梨S基因型鉴定方法及其配套试剂盒与流程

梨s基因型鉴定方法及其配套试剂盒
技术领域
1.本发明属于植物分子育种领域，涉及一种梨s基因型快速鉴定的方法以及配套试剂盒与其在梨授粉树品种选配中的应用。


背景技术：

2.梨是世界上最重要的水果之一，在中国也是仅次于苹果和柑橘的第三大类水果。梨(pyrus spp.)属于蔷薇科，表现出典型的配子体自交不亲和性，该反应是由单一位点上(s位点)的复等位基因所控制的，该性状是由单一位点(s
‑
locus)上的分别控制花柱和花粉特异性的复等位基因(s
‑
allele)所决定的。其中，控制花柱自交不亲和性的决定因子被确定为s
‑
核酸酶基因，而花粉决定因子则可能是由slf基因(s
‑
locus f
‑
box)/sfb基因(s
‑
haplotype
‑
specific f
‑
box)控制的(sassa et al.,1992,1997；nettancourt1992；okada et al.,2011；ushijima et al.,2003)。主要表现为：当梨树自花授粉或者与其s基因相同的品种授粉时，花粉管会在花柱中停止生长，最终导致受精失败，继而导致低的坐果率甚至无法坐果。
3.中国是梨属植物的发源地之一，拥有大约3000多个梨品种，但其中大部分品种都表现出自交不亲和性，只有极少品种表现出自交亲和性，这就使得在实际的生产栽培中需要为主栽品种配置合适的授粉树，所以提前知晓二者的s基因型能有效避免盲目选择授粉树而造成不必要的损失。据统计目前已经有接近500个梨品种的s基因被鉴定出来，但随着近些年越来越多新品种不断的被选育出来，目前已经鉴定出来的梨品种的s基因型远远不能满足实际生产的需要。
4.最初，人们鉴定s基因型主要通过田间授粉实验，花粉管生长试验，pcr
‑
rflp，以及基因芯片杂交等方法鉴定来不同梨品种的s基因型(hiratsuka et al.,1998；ishimizu et al.,1999；heng et al.,2008；shi et al.,2018；nashima et al.,2015；sanzol,2009；jiang et al.,2017)，但这些方法是存在诸如：技术要求高，成本高，以及耗时长等的缺点，不适合大批量和快速鉴定梨的s基因型。本发明为目前已经鉴定出来的29个梨s基因设计了29对特异引物，可以用于不同梨品种的s基因型的鉴定。


技术实现要素：

5.本发明提供一组用于鉴定梨s基因型的引物组、试剂盒及其应用。
6.本发明的另一目的在于提供一种鉴定梨s基因型的方法及其应用。
7.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
8.一组用于鉴定梨s基因型的引物组，该引物组包含(1)
‑
(29)所示的引物对中的至少两对：
9.(1)s1‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.1和seq id no.2所示的核苷酸片段组成的引物对；
10.(2)s2‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.3和seq id no.4所示的核苷酸片段
组成的引物对；
11.(3)s3‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.5和seq id no.6所示的核苷酸片段组成的引物对；
12.(4)s4‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.7和seq id no.8所示的核苷酸片段组成的引物对；
13.(5)s5‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.9和seq id no.10所示的核苷酸片段组成的引物对；
14.(6)s7‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.11和seq id no.12所示的核苷酸片段组成的引物对；
15.(7)s8‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.13和seq id no.14所示的核苷酸片段组成的引物对；
16.(8)s
12
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.15和seq id no.16所示的核苷酸片段组成的引物对；
17.(9)s
13
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.17和seq id no.18所示的核苷酸片段组成的引物对；
18.(10)s
15
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.19和seq id no.20所示的核苷酸片段组成的引物对；
19.(11)s
16
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.21和seq id no.22所示的核苷酸片段组成的引物对；
20.(12)s
17
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.23和seq id no.24所示的核苷酸片段组成的引物对；
21.(13)s
19
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.25和seq id no.26所示的核苷酸片段组成的引物对；
22.(14)s
21
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.27和seq id no.28所示的核苷酸片段组成的引物对；
23.(15)s
22
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.29和seq id no.30所示的核苷酸片段组成的引物对；
24.(16)s
28
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.31和seq id no.32所示的核苷酸片段组成的引物对；
25.(17)s
29
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.33和seq id no.34所示的核苷酸片段组成的引物对；
26.(18)s
32
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.35和seq id no.36所示的核苷酸片段组成的引物对；
27.(19)s
35
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.37和seq id no.38所示的核苷酸片段组成的引物对；
28.(20)s
37
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.39和seq id no.40所示的核苷酸片段组成的引物对；
29.(21)s
38
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.41和seq id no.42所示的核苷酸片段组成的引物对；
30.(22)s
39
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.43和seq id no.44所示的核苷酸片段组成的引物对；
31.(23)s
41
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.45和seq id no.46所示的核苷酸片段组成的引物对；
32.(24)s
42
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.47和seq id no.48所示的核苷酸片段组成的引物对；
33.(25)s
51
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.49和seq id no.50所示的核苷酸片段组成的引物对；
34.(26)s
57
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.51和seq id no.52所示的核苷酸片段组成的引物对；
35.(27)s
64
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.53和seq id no.54所示的核苷酸片段组成的引物对；
36.(28)s
65
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.55和seq id no.56所示的核苷酸片段组成的引物对；
37.(29)s
67
‑
rnase基因的引物对：由如seq id no.57和seq id no.58所示的核苷酸片段组成的引物对。
38.一种用于鉴定梨s基因型的试剂盒，该试剂盒中包含上述的引物组。
39.上述引物组中的所有引物对浓度稀释到10μm,每个引物对的上下游引物等量混合制成引物预混液，一共29管，便于pcr体系的配置。
40.上述试剂盒中还包括，灭菌的去离子水，2
×
taq master mix。
41.一种鉴定梨s基因型的方法，该方法以待鉴定梨品种的基因组dna为扩增模板，采用上述引物组中的引物对分别进行pcr扩增，根据扩增产物的有无以及大小确定待鉴定梨品种的s基因型。
42.上述的根据扩增产物的有无以及大小确定待鉴定梨品种的s基因型的方法为：检验所述的引物对是否以待鉴定梨品种的基因组dna为模板扩增得到预期的核苷酸片段；如果所述扩增梨s1‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s1‑
rnase基因，如果所述扩增梨s2‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s2‑
rnase基因，如果所述扩增梨s3‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s3‑
rnase基因，如果所述扩增梨s4‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s4‑
rnase基因，如果所述扩增梨s5‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s5‑
rnase基因，如果所述扩增梨s7‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s7‑
rnase基因，如果所述扩增梨s8‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s8‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
12
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
12
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
13
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
13
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
15
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
15
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
16
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
16
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
17
‑
rnase基因的引物对扩增得
到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
17
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
19
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
19
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
21
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
21
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
22
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
22
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
28
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
28
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
29
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
29
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
32
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
32
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
35
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
35
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
37
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
37
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
38
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
38
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
39
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
39
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
41
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
41
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
42
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
42
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
51
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
51
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
57
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
57
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
64
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
64
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
65
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
65
‑
rnase基因，如果所述扩增梨s
67
‑
rnase基因的引物对扩增得到预期的核苷酸片段，则所述待鉴定梨品种含有s
67
‑
rnase基因，该待鉴定梨品种含有的所有s
‑
rnase基因的组合即为该梨品种的s基因型。
43.为了确定上述结果的可靠性，还要进一步检测每个引物对扩增出来的片段大小，如若s1基因的引物对扩增出的片段大小为643bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s2基因的引物对扩增出的片段大小为1204bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s3基因的引物对扩增出的片段大小为966bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s4基因的引物对扩增出的片段大小为944bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s5基因的引物对扩增出的片段大小为743bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s7基因的引物对扩增出的片段大小为611bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s8基因的引物对扩增出的片段大小为580bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
12
基因的引物对扩增出的片段大小为805bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
13
基因的引物对扩增出的片段大小为515bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
15
基因的引物对扩增出的片段大小为1002bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型。如若s
16
基因的引物对扩增出的片段大小为524bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
17
基因的引物对扩增出的片段大小为600bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
19
基因的引物对扩增出的片段大小为588bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
21
基因的引物对扩增出的片段大小为612bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
22
基因的引物对扩增出的片段大小为406bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
28
基因的引物对扩增出的片段大小为
612bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
29
基因的引物对扩增出的片段大小为335bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
32
基因的引物对扩增出的片段大小为671bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
35
基因的引物对扩增出的片段大小为574bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
37
基因的引物对扩增出的片段大小为581bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
38
基因的引物对扩增出的片段大小为854bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
39
基因的引物对扩增出的片段大小为632bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
41
基因的引物对扩增出的片段大小为509bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
42
基因的引物对扩增出的片段大小为744bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
51
基因的引物对扩增出的片段大小为424bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
57
基因的引物对扩增出的片段大小为216bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
64
基因的引物对扩增出的片段大小为624bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
65
基因的引物对扩增出的片段大小为434bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型，如若s
67
基因的引物对扩增出的片段大小为610bp，则待鉴定梨品种的含有该s基因型。
44.上述的待鉴定梨品种的基因组dna是以待鉴定梨品种幼嫩叶片为材料利用ctab的方法提取得到的。
45.本发明所述的引物组、试剂盒以及方法可用于自交不亲和梨品种授粉树的选配以及杂交育种中父母本的合理选配。利用上述引物组、试剂盒或方法鉴定出不同梨品种的s基因型，选择与梨园主栽品种或者杂交父本或者母本s基因型不同梨品种作为授粉树或者杂交的父母本。
46.上述的引物组或上述的试剂盒在为自交不亲和梨品种选配授粉梨品种中的应用。
47.上述的方法在为自交不亲和梨品种选配授粉梨品种中的应用。
48.上述的应用，确定梨品种的s基因型，含有不同s基因型且所含s基因均不相同的梨品种可互为授粉梨品种。
49.本发明的有益效果：
50.本发明分析了梨中已经报道的29个s基因型，根据这些基因的一级结构，在他们的特异区域设计出每个s基因的特异引物，并以此建立了pcr扩增体系，以待测不同梨品种的基因组dna为模板，分别用29对特异引物去分析扩增结果并确定各个待测梨品种的s基因。我们将这些引物对配制成预混液，并搭配市场上廉价的taq酶预混液，以及灭菌的去离子水，共同组成配套的梨s基因检测试剂盒，方便使用，且操作简便，能快简单快速的鉴定出未知梨品种的s基因型，并可根据鉴定的结果配置合适的授粉树，为梨杂交育种中亲本选配提供依据。
附图说明
51.图1为梨不同s
‑
rnase基因特异引物对pcr扩增结果1％琼脂糖凝胶电泳图。
52.图2为梨s
‑
rnase基因特异引物对pcr扩增鉴定不同梨品种的s基因的应用实例结果。
53.图3为对所鉴定的品种进行自交和相互授粉实验分析结果。
具体实施方式
54.实施例1不同梨品种的s基因鉴定
55.(1)梨29个s基因特异片段的pcr扩增
56.发明人对大量梨品种进行研究，共鉴定出了29个不同的s基因，并根据每个s基因的序列特异区设计特异引物对，对应的序列以及预期扩增的片段大小如表1所示。
57.利用上述引物从发明人通过其他方法鉴定得到的完整s基因型的梨品种中扩增这29个s基因的特异片段，从梨品种大果黄花(s1s2)中扩增出s1,s2基因特异片段，从梨品种雪英(s3s
39
)中扩增出s3,s
39
基因特异片段，从梨品种珲春山梨(s5s
64
)中扩增出s5,s
64
基因特异片段，从梨品种静秋(s3s7)中扩增出s3,s7基因特异片段，从梨品种宁霞(s4s8)中扩增出s4,s8基因特异片段，从梨品种红脆(s4s
12
)中扩增出s4,s
12
基因特异片段，从梨品种雁山黄皮消(s3s
13
s
17
)中扩增出s3,s
13
，s
17
基因特异片段，从梨品种汉源白梨(s1s
15
)中扩增出s1,s
15
基因特异片段，从梨品种建瓯八月雪(s4s
14
s
65
)中扩增出s4,s
14
，s
65
基因特异片段，从梨品种蒲瓜梨(s
19
s
65
)中扩增出s
19
,s
65
基因特异片段，从梨品种寒露(s4s
21
s
22
)中扩增出s4,s
21
，s
22
基因特异片段，从梨品种他西阿木特(s
19
s
28
)中扩增出s
19
,s
28
基因特异片段，从梨品种历城木梨(s
29
s
37
)中扩增出s
29
,s
37
基因特异片段，从梨品种梧洋豆梨(s
16
s
38
)中扩增出s
16
,s
18
基因特异片段，从梨品种建宁野山梨(s
41
s
59
)中扩增出s
41
,基因特异片段，从梨品种滇梨(s
42
s
67
)中扩增出s
42
,s
67
基因特异片段，从梨品种高淳豆梨(s
51
s
57
)中扩增出s
51
,s
57
基因特异片段，从梨品种孙吴山梨1号(s
32
s
106
)中扩增出s
32
基因特异片段。
58.利用ctab法从各个梨品种幼嫩的叶片中提取基因组dna，并以他们为pcr反应的模板，使用表1中的特异引物对进行pcr扩增，20μl pcr体系包括：10μl 2
×
taq rapid master mix，2μl不同s基因引物预混液，1μl dna模板(100ng/μl)，用无菌去离子水补齐至20μl。扩增程序为95℃预变性5min；94℃变性15s，退火30s(退火温度见表1)，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃彻底延伸5min。
59.上述pcr扩增结束后，取8μl的产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测其大小，如图1所示，每对s基因的特异引物对都能从含有对应s基因的梨品种中扩增出来，而且大小与表1预期的相一致。
60.(2)梨s基因鉴定
61.以表2中的18个梨品种为研究对象来说明该发明的方法及其配套试剂盒的应用效果：按照上述方法分别提取上述梨品种的基因组dna，以此为pcr反应的模板，按照上述的方法进行pcr扩增，反应结束后，取8μl的产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测其条带的有无及大小。根据图2的扩增结果可以判断这18个梨品种的s基因：大果黄花的基因型为s1s2，雪英的基因型为s3s
39
，珲春山梨的基因型为s5s
64
，静秋的基因型为s3s7，宁霞的基因型为s4s8，红脆的基因型为s4s
12
，燕山黄皮消的基因型为s3s
13
s
17
，汉源白梨的基因型为s1s
15
，建瓯八月雪的基因型为s4s
16
s
65
，蒲瓜梨的基因型为s
19
s
65
，寒露梨的基因型为s4s
21
s
22
，他西阿木特的基因型为s
19
s
28
，历城木梨的基因型为s
29
s
37
，梧样豆梨的基因型为s
16
s
38
，建宁野山梨的基因型为s
41
s
59
，滇梨的基因型为s
42
s
67
,高淳豆梨的基因型为s
51
s
57
,孙吴山梨一号的基因型为s
32
s
106
与先前发明人用其他方法鉴定的结果一致。进一步确定了这些梨品种的s基因型。相互之间含有不同s基因的梨品种，他们之间可以相互作为授粉树以及杂交育种中的亲本，既保证了稳定的坐果率又保证了育种的成功进行。
62.对上述鉴定的品种进行自交和相互授粉实验分析，结果表明s基因相同梨品种之间进行传粉，花粉管在花柱中部停止生长，进而无法完成受精过程，结果与上述方法鉴定结果得到的结论相一致(图3)。
63.表1.梨s基因特异引物对
64.65.[0066][0067]
表2.待测梨品种信息
[0068][0069]
主要参考文献
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‑
incompatibility
‑
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‑
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‑
specific self
‑
compatiblemutation caused by deletion of the s
‑
rnase gene in japanese pear(prunus serotina).plant j.12,223
‑
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[0072]
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yasuda,t.,2011.related polymorphic f
‑
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‑
rnase of japanese pear.j exp bot.62,1887
‑
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