泥鳅CDK1基因及其在不育多倍体泥鳅分子育种中的应用的制作方法

泥鳅cdk1基因及其在不育多倍体泥鳅分子育种中的应用
技术领域
1.本发明属于分子育种领域，涉及一种泥鳅细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶1(cyclin dependent kinase1,cdk1)基因，本发明还涉及该基因在不育多倍体泥鳅分子育种中的应用，以及一种利用crispr/cas9系统敲除多倍体泥鳅cdk1基因从而导致多倍体泥鳅不育的分子育种方法。


背景技术：

2.随着水产行业在国内的不断发展发展，在分子育种技术上不断取得新的进展，鱼类的品种越来越多样。随之带来的问题也越来越多，很多鱼类品种的泛滥导致自然基因的污染以及鱼类特有品种不能得到保护等。因此，运用现代生物技术定向改造鱼类，使其不能正常繁殖后代，防止自然繁殖导致鱼类品种和数量的泛滥将具有很大的发展前景。
3.crispr/cas9基因敲除系统是近年来迅速发展起来的基因编辑技术，其作为一种强大的研究工具已被广泛运用于多种模式生物的研究当中。细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶1(cyclin dependent kinase1,cdk1)是成熟促进因子(maturation-promoting factor,mpf)的催化亚基，而mpf是诱导卵母细胞减数分裂成熟的中心因素，在配子发育和性腺发育中起重要作用。cdk1基因主要在卵巢、脑、肝中表达，其中卵巢表达最高。在小鼠中敲除cdk1基因导致小鼠在胚胎发育过程中死亡，而通过条件敲除获得的小鼠可以存活，但其雌性不育，这表明cdk1在配子发育过程中具有重要作用。
4.因此，在分子育种领域中，利用crispr/cas9系统敲除鳅科鱼类cdk1基因导致多倍体鳅科鱼类不育的技术，将是一种具有重大意义的发明，且目前还没有出现相关研究的报道。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于提供一种泥鳅cdk1基因，本发明的第二个目的在于提供所述cdk1基因在不育多倍体泥鳅分子育种中的应用，本发明的第三个目的在于提供一种利用crispr/cas9系统敲除多倍体泥鳅的cdk1基因，从而产生不育多倍体泥鳅的分子育种方法。
6.本发明通过以下内容实现：
7.1、泥鳅cdk1基因序列信息的确定：
8.①
首先，使用rnaiso plus试剂提取泥鳅卵巢总rna，再使用逆转录试剂盒体外合成第一链cdna。
9.②
从ncbi数据库中获取斑马鱼等鱼类cdk1基因全长cdna序列，然后进行多重比对，读取这些鱼类氨基酸序列的保守区域并设计合成1对简并引物，用于克隆泥鳅cdk1基因核心片段，回收产物送公司测序，得到其序列信息。
10.③
使用smart race cdna amplification kit试剂盒，参照试剂盒推荐方法合成5’、3
’‑
race cdna第一链。再在
②
步骤中得到的核心片段序列上设计race引物，分别以5’、3’‑
race cdna第一链为模板，克隆泥鳅cdk1基因5’和3’末端片段，回收产物送公司测序，得到其序列信息。
11.④
拼接得到泥鳅cdk1基因全长序列信息。该基因全长序列如seq id no：1所示。
12.2、crispr/cas9靶位点设计及确认：
13.在泥鳅cdk1基因的orf序列上，按照crispr/cas9敲除原理，设计cdk1基因敲除靶位点。靶位点通式为：5
’‑
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-ngg-3’(n为任意碱基)，尽量在orf前端设计。同时在靶位点周围300-500bp大小范围内设计引物进行pcr扩增，扩增产物直接送测序。要求：
①
正反向引物距离靶位点处至少80bp。
②
pcr条带清晰，无杂带。
③
测序结果与设计的靶位点序列相同，且测序峰图显示为单峰。泥鳅cdk1基因靶位点序列信息如seq id no：2所示。
14.3、cas9mrna和grna的制备：
15.以纯化后的线性化cas9质粒(psp6-2snls-spcas9 vector)为模版，进行体外转录得到cas9mrna，将其纯化后于-80℃保存，保存浓度为900ng/μl。设计含有cdk1基因靶位点序列的上游引物及与其匹配的下游引物，以泥鳅cdna为模版进行pcr扩增，再以纯化后的产物为模版，进行体外转录得到grna，将其纯化后于-80℃保存，保存浓度为1200ng/μl。含有cdk1基因靶位点序列的上游引物如seq id no：3所示，与其匹配的下游引物如seq id no：4所示。
16.4、体外显微注射：
17.注射前一天晚上，挑选3对发育较好的四倍体泥鳅，进行人工催产，人工催产药物的剂量为每kg雌亲鱼注射lrh-a
2 40ug、dom 4mg，雄鱼减半。然后将亲本置于水温为28℃的水中静养。第二天早上即可进行人工授精，获得受精卵后将其排列在显微注射专用培养皿上，用显微注射仪对到达1细胞期的受精卵进行显微注射。之后将注射完毕的受精卵置于28℃曝气水中进行孵化培育。cas9mrna的终浓度为550ng/μl，grna的终浓度为40ng/μl，每次注射的量为2.5nl，注射部位为动物极。
18.5、cdk1基因敲除鱼的筛选：
19.在步骤4中得到的受精卵孵化出膜之后，取仔鱼提取基因组dna，进行pcr扩增，产物送公司测序，对结果进行比对，确定是否敲除成功。
20.6、不育多倍体泥鳅的获得：
21.将步骤5中得到的cdk1基因敲除鱼养殖一个月左右，筛选出敲除成功的鱼进行养殖即可。
22.本发明具有以下优点：
23.1、cdk1基因敲除成功的鱼均为性腺发育停滞或发育异常的多倍体泥鳅个体，属于不育多倍体泥鳅，本发明能防止自然繁殖导致鱼类品种和数量的泛滥，而且性腺发育的停滞有利于提高鱼类的生长性能，促进鱼类体质量的快速生长，能够提高泥鳅养殖的经济效益。筛选出来的突变体进行养殖即可获得不育多倍体泥鳅，简单高效，周期短。
24.2、本发明敲除效率较高，共存注射500余颗受精卵，仅50颗死亡，150尾测序结果为野生型，300尾为突变型，突变率超过60％。
附图说明
25.图1是cdk1基因敲除多倍体泥鳅的测序结果。
26.图2是野生四倍体泥鳅(wt-4n)、四倍体泥鳅突变体(mu-4n)f0代的性腺发育解剖观察对比照片。
具体实施方式
27.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
28.实施例1泥鳅cdk1基因的获得
29.1、泥鳅卵巢总rna的提取
30.使用takara公司rnaiso plus试剂进行泥鳅总rna的提取，具体步骤如下：
31.1)提取rna所用器皿：剪刀、镊子均要用depc处理过夜；所用到的水为takara公司购买的rnase-free water；离心ep管，各型号枪头为提rna专用的进口枪头。注意：提取总rna过程中要及时佩戴口罩，手套。实验前将取样器械置于冰上预冷；
32.2)取雌性泥鳅实施安乐死，快速取出卵巢组织，并取30mg-50mg组织样品于2ml离心管中，离心管置于冰浴，事先加入1.5ml rnaiso plus试剂，3颗经depc水浸泡过夜并高压灭菌处理的氧化锆珠。加好后使用组织破碎仪破碎至呈无颗粒透明状即可；
33.3)向上述匀浆裂解液中加入氯仿，用量为rnaiso plus试剂体积的1/5，盖上离心盖，用手剧烈震荡15s，待充分乳化后，再室温静置5min；
34.4)将离心管移至低温高速离心机，12000r/min、4℃离心15min；
35.5)由离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，无色上清液，中间白色蛋白质层及带有鲜红颜色的下层有机层，吸取上清液到另一新离心管中；
36.6)向上清液中加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温条件下静置10min；
37.7)于低温离心机中，12000r/min离心批评，试管底部会出现沉淀；
38.8)rna沉淀的清洗：小心弃去上清液，缓慢地沿管壁加入75％乙醇溶液1ml，轻轻颠倒混匀洗涤管壁，12000r/min、4℃离心5min后小心弃去乙醇；
39.9)于超净工作台中室温干燥沉淀2-5min，加入10-20μl rnase-free water溶解沉淀；
40.10)将充分溶解的rna样品取1-2μl，用1-2％琼脂糖凝胶电泳检测rna的提取结果；
41.11)将充分溶解的rna样品取1-2μl，用紫外分光光度计检测rna浓度与纯度。
42.2、cdna第一链的合成
43.1)cdna第一链的合成使用逆转录试剂盒1st strand cdna synthesis kit(takara，日本)；记录由紫外分光光度计测定的rna样品浓度。
44.2)在提取rna专用离心管中配制10μl如下反应体系：
[0045][0046]
3)将该反应体系置于pcr仪上42℃2min后，冰上急冷。
[0047]
4)另取提取rna专用离心管中配制10μl如下反应体系：
[0048][0049][0050]
5)混合均匀，置于pcr仪运行程序：37℃15min；85℃5s；4℃停止。
[0051]
3、cdna基因核心区序列引物设计
[0052]
由ncbi数据库中获取斑马鱼等鱼类cdk1基因全长cdna序列，后进行多重比对，读取这些鱼类氨基酸序列的保守区域并设计合成1对简并引物：
[0053]
f：acttyaccakcccktactsggactggc
[0054]
r：atgtcttcmgtgyaggggbccgccaacg
[0055]
预期pcr产物片段大小为500bp左右。经合成的引物12000r充分离心，后用去离子双蒸水(ddh2o)将引物溶解至浓度为20μmol/l，置于-20℃条件下保存备用。
[0056]
4、cdk1核心片段的pcr扩增
[0057]
1)配制如下60μl pcr反应体系：
[0058][0059]
2)将反应体系混匀，离心后置于pcr仪上，进行pcr反应。cdk1基因核心片段pcr扩增条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸10min。注意：配制反应体系时必须在冰上进行。
[0060]
3)pcr纯化产物与pmd-19t载体的连接，小型离心管中10μl反应体系如下：
[0061]
纯化pcr产物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
4μl
[0062]
pmd19-t载体
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μl
[0063]
solution
ⅰꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5μl
[0064]
4)将该10μl体系混合均匀，置于pcr仪上，设置程序16℃30min反应，取全部反应产物转化入dh5α(100μl)感受态细胞中，涂布于lb/amp平板上，37℃倒置培养过夜；挑取单菌落置于5ml lb/amp液体培养基中，37℃/180rpm振荡培养10-12h至菌液浑浊；取500μl菌液测序送往武汉擎科生物有限公司，使用abi prismtm全自动荧光测序仪完成序列测定，测序要求为双向测序，并进行校对与拼接，得到泥鳅cdk1基因核心序列。
[0065]
5、泥鳅cdk1基因5’、3
’‑
race cdna的合成
[0066]
1)5
’‑
race引物的设计
[0067]
根据步骤4中克隆得到的cdk1基因cdna核心序列，使用smart race cdna amplification kit(clontech,usa)试剂盒，按照试剂盒说明设计5
’‑
race上游引物如下：
[0068]5’
端的扩增：
[0069]
outer1：cattgcttgccgtgctgaaatcctc
[0070]
iner1：ccgagagtggcaaaacagaatcccc
[0071]
下游引物upm(通用混合引物universal primer mix)、nup(upm的嵌套引物nested universal primer)由试剂盒提供。
[0072]
2)cdk1基因cdna 5’末端
[0073]
使用smart race cdna amplification kit(clontech,usa)试剂盒，进行5
’‑
race pcr扩增(使用巢式引物扩增)，1st pcr反应体系(10μl体系)如下:
[0074][0075]
pcr扩增反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。
[0076]
嵌套pcr反应(60μl)体系：
[0077][0078]
pcr扩增反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。
[0079]
3)5
’‑
race pcr产物的pmd-19t载体克隆
[0080]
将5
’‑
race pcr产物按照步骤4中的操作步骤进行pmd-19t载体克隆，最后将阳性克隆送往武汉擎科生物有限公司进行测序，得到cdk1基因cdna 5’末端序列信息。
[0081]
4)再按照上述方法得到cdk1基因cdna3’末端序列信息。其中，3
’‑
race上游引物如
下：
[0082]3’
端的扩增：
[0083]
outer2：acgaaacacacaaggcaaccgcg
[0084]
iner2：gtacgcctgctggatgttctgatgc
[0085]
1st pcr反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。嵌套pcr 94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。
[0086]
6、泥鳅cdk1基因序列信息的确定
[0087]
将步骤4和步骤5中得到的序列拼接，得到泥鳅cdk1基因全长序列信息。该基因全长序列如seq id no：1所示。
[0088]
实施例2基因的敲除及不育多倍体泥鳅的育种
[0089]
1、crispr/cas9靶位点设计及确认
[0090]
根据靶位点通式：5
’‑
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-ngg-3’(n为任意碱基)及靶位点基本设计原则，在泥鳅cdk1基因的orf序列上，设计cdk1基因靶位点。设计靶位点序列信息如seq id no：2所示。同时在靶位点周围设计如下正反引物进行pcr扩增，f：gaaggtaagtcgtttgtcataag
[0091]
r：ggagtccaggtattttttcag
[0092]
体系如下：
[0093][0094][0095]
pcr扩增反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃额外延伸10min。
[0096]
得到扩增产物序列信息，然后和靶位点序列比较，发现结果相同，说明靶位点可用，可以进行下一步。
[0097]
2、grna的制备
[0098]
首先，设计含有cdk1基因靶位点序列的grna上游引物及与其匹配的下游引物：
[0099]
f：ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt
[0100]
r：ctaatacgactcactatagggc
[0101]
在灭菌pcr管中配制如下反应体系：
[0102][0103]
pcr扩增反应条件为:94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃额外延伸10min。
[0104]
再利用axygen公司的axyprep pcr清洁试剂盒对产物进行清洗回收，主要步骤如下：
[0105]
1)在pcr产物中加150μl的buffer pcr-a；
[0106]
2)混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2ml离心管(试剂盒内提供)中，12,000
×
g离心1min，弃滤液；
[0107]
3)将制备管置回2ml离心管，加700μl buffer w2，12,000
×
g离心1min，弃滤液；
[0108]
4)将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加25μleluent，室温静置1min。12,000
×
g离心1min洗脱回收dna。
[0109]
然后利用ambion公司的t7kit试剂盒对洗脱回收dna进行体外转录，主要步骤如下：
[0110][0111]
1)将上述试剂加入灭菌ep管中，37℃水浴1h，然后加入1μl turbo dnase，37℃水浴15min以去除dna模板，最后用ambion公司的mirvana
tm
mirna isolation kit进行回收，步骤如下：
[0112]
用rnase-free water将grna转录体系稀释到300μl，加入330μl无水乙醇；
[0113]
2)将溶液加到回收柱中，10000g离心15s；
[0114]
3)加入700μl的mirna wash solution i，离心10s；
[0115]
4)加入500μl的wash solution ii，离心10s；重复一次；
[0116]
5)弃去收集管中的液体，离心1min，去除残余的液体；
[0117]
6)加入适量95℃预热的rnase-free water，最大转速离心30s，收集得到grna溶液，测得浓度为1210ng/μl，零下80℃保存。
[0118]
3、cas9mrna的制备
[0119]
通过xbai单酶切线性化psp6-2snls-spcas9载体(37℃水浴，4h以上)，取少量电泳确认线性化完全后，直接回收线性化产物。以纯化后的线性化cas9质粒为模版，进行体外转录得到cas9mrna，将其纯化后于-80℃保存。保存浓度为900ng/μl。纯化回收和体外转录同步骤2。
[0120]
4、体外显微注射
[0121]
注射前一天晚上，挑选3对发育较好的四倍体泥鳅，进行人工催产，人工催产药物的剂量为每kg雌亲鱼注射lrh-a
2 40ug、dom 4mg，雄鱼减半。然后将亲本置于水温为28℃的黑暗环境中静养。第二天早上即可进行人工授精，获得受精卵后将其置于显微注射专用培养皿上，用显微注射仪对1细胞期的受精卵进行显微注射。之后将注射完毕的受精卵置于28℃恒温箱进行孵化培育。cas9mrna的终浓度为550ng/μl，grna的终浓度为40ng/μl，每次注射的量为2.5nl，注射部位为动物极。
[0122]
5、cdk1基因敲除鱼的筛选
[0123]
受精卵孵化出膜后，随机选取5尾仔鱼，分别提基因组dna进行pcr扩增后送公司测序，根据测序结果在靶位点上出现双峰即为敲除成功的个体。结果如图1所示。养殖一个月后进行筛选，最后统计发现，共存注射500余颗受精卵，50颗死亡，150尾测序结果为野生型，300尾为突变型，突变率超过60％。
[0124]
6、不育多倍体泥鳅的鉴别
[0125]
上述突变体发育成熟后进行性腺发育的解剖观察。结果如图2所示，所有个体性腺发育明显停滞或发育异常，属于不育泥鳅多倍体。
[0126]
7、能够稳定的不育多倍体泥鳅的获得
[0127]
将得到的cdk1基因敲除鱼养殖一个月左右，筛选出敲除成功的鱼进行养殖即可。
[0128]
综上所述，本发明是一种简单，高效，周期短，易实施的分子育种技术。不育多倍体泥鳅的获得有利于减少生殖生长，增加其个体生长速度。且该技术只是破坏本身基因功能，不涉及外来基因，不存在转基因问题，便于推广运用。