗体由第一方面所述的分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌得到。
15.本发明中，所述抗fgl1单克隆抗体的亚型为鼠源igg1。
16.本发明中，保藏编号为cgmcc no.23015的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体命名为mj9-1，其重链cdr1、cdr2和cdr3的序列分别如seq id no: 3、seq id no: 4和seq id no: 5所示，重链可变区序列如seq id no: 6所示，重链全长序列如seq id no: 7所示；轻链cdr1、cdr2和cdr3的序列分别如seq id no: 8、seq id no: 9和seq id no: 10所示，轻链可变区序列如seq id no: 11所示，轻链全长序列如seq id no: 12所示。
17.seq id no: 3：gftfsdgy；seq id no: 4：isdggsgt；seq id no: 5：ar；seq id no: 6：evqlvesggglvkpggslklscaasgftfsdgymywvrqtpekrlewvatisdggsgtyypdsvkgrftisrdnaknnlylqmsslksedtamyycaraatvtrwfaywgqgtlvtvs；seq id no: 7：evqlvesggglvkpggslklscaasgftfsdgymywvrqtpekrlewvatisdggsgtyypdsvkgrftisrdnaknnlylqmsslksedtamyycaraatvtrwfaywgqgtlvtvsaakttppsvyplapgsaaqtnsmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvpssprpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffped
itvewqwngqpaenykntqpimntngsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk；seq id no: 8：yninvw；seq id no: 9：kas；seq id no: 10：qqgqsyp；seq id no: 11：diqmnqspsslsaslgdtititchasyninvwltwyqqkpgnipklliykasklhtgvpsrfsgsgsgtgftltisslqpediatyycqqgqsypltfgggtkleik；seq id no: 12：diqmnqspsslsaslgdtititchasyninvwltwyqqkpgnipklliykasklhtgvpsrfsgsgsgtgftltisslqpediatyycqqgqsypltfgggtkleikradaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec。
18.本发明中，保藏编号为cgmcc no.23016的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体命名为mj9-4，其重链cdr1、cdr2和cdr3的序列分别如seq id no: 13、seq id no: 14和seq id no: 15所示，重链可变区序列如seq id no: 16所示，重链全长序列如seq id no: 17所示；轻链cdr1、cdr2和cdr3的序列分别如seq id no: 18、seq id no: 19和seq id no: 20所示，轻链可变区序列如seq id no: 21所示，轻链全长序列如seq id no: 22所示。
19.seq id no: 13：gyiftggw；seq id no: 14：inpstdgt；seq id no: 15：ar；seq id no: 16：evklqqsgaelakpgasvkmsckasgyiftggwmhwvkqrpgqglewigyinpstdgtdynqkfedkatltadkssstaymqlssltsedsavyycaregyygsspyfdywgqgttltvss；seq id no: 17：evklqqsgaelakpgasvkmsckasgyiftggwmhwvkqrpgqglewigyinpstdgtdynqkfedkatltadkssstaymqlssltsedsavyycaregyygsspyfdywgqgttltvssakttppsvyplapgsaaqtnsmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvpssprpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimntngsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk；seq id no: 18：qsvsnn；seq id no: 19：yvs；seq id no: 20：qqsnswp；seq id no: 21：divitqtpatlsvtpgdsvslscrasqsvsnnlhwyqqkshesprllikyvsqsisgipsrfsgsgsgtdftlsinsvetedfgmyfcqqsnswplytfgggtkleik；seq id no: 22：divitqtpatlsvtpgdsvslscrasqsvsnnlhwyqqkshesprllikyvsqsisgipsrfsgsgsgtdftlsinsvetedfgmyfcqqsnswplytfgggtkleikradaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec。
20.第三方面，本发明提供一种第二方面所述的抗fgl1单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括：培养第一方面所述的分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，纯化，得到所述抗fgl1单克隆抗体。
21.本发明中，所述单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：将所述分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔中，收集腹水，并进行纯化，得到所述抗fgl1单克隆抗体，并进行检测。
22.第四方面，本发明提供第一方面所述的分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株和/或第二方面所述的抗fgl1单克隆抗体在制备fgl1表达检测产品中的应用。
23.第五方面，本发明提供一种fgl1表达检测的产品，所述fgl1表达检测的产品含有第二方面所述的抗fgl1单克隆抗体。
24.优选地，所述产品包括试剂、试剂条或试剂盒中的任意一种。
25.本发明中，所述抗fgl1单克隆抗体可通过化学键偶联、静电吸附或者亲疏水性吸附连接缀合物，所述缀合物包括辣根过氧化物酶（hrp）、碱性磷酸酶（ap）、荧光素酶、生物素（biotin）或β-半乳糖苷酶中的任意一种或至少两种的组合。
26.本发明中，所述抗fgl1单克隆抗体可作为包被抗体或检测抗体，在上述产品中使用。
27.第六方面，本发明提供一种fgl1酶联免疫吸附检测试剂盒，所述fgl1酶联免疫吸附检测试剂盒含有第二方面所述的抗fgl1单克隆抗体。
28.优选地，所述fgl1酶联免疫吸附检测试剂盒以保藏编号为cgmcc no.23015的杂交瘤细胞株分泌的抗fgl1单克隆抗体作为捕获抗体、以偶联生物素的保藏编号为cgmcc no.23016的杂交瘤细胞株分泌的抗fgl1单克隆抗体作为检测抗体，通过夹心法或间接法检测样本中fgl1蛋白的表达。
29.本发明中，所述fgl1酶联免疫吸附检测试剂盒中的抗fgl1单克隆抗体可以与其他抗体形成抗体对，通过夹心法对样本的fgl1表达情况进行定性或定量检测。
30.在本发明的一个优选实施例中，以克隆号为mj9-1的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体作为捕获抗体，以偶联生物素的克隆号为mj9-4的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体作为检测抗体时，待测目的蛋白的量与反应的od值之间呈现良好的线性关系，灵敏度高。
31.第七方面，本发明提供一种fgl1免疫印迹检测试剂盒，所述fgl1免疫印迹检测试剂盒含有第二方面所述的抗fgl1单克隆抗体。
32.优选地，所述fgl1免疫印迹检测试剂盒还包括sds-page凝胶、硝酸纤维素膜、封闭液或酶标二抗中的任意一种或至少两种组合。
33.本发明中，所述抗fgl1单克隆抗体可以检测真核及原核表达的fgl1蛋白，可应用于免疫印迹检测中；所述fgl1免疫印迹检测试剂盒可以对样本进行定性或定量检测，条带清晰，结果准确，特异性好。
34.第八方面，本发明提供一种fgl1化学发光检测试剂盒，所述fgl1化学发光检测试剂盒含有第二方面所述的抗fgl1单克隆抗体。
35.本发明中，所述抗fgl1单克隆抗体可以与抗原配对，结合化学发光技术，对样本中的fgl1蛋白进行定性或定量检测。
36.第九方面，本发明提供一种检测fgl1表达的方法，所述检测fgl1表达的方法包括：使用第二方面所述的抗fgl1单克隆抗体、第五方面所述的fgl1表达检测的产品、第六方面所述的fgl1酶联免疫吸附检测试剂盒、第七方面所述的fgl1免疫印迹检测试剂盒或第八方面所述的fgl1化学发光检测试剂盒中的任意一种或至少两种的组合，对待测样本进行检测。
37.第十方面，本发明提供第二方面所述的抗fgl1单克隆抗体、第五方面所述的fgl1表达检测的产品、第六方面所述的fgl1酶联免疫吸附检测试剂盒、第七方面所述的fgl1免疫印迹检测试剂盒、第八方面所述的fgl1化学发光检测试剂盒或第九方面所述的检测fgl1表达的方法在fgl1蛋白表达检测中的应用。
38.相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：（1）本发明筛选获得的分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株mj9-1~mj9-5以及mj9-7~mj9-15分泌的单克隆抗体，均能特异性识别真核和原核重组表达获得的fgl1蛋白，特异性强，灵敏度高，其中以克隆号为mj9-1的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的灵敏度最优，具有广泛的用途；（2）本发明获得的抗fgl1单克隆抗体在酶联免疫吸附检测（elisa）中，通过间接法能够特异性识别原核和真核表达系统表达的fgl1蛋白；所述抗fgl1单克隆抗体之间可以进行配对，作为捕获抗体或检测抗体，可在酶联免疫吸附检测以及化学发光检测中检测fgl1蛋白的含量，其特异性强，灵敏度高，效果较好，在elisa检测中，以克隆号为mj9-1的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体作为捕获抗体，以偶联生物素的克隆号为mj9-4的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体作为检测抗体时，待测目的蛋白的量与反应的od值之间呈现最佳的线性关系，灵敏度高，对真核表达的fgl1蛋白的检测限低至1.95ng/ml；（3）本发明获得的抗fgl1单克隆抗体在蛋白免疫印迹（western blot）检测中，能够特异性识别原核和真核表达系统表达的fgl1蛋白，条带清晰，无非特异性背景，特异性强，灵敏度高；（4）本发明获得的抗fgl1单克隆抗体能够与辣根过氧化物酶（hrp）、碱性磷酸酶（ap）、荧光素酶（luciferase）、生物素（biotin）和β-半乳糖苷酶等缀合物连接，对样本进行检测，进一步扩大了应用范围。
附图说明
39.图1为纯化后的真核表达的人fgl1重组蛋白的sds-page电泳结果图片，图中，泳道m-标准蛋白分子量marker，泳道bsa-牛血清白蛋白，泳道r-还原状态下的人fgl1蛋白，泳道n-非还原状态下的人fgl1蛋白；图2为克隆编号为mj9-1的杂交瘤细胞分泌的抗fgl1单克隆抗体的sds-page电泳结果图片，图中，泳道m-标准蛋白分子量marker，泳道bsa-牛血清白蛋白，泳道r-还原状态下的抗fgl1单克隆抗体，泳道n-非还原状态下的抗fgl1单克隆抗体；图3为杂交瘤细胞株克隆mj9-1~mj9-5、mj9-7~mj9-10和mj9-12~mj9-15分泌的抗fgl1单克隆抗体的间接elisa检测结果图片；图4为纯化后的mj9-1分泌的单克隆抗体与经生物素标记的mj9-4分泌的单克隆抗体通过双抗体夹心elisa方法检测梯度浓度的fgl1蛋白的结果的散点图；
图5为纯化后的mj9-1和mj9-4分泌的单克隆抗体对不同表达来源的fgl1蛋白的检测结果图片，图中，泳道m-标准蛋白分子量marker，泳道2-真核表达的fgl1蛋白，泳道3-阴性对照bsa，泳道4-原核表达的fgl1蛋白；泳道6-真核表达的fgl1蛋白，泳道7-阴性对照bsa，泳道8-原核表达的fgl1蛋白，其中，泳道2~4为使用mj9-4分泌的单克隆抗体进行检测，泳道6~8为使用mj9-1分泌的单克隆抗体进行检测。
具体实施方式
40.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
41.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
42.实施例1本实施例制备真核表达的人源fgl1抗原，步骤如下：获得人fgl1蛋白胞外区（uniprot id: q08830，leu23-ile312）的氨基酸序列，在蛋白的c端添加6个组氨酸标签，在蛋白的n端添加适合于真核蛋白分泌的信号肽，形成重组蛋白，序列如seq id no: 1所示。利用同源重组的方法将编码重组蛋白的目的基因与表达载体ptt5连接，构建表达质粒ptt5-fgl1。
43.seq id no: 1：ledcaqeqmrlraqvrlletrvkqqqvkikqllqenevqfldkgdentvidlgskrqyadcseifndgyklsgfykikplqspaefsvycdmsdgggwtviqrrsdgsenfnrgwkdyengfgnfvqkhgeywlgnknlhflttqedytlkidladfeknsryaqyknfkvgdeknfyelnigeysgtagdslagnfhpevqwwashqrmkfstwdrdhdnyegncaeedqsgwwfnrchsanlngvyysgpytaktdngivwytwhgwwyslksvvmkirpndfipnvihhhhhh。
44.将构建完成的真核表达质粒，在293t细胞中瞬转表达，48h后收集细胞表达上清，通过elisa对蛋白的表达情况进行验证，实验结果证实蛋白成功表达。
45.将含有目的质粒的甘油菌接种于200ml lb培养基，37℃、200rpm下震荡培养16 h，质粒抽提并测序，确保质粒序列正确。将质粒dna瞬时转染293f细胞，具体方法参见thermofisher公司的expi293
™
表达系统试剂盒（货号：a14635）操作指南，在293f细胞中进行蛋白表达，并在96h收获细胞培养物，10000rpm离心30min，用0.45μm一次性无菌滤器过滤液体，获得培养基清液。
46.用akta蛋白纯化仪亲和纯化人fgl1蛋白，纯化后的蛋白经缓冲液置换后，进行sds-page电泳检测，检测纯化蛋白的分子量及纯度，上样量均为1 μg，结果如图1所示。
47.真核表达的人fgl1蛋白的理论分子总量为35kd，由图可以看出，纯化后的fgl1蛋白在还原性缓冲液的条件下，条带大小与蛋白的理论分子量一致，条带位置正确，纯度大于95%；在非还原性的缓冲液中，由于蛋白内部含有半胱氨酸和二硫键，所以蛋白为二聚体状态，分子量大小约为70kd。
48.实施例2本实施例提供一种原核表达的人fgl1蛋白抗原，制备过程如下：
通过同源重组的方法将人fgl1蛋白胞外区（uniprot id: q08830，leu23-ile312）序列与表达载体pcold tf（takara，code no:3365）连接，构建表达克隆载体pcold tf-fgl1，形成完整的tf-fgl1融合蛋白，完整的融合蛋白氨基酸序列如seq id no:2所示。
49.seq id no:2：mnhkvhhhhhhmqvsvettqglgrrvtitiaadsietavkselvnvakkvridgfrkgkvpmnivaqrygasvrqdvlgdlmsrnfidaiikekinpagaptyvpgeyklgedftysvefevypevelqgleaievekpivevtdadvdgmldtlrkqqatwkekdgaveaedrvtidftgsvdgeefeggkasdfvlamgqgrmipgfedgikghkageeftidvtfpeeyhaenlkgkaakfainlkkveerelpeltaefikrfgvedgsveglraevrknmerelksairnrvksqaieglvkandidvpaalidseidvlrrqaaqrfggnekqalelprelfeeqakrrvvvglllgevirtnelkadeervkglieemasayedpkeviefysknkelmdnmrnvaleeqaveavlakakvtekettfnelmnqqasaglevlfqgpsaglvprgsggiegrhmledcaqeqmrlraqvrlletrvkqqqvkikqllqenevqfldkgdentvidlgskrqyadcseifndgyklsgfykikplqspaefsvycdmsdgggwtviqrrsdgsenfnrgwkdyengfgnfvqkhgeywlgnknlhflttqedytlkidladfeknsryaqyknfkvgdeknfyelnigeysgtagdslagnfhpevqwwashqrmkfstwdrdhdnyegncaeedqsgwwfnrchsanlngvyysgpytaktdngivwytwhgwwyslksvvmkirpndfipnvi。
50.构建原核表达质粒，测序正确后，转化bl21（de3）菌株，并涂布氨苄青霉素抗性平板，37℃倒置培养12 h。挑取单菌落并震荡培养，采用终浓度为0.1 mm的iptg进行诱导，破碎菌体，收集上清进行sds-page电泳，验证蛋白是否表达以及分子量，经验证，蛋白在菌体破碎后上清液中呈可溶性表达，分子大小也符合预期。
51.将菌株接种在含有氨苄青霉素的lb培养基中，37℃、200 rpm培养，待菌液od值升高至0.5，利用0.1 mm的iptg进行低温诱导表达，诱导表达的温度为16℃，时间为18 h，诱导表达结束后10000 rpm离心收集菌体。利用超声破碎仪进行破菌处理后，10000 rpm离心30 min，用0.45 μm的滤器过滤破菌上清液，获得待纯化样品。利用ni柱（ni sepharose high performance，ge，货号17-5268-01）进行亲和层析纯化，获得原核表达的fgl1人源抗原，并通过elisa验证蛋白有活性。
52.实施例3本实施例制备分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，步骤如下：（1）免疫用真核表达的人fgl1重组蛋白免疫4~6周龄的雌性balb/c小鼠（卡文斯百格（苏州）模式动物研究有限公司），免疫前眼眶采血20
µ
l，离心后获得血清作为阴性对照。
53.首次免疫剂量为每只小鼠注射人fgl1重组蛋白50
µ
g，用生理盐水稀释至体积为200
µ
l，与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后腹部皮下多点注射。每14天皮下加强免疫一次，剂量为每只小鼠注射人fgl1重组蛋白25
µ
g，用生理盐水稀释至体积为200
µ
l，与等体积的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后注射。第3次加强免疫后7天眼眶取血，用elisa检测血清抗体效价，对达到要求的小鼠进行冲击免疫，剂量为每只小鼠注射人fgl1重组蛋白50
µ
g，用生理盐水稀释至体积为100
µ
l，腹腔注射，3天后进行融合。
54.（2）融合将新鲜摘下的小鼠脾脏放在细胞筛上碾碎过滤，与sp2/0细胞按数量比为3:1混合，1000rpm室温离心5min，弃培养基。将装有离心后、混合好的细胞的离心管放入37℃温水
浴中，边搅动细胞边缓慢加入1ml聚乙二醇溶液（sigma，p7181-5
×
5 ml）。在水浴中静置1min，缓慢加入10ml无血清的dmem培养基（hyclone，sh30243.01b），1000rpm离心5min，弃去上清。
55.根据细胞总数加入含血清的dmem培养基，并将细胞接种到96孔细胞培养板中，使细胞密度为1
×
105个/孔，每孔接种150
µ
l，放入37℃、5% co2培养箱中培养。24 h后加入50
µ
l含hat（gibco，21060017）的培养基。此后每3~5天进行换液。
56.（3）筛选待细胞密度达到50%时，取上清，利用间接elisa法筛选分泌抗fgl1抗体的杂交瘤细胞株。间接elisa法的操作步骤如下：用100
µ
l浓度为0.5
µ
g/ml的人fgl1重组蛋白包被检测板，37℃静置1h。用pbst洗涤液清洗4次，然后分别取100μl融合后细胞的培养基上清加入相对应的elisa检测孔中，用免疫小鼠血清（按1:10000稀释）作为阳性对照，sp2/0的培养基上清作为阴性对照，37℃，静置1h。用pbst洗涤4次后，每孔加入100
µ
l辣根过氧化物酶hrp标记亲和纯化山羊抗鼠igg（h l）f(ab')2片段（品牌：jackson，货号：115-036-003，使用1%bsa按1:5000稀释），37℃孵育1 h。用pbst洗涤4次后，加入tmb（solarbio，pr1210-2
×
250ml）显色，测定450nm处的od值。od
450
数值大于0.5的，判定为阳性克隆株。
57.对所得阳性细胞克隆株，采用有限稀释法筛选亚克隆。
58.（4）杂交瘤细胞株的建立经过3次亚克隆和间接elisa筛选后，共获得14株特异性识别人fgl1蛋白并稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，克隆编号依次为mj9-1、mj9-2、mj9-3、mj9-4、mj9-5、mj9-7、mj9-8、mj9-9、mj9-10、mj9-11、mj9-12、mj9-13、mj9-14和mj9-15。
59.实施例4本实施例制备抗fgl1单克隆抗体，并进行亚型鉴定，步骤如下：（1）腹水制备取对数生长期的分泌鼠抗人fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用无血清培养基洗涤并重悬，调整密度为5
×
105个/ml。
60.先用石蜡油致敏小鼠，然后腹腔注射悬浮的细胞，7天后收集腹水。取出的腹水于4℃、4000rpm下离心10min。小心吸出中间层腹水，收集在离心管中，4℃保存，用于抗体纯化。
61.（2）单克隆抗体的纯化用hi trap rprotein g ff（ge healthcare，17061802）亲和层析填料及akta蛋白纯化仪，参照说明书从腹水中纯化单克隆抗体。
62.平衡液为20mm的磷酸盐缓冲液（ph7.0），洗脱液为100mm甘氨酸溶液（ph2.7），中和液为1m tris-hcl溶液（ph8.5）。纯化具体步骤如下：取1ml的纯化柱，用10ml去离子水冲洗柱子，再用10ml平衡液冲洗柱子，样品上样。用10ml平衡液冲洗柱子，最后用10ml洗脱液进行抗体的洗脱，并立即加入中和液，使其ph达到7.0。所有步骤的液体流速均为1ml/min。
63.取抗体进行sds-page电泳，鉴定抗体纯度，并用nanodrop蛋白浓度测定仪测定浓度。sds-page电泳的上样量均为1 μg，其中克隆编号为mj9-1的杂交瘤细胞分泌的抗fgl1单克隆抗体的检测结果如图2所示。由图可以看出，纯化后的抗fgl1单克隆抗体的条带大小与
预期相符，纯度＞95%，可进行后续的实验。
64.其他克隆编号的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的检测结果与mj9-1类似，出于节省篇幅的目的，此处不再赘述。
65.（3）单克隆抗体亚型鉴定用pbs（ph7.4）稀释山羊抗鼠igg（杭州索莱尔博奥生物技术有限公司，sl200101）抗体至浓度为1
µ
g/ml，每孔加入100
µ
l，4℃孵育过夜；倾空液体，用含0.05% tween-20的pbst清洗5次，每孔加入300
µ
l封闭液，37℃封闭1h，倾空液体，用pbst清洗5次；每孔加入100
µ
l杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1h，倾空液体，用pbst清洗5次；每孔加入100
µ
lhrp标记的山羊抗鼠igm（jackson，115-035-075，1:5000稀释）或hrp标记的山羊抗鼠（igg1、igg2a、igg2b和igg3）抗体（jackson，115-035-164，1:5000稀释），37℃孵育1h，倾空液体，用pbst清洗5次；每孔加入100
µ
l底物tmb溶液，室温显色5min，在450nm波长下测od值。
66.结果显示，14株杂交瘤细胞分泌的抗fgl1单克隆抗体的亚型均为mouseigg1。
67.实施例5本实施例通过间接elisa法检测纯化后的抗fgl1单克隆抗体的特异性，所用包被抗原为真核表达系统和原核表达系统表达的人源fgl1蛋白，步骤如下：用100
µ
l浓度为0.5
µ
g/ml的人fgl1重组蛋白（真核表达和原核表达蛋白）分别包被检测板，37℃静置1h，用pbst洗涤液清洗4次，然后用5%bsa封闭elisa检测板，37℃静置1 h，用pbst洗涤4次；用1%bsa稀释抗体至终浓度为0.5
µ
g/ml，分别取100
µ
l稀释的抗体（本发明中的杂交瘤细胞mj9-1~mj9-5、mj9-7~mj9-10和mj9-12~mj9-15分泌的抗fgl1单克隆抗体）加入到检测孔中，用免疫小鼠血清（按1:10000稀释）作为阳性对照（p），1%bsa作为阴性对照（n），37℃静置1h；用pbst洗涤4次后，每孔加入100
µ
lhrp山羊抗鼠igg抗体（1%bsa按1:5000稀释），37℃孵育1h，用pbst洗涤4次后，加入tmb进行显色，测定450nm处的od值。
68.结果如图3显示，结果显示除mj9-10分泌的单克隆抗体的od值较低、识别fgl1蛋白能力较差外，其余杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体在检测不同表达来源的人源fgl1蛋白中，均表现出强阳性，抗体效果较好。
69.根据检测结果，进一步选择mj9-1、mj9-4、mj9-5、mj9-8和mj9-12分泌的单克隆抗体与商品化单克隆抗体abnova的单克隆抗体2a4（货号h00002267-m01）、abnova的单克隆抗体2c7（货号h00002267-m06）以及santa cruz的单克隆抗体a-8（货号sc-514057）进行了elisa实验对比。将真核表达的人fgl1重组蛋白按浓度为0.5
µ
g/ml进行包被，一抗浓度依次为500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml和0。二抗hrp山羊抗鼠igg的稀释比例为1:5000，其余实验步骤同上。结果如表1所示。
70.表1
由表1可知，mj9-1、mj9-4、mj9-5、mj9-8和mj9-12分泌的单克隆抗体可以与真核表达的人fgl1蛋白结合，a-8抗体也能够特异性识别人fgl1蛋白。在一抗浓度为5ng/ml时，mj9-1和mj9-5分泌的单克隆抗体的灵敏度优于a-8抗体。
71.根据本实施例的检测结果，商品化抗体2a4和2c7在elisa实验中未与真核表达的人fgl1蛋白结合。然而根据其商品说明书中的相关记载，2a4和2c7均可以与gst-fgl1蛋白特异性结合，且灵敏度很高，推测本实施例的结果与说明书记载不一致的原因有如下两点：一，本实施例采用间接elisa法进行检测，抗原蛋白直接包被在检测板上，抗原包被时可能将2a4和2c7识别的抗原表位包被在内侧，无法进行暴露，因此无法与抗体结合；而2a4和2c7采用双抗夹心elisa法进行检测，包被在检测板上的是gst-fgl1蛋白的抗体，gst-fgl1蛋白未直接与检测板接触，抗原表位暴露的更多，因此相应的抗原表位可以与2a4和2c7结合，并成功显色；二，本实施例中的真核fgl1蛋白添加了组氨酸标签，分子量较小且对抗原本身的结构影响较小；2a4和2c7在进行检测时使用的是gst-fgl1融合蛋白，gst标签较大（26 kd），因此可能对抗原本身的结构产生影响。本实施例在检测时使用的fgl1蛋白不携带gst标签，其与2a4和2c7说明书中使用的fgl1蛋白的空间结构可能存在差异，进而使抗原表位发生变化，导致识别不同的抗原表位的抗体对抗原的亲和力产生差异。
72.实施例6本实施例进行抗fgl1单克隆抗体之间的elisa抗体配对实验，步骤如下：单克隆抗体配对筛选：针对14种单克隆抗体，共获得14
×
14组配对单克隆抗体。通过化学发光检测法初步配对筛选得到最佳配对单克隆抗体对为杂交瘤细胞mj9-1和mj9-4分泌的单克隆抗体，通过elisa实验进行配对检测优化。
73.实验步骤：（1）包被：用pbs（ph7.4）将捕获抗体稀释至终浓度为2
µ
g/ml，每孔中加入100
µ
l，37
℃孵育1 h，弃去液体，并用pbst洗涤5次；（2）封闭：用pbst配制5%bsa，每孔中加入300
µ
l，37℃孵育1 h，弃去液体，并用pbst洗涤5次；（3）加抗原：将真核表达的人fgl1蛋白用1%bsa稀释成梯度浓度，每孔中加入100
µ
l，37℃孵育1 h，弃去液体，用pbst洗涤5次；（4）一抗孵育：将生物素偶联的检测抗体用1%bsa稀释至终浓度为0.25
µ
g/ml，每孔中加入100
µ
l，37℃孵育1 h，弃去液体，并用pbst洗涤5次；（5）每孔中加入100
µ
lhrp标记的链霉亲和素，37℃孵育1 h；弃去液体，并用pbst洗涤5次；每孔中加入100
µ
ltmb（solarbio，pr1210-2
×
250ml）显色，室温避光孵育5 min，每孔中加入50
µ
l1mol/l的硫酸溶液终止反应，在酶标仪上测定450nm处的od值。
74.经过优化，确定以浓度为8
µ
g/ml、克隆号为mj9-1分泌的单克隆抗体作为捕获抗体，以浓度为0.2
µ
g/ml、克隆号为mj9-4分泌的单克隆抗体偶联生物素作为检测抗体时，为最佳抗体配对的检测方式，此时待测目的蛋白的量与反应的od值之间呈现最佳的线性关系。
75.对配对抗体的灵敏度进行评价：以mj9-1和mj9-4分泌的抗体作为配对抗体，第一单克隆抗体（mj9-1分泌）的包被浓度为8
µ
g/ml，生物素标记的第二单克隆抗体（mj9-4分泌）的检测浓度为0.2
µ
g/ml，对梯度浓度的真核表达的fgl1蛋白溶液进行检测，检测结果如表2所示。对表格数据进行整理，结果如图4所示。由表2和图4可知，配对抗体mj9-1和mj9-4对真核表达的fgl1蛋白的检测灵敏度为1.95ng/ml，且在蛋白浓度为1.95~31.15ng/ml的范围内，蛋白浓度与elisa检测的od值呈线性关系。
76.表2实施例7本实施例提供一种fgl1酶联免疫吸附检测试剂盒，所述fgl1酶联免疫吸附检测试剂盒含有克隆号为mj9-1和mj9-4分泌的抗fgl1单克隆抗体；所述fgl1酶联免疫吸附检测试剂盒以mj9-1和mj9-4分泌的抗体作为配对抗体，其中，以mj9-1分泌的单克隆抗体作为捕获抗体，以偶联生物素的mj9-4分泌的单克隆抗体作为检测抗体，通过夹心法检测样本中fgl1蛋白的表达。
77.实施例8本实施例提供一种fgl1免疫印迹检测试剂盒，所述fgl1免疫印迹检测试剂盒含有所述的抗fgl1单克隆抗体，以及sds-page凝胶、硝酸纤维素膜、封闭液和酶标二抗；其中，所述抗fgl1单克隆抗体为杂交瘤细胞mj9-1或mj9-4分泌的单克隆抗体。
78.实施例9本实施例使用实施例8制备的fgl1免疫印迹检测试剂盒进行检测，步骤如下：以真核表达的fgl1蛋白（分子量：35kd）及原核表达的tf-fgl1蛋白（分子量：
86.3kd）作为待测样本，加入还原性缓冲液，煮沸10min；配制12% sds-page凝胶，上样，以100v进行电泳，直至电泳结束；配制1
×
转膜液，取硝酸纤维素膜与凝胶一起在电压100v条件下，转膜60min；将硝酸纤维素膜置于含5%脱脂奶粉的pbst封闭液中4℃封闭过夜；用pbst洗涤后，将抗fgl1单克隆抗体用1%脱脂奶粉稀释至终浓度为0.5 μg/ml，将硝酸纤维素膜置于抗体稀释液中室温孵育60min，以商品化fgl1单克隆抗体a-8作为对照，稀释至终浓度为0.5 μg/ml；用pbst清洗后，用辣根过氧化物酶hrp标记亲和纯化山羊抗鼠igg（h l）f(ab')2片段（品牌：jackson，货号：115-036-003，按1:3000稀释）抗体，将硝酸纤维素膜在室温下孵育60min；用chemidoc
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mp成像系统曝光。
79.上样量、使用的抗体及检测流程如表3所示，其中，蛋白的上样总量如表3所示，上样体积均为10 μl。
80.表3电泳结果如图5所示。由图可知，在使用mj9-1分泌抗体的检测中，真核表达fgl1蛋白的蛋白上样量为1μg，原核表达fgl1蛋白的蛋白上样量为1μg，第一抗体稀释浓度为0.5μg/ml时，免疫印迹的条带较清晰。在使用mj9-4分泌抗体的检测中，真核表达fgl1蛋白的蛋白上样量为0.05μg，原核表达fgl1蛋白的蛋白上样量为0.5μg，第一抗体稀释浓度为0.5μg/ml时，免疫印迹的条带较清晰。
81.实验结果显示，克隆号为mj9-1和mj9-4的两株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体在免疫印迹实验中的效果极好，能够检测不同表达来源的fgl1蛋白，条带大小正确，特异性好，无非特异性背景。且在这两种优化条件下，二者的条带亮度及宽度一致，mj9-4的抗体灵敏度稍高于mj9-1。
82.本实施例中一抗的使用浓度均为0.5μg/ml，mj9-1和mj9-4分泌的单克隆抗体均可以进行准确检测，而使用a-8抗体的泳道中无条带，推测其可能原因如下：本技术中一抗的使用浓度为0.5μg/ml，低于a-8说明书中公开的工作浓度200 μg/ml，导致硝酸纤维膜上的抗原蛋白结合的抗体较少而无法正常显色。而本技术中的单克隆抗体在0.5μg/ml的使用浓度下也可以进行检测，进一步表明本技术中mj9-1和mj9-4分泌的单克隆抗体的灵敏度优于对照抗体a-8。
83.实施例10
本实施例对分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株mj9-1进行保藏，命名为鼠抗人fgl1单克隆抗体杂交瘤细胞系mj9-1，于2021年7月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为cgmcc no.23015。
84.实施例11本实施例对分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株mj9-4进行保藏，命名为鼠抗人fgl1单克隆抗体杂交瘤细胞系mj9-4，于2021年7月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为cgmcc no.23016。
85.综上所述，本发明提供了一株分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其分泌的单克隆抗体具有很高的灵敏度及良好的特异性，与不同来源的fgl1蛋白均具有良好的亲和能力，可应用于elisa、蛋白免疫印迹以及化学发光等相关检测中，具有广阔的应用前景。
86.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。