通过使用乙硫异烟胺增强干细胞功效的方法与流程

1.本发明涉及用于增强干细胞功效的培养基组合物，其包括乙硫异烟胺(ethionamide)；增强干细胞功效的方法，其包括在培养基组合物中培养干细胞；制备具有增强功效的干细胞的方法，通过所述方法制备的干细胞及其用途。


背景技术：

2.炎症(inflammation)是对诸如病原体和受损细胞的生物组织的有害刺激的生物反应之一，和涉及免疫细胞、血管和分子生物中间体的保护性应答。然而，异常炎症与各种人类疾病相关，并导致各种疾病，诸如过敏、特应性、关节炎、心脏病、脑部疾病、循环障碍和癌症。各种炎症性疾病的发生与巨噬细胞的激活相关，其导致炎症因子的过度产生，并且代表性的炎症因子包括白细胞介素-1β(interleukin-1β；il-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α；tnf-α)和一氧化氮(nitrogen oxide；no)。
3.由于快速老龄化，以阿尔茨海默氏病和帕金森氏病为代表的退行性脑部疾病(degenerative brain disease)正在成为一个严重的社会问题。根据来自阿尔茨海默氏病协会的数据，预计在美国每68秒发生的阿尔茨海默氏病在2050年将以每33秒发生。在美国，阿尔茨海默氏病是仅次于心脏病和癌症的第三种治疗最昂贵的疾病，在所有年龄组中的第六大主要死亡原因，以及超过65岁的老年人的第五大主要死亡原因。在韩国，估计痴呆患者的数量将从2010年的470,000(占65岁及以上人群的8.8％)增加到2020年的750,000(9.7％)，并且脑血管疾病在过去十年中已经是韩国的第二大主要死亡原因。
4.最近，研究结果表明过度的脑病是这些退行性脑部疾病的主要原因，这在全球范围内已有报道。脑病是发生在大多数退行性脑部疾病(如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病)中的病理学症状之一，并且神经细胞的死亡是由炎症介质如炎症细胞因子或免疫细胞因脑病产生的氧化物质促进的。因此，通过抑制脑病治疗退行性脑部疾病的研究正在积极进行。
5.同时，间充质干细胞(mesenchymal stem cell)被称为参与组织再生，治疗和免疫应答以及具有多潜能性的细胞，因此，一直在努力从脐带血或骨髓中分离和培养间充质干细胞，以利用上述特性来开发用于各种疾病的治疗剂。例如，间充质干细胞作为治疗自身免疫性疾病的新的替代物而出现，并且已经报道了它们的免疫抑制、抗炎作用以及t细胞激活和增殖抑制作用。此外，已经报道了间充质干细胞显示神经保护作用，并在退行性神经系统环境中分泌多种神经生长因子以促进神经细胞的存活和神经纤维的再生，并且由于间充质干细胞具有免疫调节能力，因此调控多种免疫应答。此外，已知通过分化或融合成神经细胞来调控退行性神经系统环境以及神经再生(hanyang med rev2012；32:145-153)。
6.然而，由于只有间充质干细胞的上述作用是已知的，并且优化以具有更改善的治疗作用的间充质干细胞的开发还没有充分发展，因此迫切需要开发通过增强治疗炎症性疾病和退行性脑部疾病的功效而优化的干细胞治疗剂。
7.公开
8.技术问题
9.因此，作为对进一步改善干细胞的抗炎作用和表达旁分泌因子功效的方法的研究的结果，本发明的发明人证实，当使用通常被称为抗生素的乙硫异烟胺(ethionamide)时，干细胞的功效得到改善，并且干细胞在体内基本上减少了脑病和痴呆的病理学症状，因此，完成了本发明。
10.因此，本发明涉及提供用于增强干细胞功效的培养基组合物，其包括乙硫异烟胺(ethionamide)。
11.此外，本发明涉及提供增强干细胞功效的方法，其包括在培养基组合物中培养干细胞。
12.此外，本发明涉及制备具有增强功效的干细胞的方法，其包括在培养基组合物中培养干细胞；通过所述方法制备的具有增强功效的干细胞，以及所述干细胞的用途。
13.然而，本发明所要解决的技术问题并不限于上述问题，并且本领域普通技术人员从以下的描述将完全理解本文没有描述的其它问题。
14.技术方案
15.本发明提供了用于增强干细胞功效的培养基组合物，其包括乙硫异烟胺(ethionamide)。
16.在本发明的一个实施方案中，乙硫异烟胺可以以1至200μm的浓度包含在培养基中。
17.在本发明的另一个实施方案中，干细胞可以是胚胎干细胞或成体干细胞。
18.在本发明的另一个实施方案中，所述成体干细胞可以是来源于选自以下中的一种或多种组织类型的间充质干细胞：脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、皮肤、羊膜和胎盘。
19.在本发明的另一个实施方案中，功效的增强可以是干细胞中旁分泌因子的表达提高。
20.在本发明的另一个实施方案中，所述旁分泌因子可以是选自以下中的一种或多种：脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor；bdnf)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor；vegf)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1；igf-1)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor；hgf)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1；ho-1)、nad(p)h：醌氧化还原酶(nad(p)h:quinone oxidoreductase；nqo1)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit；gclc)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基(glutamate-cysteine ligase modifier subunit；gclm)。
21.此外，本发明提供了增强干细胞功效的方法，其包括在培养基组合物中培养干细胞。
22.此外，本发明提供了制备具有增强功效的干细胞的方法，其包括在培养基组合物中培养干细胞。
23.此外，本发明提供了通过上述方法制备的具有增强功效的干细胞。
24.此外，本发明提供了用于预防或治疗炎症性疾病的药物组合物，其包括干细胞作为活性成分。
25.在本发明的一个实施方案中，所述炎症性疾病可以选自：皮炎、过敏、特应性、哮喘、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉痛、扁桃体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠
炎、腹膜炎、骨髓炎、蜂窝组织炎、脑膜炎、脑炎、胰腺炎、中风、急性支气管炎、慢性支气管炎、痔疮、痛风、强直性脊柱炎、风湿热、狼疮、纤维肌痛(fibromyalgia)、银屑病性关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、感染性关节炎、关节周炎、腱炎、腱鞘炎、腱周围炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、干燥综合征(sjogren’s syndrome)、多发性硬化、以及急性和慢性炎症性疾病。
26.此外，本发明提供预防或治疗炎症性疾病的方法，其包括用包括干细胞作为活性成分的药物组合物治疗对象。
27.此外，本发明提供了药物组合物用于预防或治疗炎症性疾病的用途。
28.此外，本发明提供了用于预防或治疗退行性脑部疾病的药物组合物，其包括干细胞作为活性成分。
29.在本发明的一个实施方案中，所述退行性脑部疾病可以选自：帕金森氏病、痴呆、阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆、亨廷顿氏病、中风、脑梗塞、皮克氏(pick)病、头部损伤、脊髓损伤、脑动脉硬化、卢伽雷氏病、多发性硬化、老年抑郁症和克雅氏病(creutzfeldt-jakob disease)。
30.此外，本发明提供了预防或治疗退行性脑部疾病的方法，其包括用包括干细胞作为活性成分的药物组合物治疗对象。
31.此外，本发明提供了药物组合物用于预防或治疗退行性脑部疾病的用途。
32.有益效果
33.本发明发明人通过实验证实，当炎症诱导的小胶质细胞与经乙硫异烟胺致敏的间充质干细胞共培养时，由间充质干细胞引起的抗炎作用得到改善，并且多种生长因子和抗氧化因子的旁分泌活性在经乙硫异烟胺致敏的间充质干细胞中得到提高，并且还通过在痴呆动物模型中施用间充质干细胞证实了显著降低淀粉样蛋白β、脑病和磷酸化tau的作用。因此，本发明通过用乙硫异烟胺处理治疗间充质干细胞简单过程，可以有效地提高间充质干细胞的抗炎作用和旁分泌因子的表达水平，并且通过上述方法制备的干细胞可以被有效地用于预防或治疗炎症性疾病或退行性脑部疾病。
附图说明
34.图1a显示了在炎症诱导的小胶质细胞(bv2)和经乙硫异烟胺致敏或未致敏的间充质干细胞共培养后的inos的表达水平。
35.图1b显示了在炎症诱导的小胶质细胞(bv2)和经乙硫异烟胺致敏或未致敏的间充质干细胞共培养后的no的表达水平。
36.图1c显示了在炎症诱导的小胶质细胞(bv2)和经乙硫异烟胺致敏或未致敏的间充质干细胞共培养后的ros的表达水平。
37.图2a显示了在炎症诱导的小胶质细胞(bv2)和经乙硫异烟胺致敏或未致敏的间充质干细胞共培养后炎症细胞因子il-6的mrna的表达水平。
38.图2b显示了炎症诱导的小胶质细胞(bv2)和经乙硫异烟胺致敏或未致敏的间充质干细胞共培养后炎症细胞因子tnf-α的mrna的表达水平。
39.图3显示了在炎症诱导的小胶质细胞(bv2)和经乙硫异烟胺致敏或未致敏的间充质干细胞共培养后，通过蛋白质印迹测量的nf-kb活性及其定量表达水平。
40.图4a显示了在用浓度为(50和100μm)的乙硫异烟胺处理间充质干细胞后，作为旁分泌因子的生长因子bdnf、vegf、igf-1和hgf的表达水平。
41.图4b显示了在用浓度为(50和100μm)的乙硫异烟胺处理间充质干细胞后，作为旁分泌因子的抗氧化相关因子ho-1、nqo1、gclc和gclm的表达水平。
42.图5a显示了在向使用了淀粉样蛋白β抗体(抗6e10)的痴呆小鼠模型的心室施用经乙硫异烟胺致敏或未致敏的间充质干细胞后一周获得的脑组织切片上进行免疫染色的结果，及其定量结果。
43.图5b显示了通过与图5a中所用相同的方法，在向痴呆小鼠模型施用间充质干细胞后，使用均质化脑组织获得的可溶部分和不可溶部分通过elisa测量的淀粉样蛋白β的水平。
44.图6显示了在使用脑病相关抗体(gfap)通过与图5a中所用相同的方法获得的脑组织切片上进行的免疫染色的结果，及其定量结果。
45.图7显示了tau蛋白的水平，其中第181和231位的苏氨酸残基被磷酸化，是通过与图5b中所用相同的方法，在向痴呆小鼠模型的心室施用经乙硫异烟胺致敏或未致敏的间充质干细胞后2周获得的脑组织样品上通过elisa进行的。
46.本发明的模式
47.本发明提供了用于增强干细胞功效的培养基组合物，其包括乙硫异烟胺(ethionamide)。
48.通常，具有以下化学结构的2-乙基吡啶-4-硫代甲酰胺(2-ethylpyridine-4-carbothioamide)是基于硫酰胺的抗生素，并且已知用于治疗细菌感染疾病，但是在本发明中，首先发现了用于增强干细胞功效的乙硫异烟胺的效果。
49.[乙硫异烟胺(ethionamide)]
[0050][0051]
本发明发明人通过具体的实施例证实了增强经乙硫异烟胺致敏的干细胞功效的效果。
[0052]
在本发明的一个实施方案中，作为测量在炎症诱导的小胶质细胞和经乙硫异烟胺致敏或未致敏的间充质干细胞共培养后，inos、no和ros水平的结果，与对照或乙硫异烟胺未致敏的组相比，在与经乙硫异烟胺致敏的间充质干细胞共培养的组中，可以进一步降低因子的表达，这显示了间充质干细胞的抗炎作用通过乙硫异烟胺处理得到改善(参见实施例3)。
[0053]
在本发明的另一个实施方案中，作为测量在炎症诱导的小胶质细胞和经乙硫异烟胺致敏的或未致敏的间充质干细胞共培养后，炎症细胞因子il-6和tnf-α的表达水平的结果，证实了与对照或乙硫异烟胺未致敏的组相比，在与经乙硫异烟胺致敏的间充质干细胞共培养的组中，对炎症细胞因子表达的抑制作用得到改善(参见实施例4)。
[0054]
在本发明的另一个实施方案中，作为在炎症诱导的小胶质细胞和经乙硫异烟胺致
敏的或未致敏的间充质干细胞共培养后测量nf-κb活性的结果，与对照或乙硫异烟胺未致敏的组相比，在与经乙硫异烟胺致敏的间充质干细胞共培养的组中，对nf-κb活性的抑制作用得到提高(参见实施例5)。
[0055]
在本发明的另一个实施方案中，作为用通过不同浓度的乙硫异烟胺处理间充质干细胞和测量多种生长因子和抗氧化因子的分泌量的结果，证实了旁分泌因子的表达水平与乙硫异烟胺的处理浓度成比例地增加(参见实施例6)。
[0056]
在本发明的另一个实施方案中，证实了乙硫异烟胺致敏的干细胞的体内作用。特别地，作为在将经乙硫异烟胺致敏或未致敏的间充质干细胞施用于痴呆小鼠模型的心室并随后提取脑组织之后进行的免疫染色或elisa的结果，证实了经乙硫异烟胺致敏的间充质干细胞具有减少淀粉样蛋白β、脑病和磷酸化tau蛋白的显著效果(参见实施例7至9)。
[0057]
因此，上述结果表明，通过乙硫异烟胺处理可以进一步提高人间充质干细胞的功效。
[0058]
包括在本发明的培养基中的乙硫异烟胺的浓度可以是但不限于1至200μm，优选50至200μm，更优选50至150μm。
[0059]
本文所用的术语“干细胞”是未分化的细胞，其具有自我复制能力和分化成两种或更多种不同类型细胞的能力。本发明的干细胞可以是自体的或同种异体的干细胞，可以来源于任何类型的动物(包括人和非人哺乳动物)，并且可以来源于成年动物或胚胎，但本发明并不限于此。
[0060]
在本发明中，来源于成年动物的成体干细胞可以是间充质干细胞(mesenchymal stem cell)、人组织源性间充质基质细胞、人组织源性间充质干细胞、多能干细胞或羊膜上皮细胞，优选地是间充质干细胞，但本发明并不限于此。间充质干细胞可以是来源于以下的间充质干细胞：脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜和胎盘，但本发明并不限于此。
[0061]
在本发明中，间充质干细胞的分离和培养可以通过本领域普通技术人员熟知的方法进行，并且对该方法没有限制，只要它可以使间充质干细胞增殖而不改变其特性同时保持干细胞特性即可。
[0062]
本发明中干细胞的增强的功效是指干细胞针对炎症性疾病或退行性脑部疾病的治疗特性和效果的改善，并且更具体地，根据nf-κb活性的降低提高一氧化氮、其相关因子或活性氧种类的产生的抑制，炎症细胞因子的表达的抑制，抗氧化和抗炎效果，以及提高表达诸如生长因子和抗氧化因子的旁分泌因子的功效。
[0063]
旁分泌因子更具体地是选自以下中的一种或多种：脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor；bdnf)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor；vegf)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1；igf-1)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor；hgf)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1；ho-1)、nad(p)h：醌氧化还原酶(nad(p)h:quinone oxidoreductase；nqo1)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit；gclc)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基(glutamate-cysteine ligase modifier subunit；gclm)，但本发明并不限于此。
[0064]
作为本发明的另一方面，本发明提供了增强干细胞功效的方法，其包括在培养基
组合物中培养干细胞。
[0065]
作为本发明的另一方面，本发明提供了制备具有增强功效的干细胞的方法，其包括在培养基组合物中培养干细胞。
[0066]
此外，本发明提供了通过上述方法制备的具有增强功效的干细胞。
[0067]
作为本发明的另一方面，本发明提供了抗炎组合物，其包括干细胞作为活性成分。
[0068]
作为本发明的另一方面，本发明提供了用于预防或治疗炎症性疾病或退行性脑部疾病的药物组合物，其包括干细胞作为活性成分。
[0069]
本文所用的术语“预防”是指通过施用根据本发明的药物组合物来抑制或延迟炎症性疾病或退行性脑部疾病的发作的所有作用。
[0070]
本文所用的术语“治疗”是指通过施用根据本发明的药物组合物来减轻或有益地改变炎症性疾病或退行性脑部疾病的症状所涉及的所有作用。
[0071]
本文所用的术语“炎症性疾病(inflammatory disease)”是以炎症为主要病变的疾病的通用术语，更优选地，在本发明中，炎症性疾病可以选自：皮炎、过敏、特应性、哮喘、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉痛、扁桃体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠炎、腹膜炎、骨髓炎、蜂窝组织炎、脑膜炎、脑炎、胰腺炎、中风、急性支气管炎、慢性支气管炎、痔疮、痛风、强直性脊柱炎、风湿热、狼疮、纤维肌痛(fibromyalgia)、银屑病性关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、感染性关节炎、关节周炎、腱炎、腱鞘炎、腱周围炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、干燥综合征(sjogren’s syndrome)、多发性硬化、以及急性和慢性炎症性疾病，但本发明并不限于此。
[0072]
本文所用的术语“退行性脑部疾病(degenerative brain disease)”是在随年龄发生的退行性疾病中的发生在大脑中的疾病，更优选地，本发明中的退行性脑部疾病可以选自：帕金森氏病、痴呆、阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆、亨廷顿氏病、中风、脑梗塞、皮克氏(pick)病、头部损伤、脊髓损伤、脑动脉硬化、卢伽雷氏病、多发性硬化、老年抑郁症和克雅氏病(creutzfeldt-jakob disease)，但本发明并不限于此。
[0073]
根据本发明的药物组合物可以包括通过乙硫异烟胺处理的具有增强功效的干细胞，并且还包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常被用于制剂中，包括盐水、蒸馏水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体等，但本发明并不限于此。如果需要，药物组合物还可以包括其它常规添加剂，其包括抗氧化剂，缓冲剂等。此外，通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂，药物组合物可以被配制为可注射形式，如水性溶液、乳状液或混悬液、丸剂、胶囊、颗粒或片剂。合适的药学上可接受的载体和它们的制剂可以使用在雷明顿的文献中所公开的方法根据每种成分来配制。本发明的药物组合物在剂型上并不受限制，因此可以被配制为注射剂、吸入剂或外用的皮肤制剂。
[0074]
本发明的药物组合物可以根据所期望的方法经口或肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)施用，并且优选经脑内施用，并且本发明的药物组合物的剂量可以根据患者的病况和体重、疾病的严重性、剂型、施用途径和持续时间由本领域普通技术人员适当地选择。
[0075]
本发明的药物组合物以药学上有效量施用。在本发明中，本文所用的“药学上有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理的益处/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量可以通
过参数来确定，所述参数包括患者疾病的类型、严重性、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和排泄率、治疗的持续时间和同时使用的药物、以及医学领域中熟知的其它参数。本发明的药物组合物可以被单独施用或与其它治疗剂组合施用，并且可以与常规治疗剂顺序或同时施用，或以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述参数，重要的是在没有副作用的情况下以最小剂量实现最大效果，并且此类剂量可以由本领域普通技术人员容易地确定。
[0076]
具体地，本发明的药物组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别、病况、体重、体内活性成分的吸收、失活率和排泄率、疾病类型以及联合使用的药物而改变，并且通常，每天或每隔一天、或一天一次至数次施用5
×
102个细胞至5
×
108个细胞/kg体重。对于多次施用，可以每周或每月进行施用。然而，有效量可以根据施用途径、肥胖的严重程度、性别、体重或年龄而增加或减少，因此不以任何方式限制本发明的范围。
[0077]
作为本发明的另一方面，本发明提供了预防或治疗炎症性疾病或退行性脑部疾病的方法，其包括向对象施用药物组合物。
[0078]
本文所用的术语“对象”是指需要治疗的靶标，更具体地，是指哺乳动物，诸如人或非人灵长类动物、小鼠(mouse)、大鼠(rat)、狗、猫、马或牛。
[0079]
此外，本发明提供了药物组合物用于预防或治疗炎症性疾病或退行性脑部疾病的用途。
[0080]
在下文中，为了帮助理解本发明，将提出示例性实施例。然而，提供以下实施例仅仅是为了更容易地理解本发明，而不是为了限制本发明。
实施例
[0081]
实施例1.人脐带间充质干细胞的制备
[0082]
在根据三星医疗中心的irb(irb#2015-09-023-003)批准的标准获得脐带之后，通过以下方法分离人脐带间充质干细胞。
[0083]
首先，将一块3至4cm的脐带组织片段化，并用胶原酶溶液(gibco，usa)处理60-90分钟以消化细胞外基质，然后用0.25％胰蛋白酶(gibco，usa)在37℃消化30分钟。随后，通过以下获得细胞：向所得产物添加胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)(biowest，usa)，然后在1000
×
g下离心10分钟，然后使用补充有10％fbs和50μg/ml庆大霉素(gibco，usa)的mem培养基(最小必需培养基，minimum essential media)(gibco,usa)在37℃、5％co2环境中培养，从而传代5或6次的间充质干细胞被用于实验。
[0084]
实施例2.经乙硫异烟胺致敏的人脐带间充质干细胞的制备
[0085]
将6
×
103个细胞/cm2的根据实施例1的方法制备的人脐带间充质干细胞接种在细胞培养容器中，同时，以50μm、100μm或150μm浓度的乙硫异烟胺处理，然后培养72小时。
[0086]
实施例3.经乙硫异烟胺致敏的干细胞抗炎作用的验证
[0087]
为了证实当用乙硫异烟胺处理间充质干细胞时，干细胞的抗炎作用是否得到改善，进行如下实验。具体而言，通过用lps(脂多糖，lipopolysaccharide)处理小胶质细胞bv2细胞来诱导炎症模型，并与经乙硫异烟胺致敏(primed)或未致敏的间充质干细胞(hmsc)共培养，随后测量一氧化氮(nitric oxide；no)、no相关因子和活性氧类的表达水平。
cysteine ligase catalytic subunit)和gclm(谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基，glutamate-cysteine ligase modifier subunit))的mrna表达水平。结果，如图4b中所示的，证实了通常在间充质干细胞中ho-1、nqo1、gclc和gclm基因的表达与处理的乙硫异烟胺浓度成比例地显著增加。
[0098]
这些结果表明，用乙硫异烟胺处理间充质干细胞提高了干细胞旁分泌因子的表达。
[0099]
实施例7.痴呆小鼠模型中经乙硫异烟胺致敏干细胞对淀粉样蛋白β减少效果的确认
[0100]
为了检查经乙硫异烟胺致敏的间充质干细胞实际上是否对退行性脑部疾病具有治疗作用，本发明发明人使用痴呆小鼠模型根据间充质干细胞的施用测量淀粉样蛋白β的表达水平。
[0101]
具体而言，在痴呆小鼠模型中，向小鼠心室施用经乙硫异烟胺致敏(primed)或未致敏的间充质干细胞(hmsc)，然后在施用后一周提取脑。用4％多聚甲醛(paraformaldehyde)固定提取的脑，然后处理以获得组织切片，并用抗淀粉样蛋白β的代表性抗体抗6e10处理组织切片进行免疫染色，然后用荧光显微镜观察组织。此外，定量荧光强度并绘制在图上。
[0102]
结果，如图5a中所示的，与对照组或与乙硫异烟胺未致敏的间充质干细胞共培养组相比，在与经乙硫异烟胺致敏的间充质干细胞共培养组中，淀粉样蛋白β的表达显著降低。
[0103]
此外，使用与上述相同的痴呆小鼠，将经乙硫异烟胺致敏或未致敏的间充质干细胞(hmsc)施用至小鼠的心室，并在施用后一周提取脑。随后，使用通过匀浆(homogenization)提取的脑获得的样品进行elisa以测量淀粉样蛋白β的水平。这里，组织样品被分离成可溶部分和不可溶部分以确认淀粉样蛋白β的水平。
[0104]
结果，如图5b中所示的，证实了与对照组或与乙硫异烟胺未致敏的间充质干细胞共培养的组相比，在与经乙硫异烟胺致敏的间充质干细胞共培养的组中，淀粉样蛋白β的表达显著降低。
[0105]
通过上述实验，可以看出，经乙硫异烟胺致敏的干细胞具有减少淀粉样蛋白β的作用，这表明干细胞通过减少退行性脑部疾病的病状而具有治疗作用。
[0106]
实施例8.痴呆小鼠模型中经乙硫异烟胺致敏干细胞对脑病减轻效果的确认
[0107]
基于在实施例7中获得的结果，旨在检查在痴呆小鼠模型中，经乙硫异烟胺致敏的干细胞是否具有减轻脑病的作用。为此，通过与图7中相同的方法，在痴呆小鼠模型中，将经乙硫异烟胺致敏或未致敏的间充质干细胞(hmsc)施用于小鼠心室，并在施用后一周提取脑，随后用4％多聚甲醛固定。随后，用针对gfap(胶质原纤维酸性蛋白，glial fibrillary acidic protein)脑病相关抗体处理通过处理脑组织获得的组织切片，用于免疫染色，然后使用荧光显微镜观察。此外，对荧光强度进行定量和比较。
[0108]
结果，如图6中所示的，与野生型小鼠(wt)相比，在完整的痴呆小鼠中，证实gfap表达显著增加。相反，当施用经乙硫异烟胺致敏或未致敏的间充质干细胞时，gfap表达降低，特别是，当施用经乙硫异烟胺致敏的间充质干细胞时，gfap表达以较高水平降低。
[0109]
从这样的结果可以看出，经乙硫异烟胺致敏的干细胞具有减轻脑病的作用。
[0110]
实施例9.痴呆小鼠模型中经乙硫异烟胺致敏干细胞的tau降低效果的确认
[0111]
此外，基于实施例7和8的结果，本发明发明人旨在检查在痴呆小鼠模型中，根据本发明的经乙硫异烟胺致敏干细胞是否具有降低tau蛋白的作用，所述tau蛋白是另一种病理症状。具体而言，在痴呆小鼠模型中，将经乙硫异烟胺致敏或未致敏的间充质干细胞(hmsc)施用于小鼠的心室，并在施用后两周提取脑，然后匀浆。然后，使用获得的脑组织样品进行elisa以测量tau蛋白的表达水平。这里，确认了具有磷酸化的tau蛋白的第181和231位苏氨酸(threonine)残基的tau的量。
[0112]
作为分析结果，如图7中所示的，与对照组或与乙硫异烟胺未致敏的间充质干细胞共培养的组相比，在与经乙硫异烟胺被致敏间充质干细胞共培养的组中，确认了磷酸化的tau的表达显著降低。
[0113]
本领域的普通技术人员应当理解，本发明的上述描述是示例性的，并且在不脱离本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本文所公开的示例性实施方案修改成其它具体形式。因此，上述示例性实施方案应当被解释为说明性的，而不是在任何方面进行限制。
[0114]
工业实用性
[0115]
已经证实，根据本发明的乙硫异烟胺增强干细胞的功效(如干细胞的抗炎作用和旁分泌作用)，并且通过痴呆模型中的实质性病变改善，经乙硫异烟胺致敏的干细胞展示了治疗作用，并且因此预期乙硫异烟胺和在各种功效中增强的经乙硫异烟胺致敏的干细胞可被用于各种领域，包括炎症性疾病和退行性疾病的治疗剂的开发。