一种同时表达经典株和变异株传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗的制作方法

一种同时表达经典株和变异株传染性法氏囊病毒vp2蛋白的重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗
技术领域
1.本发明涉及一种同时表达经典株和变异株传染性法氏囊病毒vp2蛋白的重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗，属于兽用生物制品领域。


背景技术：

2.传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus，ibdv)主要感染对象为3-6周龄的雏鸡，感染后导致鸡的免疫器官严重受损，使机体产生免疫抑制，最终导致雏鸡死亡。传染性法氏囊病(infectious bursal disease，ibd)导致的高死亡率使全球的养禽业遭受了严重的经济损失，与鸡新城疫病、鸡马立克氏病并列为三大危害家禽健康的传染病。
3.ibdv有两种血清型，引发ibd的主要为血清i型。血清i型ibdv分为经典株、超强株、减毒株和变异株4个分支。ibdv新型变异株引起的非典型ibd的危害不容忽视。虽然ibdv新型变异株致死率低，但因引起的不可逆的法氏囊损伤和其严重的免疫抑制，导致鸡群免疫力低下，增加了其他病原的感染几率，影响鸡群的生长，导致体重下降、均匀度变差、料肉比升高等，严重影响了经济效益。另一方面，ibdv新型变异株会干扰其它重要疫病疫苗的免疫效果。有报道显示，禽流感h5/h7二联疫苗的抗体产生会被ibdv新型变异株的感染干扰。我国新流行的ibdv变异株属于ibdv新型变异株。
4.血清i型的ibdv有四种病毒蛋白质，分别为vp1、vp2、vp3和vp4，4种蛋白质的分子量分别约为90-92kd，41-48kd，32kd和28-32kd。研究显示ibdv新型变异株与超强株vvibdv存在不同的单抗反应谱，vp2的318和323位氨基酸突变是ibdv新型变异株逃匿vvibdv抗体中和活性的关键因素之一，导致部分免疫vvibdv的疫苗的鸡群依旧感染ibdv新型变异株，是导致ibdv新型变异株在全国范围内流行的重要原因。
5.vp2是ibdv主要的结构蛋白，同时也是主要的保护性抗原。vp2蛋白可变区的两个疏水基团赋予ibdv构象依赖性和高度疏水性，它可以诱导宿主机体产生中和抗体，还与病毒的细胞嗜性、病毒毒性等有关。vp2蛋白与毒力相关的表位位于可变区内，有研究报道其第253，279，284位氨基酸是影响ibdv毒力的关键位点。因此，如何保证vp2刺激机体产生的抗体能够抵抗不同的流行毒株成为了一个亟待解决的难题。
6.大肠杆菌的不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin，lt)和霍乱弧菌的霍乱毒素(cholerae entertoxin，ct)是已知的有效的粘膜免疫佐剂，lt的b亚单位主要识别肠粘膜上皮细胞膜的受体神经节苷脂gm1，并与之结合形成复合物，本身不具有毒性。故ltb作为粘膜佐剂研究中表现出高活性及无毒性受到广泛关注表明ltb能够有效的促进和提升机体的特异性免疫应答。专利号为cn102688487a将鸡ibdv超强毒的vp2蛋白与具有粘膜免疫佐剂大肠杆菌ltb蛋白融合表达，表达产物乳化制备疫苗，结果各疫苗免疫组均能抵抗强毒攻击，具有良好的免疫原性。
7.火鸡疱疹病毒(turkey herpesvirus，hvt)为马立克氏病毒(marek’s disease，
mdv)其中的一种α疱疹病毒，因其与mdv抗原相关性，同时又由于hvt与mdv有明显区别对鸡无致病性，被广泛用作预防马立克氏病(md)的活疫苗。因此如何能够以火鸡疱疹病毒(hvt)为载体进行鸡传染性法氏囊病(ibd)的活疫苗研究成为一项重要的研究方向。
8.疫苗接种是预防、控制甚至消灭鸡传染性法氏囊病的主要措施之一。以火鸡疱疹病毒作为载体表达vp2蛋白。安全性较好，一次接种终生免疫，产生的免疫应答可以与野毒感染相区分，有利于疫病的控制和消灭。
9.因此研制一种生产成本低、生产效率高以及疫苗免疫效果好的传染性法氏囊病毒重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗的生产方法具有重要的现实意义。


技术实现要素：

10.本发明的目的是提供一种可同时表达的传染性法氏囊病毒经典株与变异株vp2蛋白的重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗。所提供的疫苗具有高效、安全性好、抗体整齐度高、保护率高、免疫持续期长的优点，从而弥补现有技术的不足。
11.本发明的第一个目的是提供一种重组火鸡疱疹病毒，所述重组火鸡疱疹病毒同时表达传染性法氏囊病毒经典株与变异株的vp2基因表达盒。
12.在一种实施方式中，ibdv经典株vp2基因表达盒按顺序依次包括启动子、ltb基因、ibdv经典株vp2基因和终止子；变异株vp2基因表达盒按顺序依次包括启动子、ltb基因、ibdv变异株vp2基因和终止子。
13.在一种实施方式中，所述ibdv经典株vp2基因表达盒和所述变异株vp2基因表达盒分别位于火鸡疱疹病毒的复制非必需区。
14.在一种实施方式中，所述经典株vp2基因表达盒位于火鸡疱疹病毒的us2，所述变异株vp2基因表达盒位于火鸡疱疹病毒的us10，或所述经典株vp2基因表达盒位于火鸡疱疹病毒的us10，所述变异株vp2基因表达盒位于火鸡疱疹病毒的us2。
15.在一种实施方式中，所述ibdv经典株vp2基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述ibdv变异株vp2基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述ltb基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。
16.在一种实施方式中，所述启动子包括pec启动子，所述终止子为火鸡疱疹病毒的终止子。
17.在一种实施方式中，所述pec启动子的核苷酸序列如seq id no.6所示。
18.在一种实施方式中，经典株vp2蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，变异株vp2蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
19.在一种实施方式中，所述火鸡疱疹病毒为hvt fc126株。
20.本发明的第二个目的是提供一种所述重组火鸡疱疹病毒的制备方法，所述方法为将ibdv经典株vp2基因表达盒和变异株vp2基因表达盒分别插入火鸡疱疹病毒的复制非必需区。
21.在一种实施方式中，所述ibdv经典株vp2基因表达盒按顺序依次包括启动子、ltb基因、ibdv经典株vp2基因和终止子；所述变异株vp2基因表达盒按顺序依次包括启动子、ltb基因、ibdv变异株vp2基因和终止子。
22.在一种实施方式中，将ibdv经典株vp2基因表达盒插入火鸡疱疹病毒的us2区，将
ibdv变异株vp2基因表达盒插入火鸡疱疹病毒的us10区；
23.或，将ibdv经典株vp2基因表达盒插入火鸡疱疹病毒的us10区，将ibdv变异株vp2基因表达盒插入火鸡疱疹病毒的us2区。
24.在一种实施方式中，所述启动子包括pec启动子，所述终止子为火鸡疱疹病毒的终止子。
25.在一种实施方式中，所述pec启动子的核苷酸序列如seq id no.6所示。
26.在一种实施方式中，所述ibdv经典株vp2基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述ibdv变异株vp2基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述ltb基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。
27.在一种实施方式中，所述方法的具体步骤如下：
28.(1)将绿色荧光蛋白(egfp)基因序列与pec启动子组成表达盒与us2左右同源臂克隆至转移质粒，获得重组质粒pb-lr-us2-egfp；
29.(2)拯救病毒，将步骤(1)的重组质粒和火鸡疱疹病毒基因组共转宿主细胞，获得重组病毒rhvt-egfp；
30.(3)将上游连接有ltb基因的传染性法氏囊病毒经典株的vp2基因序列与pec启动子组成表达盒与us2左右同源臂克隆至转移质粒，获得重组质粒pb-lr-us2-ltb-vp2c；
31.(4)拯救病毒，将步骤(3)的重组质粒和重组病毒rhvt-egfp基因组共转宿主细胞，获得重组病毒rhvt-us2-egfp；
32.(5)将绿色荧光蛋白(egfp)基因序列与pec启动子组成表达盒与us10左右同源臂克隆至转移质粒，获得pb-lr-us10-egfp；
33.(6)拯救病毒，将步骤(5)的重组质粒和重组病毒rhvt-us2-egfp基因组共转宿主细胞，获得重组病毒rhvt-us10-egfp；
34.(7)将上游连接有ltb基因的传染性法氏囊病变异株的vp2基因序列与pec启动子组成表达盒与us10左右同源臂克隆至转移质粒，获得pb-lr-us10-ltb-vp2v；
35.(8)拯救病毒，将步骤(7)的重组质粒和重组病毒rhvt-us10-egfp基因组共转宿主细胞，获得重组病毒rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v。
36.在一种实施方式中，获得的重组病毒都要经过纯化。
37.在一种实施方式中，所述火鸡疱疹病毒基因组的序列为ncbi的登录号“af291866.1”。
38.在一种实施方式中，所述转移质粒包括pbluescriptⅱks。
39.在一种实施方式中，所述宿主细胞包括鸡胚成纤维细胞。
40.本发明的第三个目的是提供一种重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗，所述疫苗同时表达传染性法氏囊病毒经典株与变异株的vp2基因表达盒。
41.在一种实施方式中，ibdv经典株vp2基因表达盒按顺序依次包括启动子、ltb基因、ibdv经典株vp2基因和终止子；变异株vp2基因表达盒按顺序依次包括启动子、ltb基因、ibdv变异株vp2基因和终止子。
42.在一种实施方式中，所述ibdv经典株vp2基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述ibdv变异株vp2基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述ltb基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。
43.在一种实施方式中，所述启动子包括pec启动子，所述终止子为火鸡疱疹病毒的终止子。
44.在一种实施方式中，所述pec启动子的核苷酸序列如seq id no.6所示。
45.在一种实施方式中，所述ibdv经典株vp2基因表达盒和所述变异株vp2基因的表达盒分别位于火鸡疱疹病毒的复制非必需区。
46.在一种实施方式中，所述经典株vp2基因表达盒位于火鸡疱疹病毒的us2，所述变异株vp2基因表达盒位于火鸡疱疹病毒的us10；
47.或，所述经典株vp2基因表达盒位于火鸡疱疹病毒的us10，所述变异株vp2基因表达盒位于火鸡疱疹病毒的us2。
48.在一种实施方式中，所述火鸡疱疹病毒为hvt fc126株。
49.在一种实施方式中，所述的疫苗中重组火鸡疱疹病毒的含量≥2.5
×
105pfu
/
ml。
50.在一种实施方式中，所述重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗中的佐剂为脱脂乳冻干用佐剂。
51.本发明还保护所述重组火鸡疱疹病毒或所述制备方法在制备传染性法氏囊病毒疫苗中的应用。
52.有益效果：
53.(1)本发明的表达的传染性法氏囊病毒重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗选用启动子为pec复合启动子，包括增强子结合cmv，所选终止子为病毒本身终止子，未引入外源序列，本发明表达的传染性法氏囊病毒重组活载体苗选用ltb融合表达作为疫苗活性佐剂。
54.(2)本发明将重组病毒rhvt-ibdv-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v，接入cef细胞扩大培养后经普通冻干保护剂制成疫苗。本发明制备的疫苗能提高免疫后的抗体水平，提高免疫后抗体的整齐度，保证疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好且一次接种终生免疫的优点，对雏鸡不会造成临床反应和病理损伤，3批疫苗被动免疫组均可以在一定程度上保护机体不受传染性法氏囊病毒经典株和变异株的攻击，疫苗保护率均达到100％。
附图说明
55.图1是火鸡疱疹病毒接种cef细胞的病变照片；a：hvt野毒接种对照；b：重组毒rhvt-us2-us10-vp2c-vp2v接种病变照片；c：阴性对照。
56.图2是重组火鸡疱疹病毒pcr鉴定；m：dl5000 dna marker；a：us2重组鉴定；b:us10重组鉴定；1：hvt野毒；2：含标记基因的重组毒rhvt-us2-egfp；3：重组病毒rhvt-us2-us10-vp2c-vp2v；4：阴性对照；5：hvt野毒；6：含标记基因重组毒rhvt-us10-egfp；7：重组病毒rhvt-us2-us10-vp2c-vp2v；8：阴性对照。
57.图3是sds-page检测重组火鸡疱疹病毒表达产物；m：预染蛋白质marker；1：阴性细胞对照；2：hvt野毒对照；3：重组病毒rhvt-ibdv-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v。
58.图4是western blot鉴定rhvt-ibdv-us2-us10-vp2c-vp2v重组病毒表达产物；a:vp2c活性检测；b:vp2v活性检测；m：预染蛋白质marker；1：阴性细胞；2：hvt野毒对照；3：重组病毒rhvt-us2-us10-vp2c-vp2v。
59.图5是重组hvt病毒免疫spf鸡后诱导的ibdv抗体反应；a:经典株ibdv抗体反应结果；b:变异株抗体反应结果。
具体实施方式
60.下述实施例中涉及到的实验材料：
61.毒株、菌株和质粒
62.火鸡疱疹病毒：辽宁益康生物股份有限公司赠与，ncbi登录号：af291866.1。
63.传染性法氏囊病毒的经典株bc6/85购自中国兽医药品监察所，由扬州优邦生物药品有限公司保存。
64.传染性法氏囊病毒的变异株sn18由扬州优邦生物药品有限公司分离并保存。
65.鸡成纤维细胞：cef细胞，购买自atcc，由扬州优邦生物药品有限公司保存。
66.质粒的构建参考《分子克隆指南》(第四版)
67.实施例1：传染性法氏囊病毒vp2基因的确定
68.传染性法氏囊病毒的经典株的vp2基因由本公司在生产的亚单位疫苗相关序列，经过金斯瑞在线分子生物学软件，用分子软件将其与ltb融合后以鸡源为宿主，优化得到一条核苷酸序列并命名为ltb-vp2c。传染性法氏囊病毒变异株的vp2蛋白基因序列由本公司技术服务部门分离病毒，测序经ncbi比对后得到，同样采用在线密码子优化工具，以鸡源为宿主，优化得到一条核苷酸序列，命名为ltb-vp2v。
69.实施例2：重组病毒rhvt-us2-vp2c的制备
70.1、火鸡疱疹病毒基因组提取：用传统的dna提取方法提取火鸡疱疹病毒总dna(ncbi登录号：af291866.1)；
71.2、同源重组同源臂转移载体的设计与合成：根据genbank已发表的火鸡疱疹病毒us2基因序列设计左右同源臂各1200bp，并在同源臂中间引入pec-egfp表达盒(由pec启动子，egfp基因和us2自身终止子组成)及pec-vp2c(由pec启动子，ltb-vp2c基因和us2自身终止子组成)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成至pbluescriptⅱks。重组质粒命名为pb-lr-us2-egfp和pb-lr-us2-ltb-vp2c；
72.3、重组火鸡疱疹病毒的拯救：将转移载体pb-lr-us2-egfp与步骤1获取的火鸡疱疹病毒基因组共转染cef细胞，具体操作方法参照thermo fisher公司的磷酸钙转染的操作说明进行，获得f1代重组火鸡疱疹病毒rhvt-egfp。
73.4、重组火鸡疱疹病毒的纯化：将转染得到的重组病毒的孔，标记转染得到的重组病毒蚀斑荧光区域，进行挑版纯化，即，挑取标记的病变细胞再次接种新鲜的次代cef细胞，放入37℃，5％co2培养箱培养5-7天。反复筛选纯化4-5轮，至所有蚀斑均显示荧光，用us2重组鉴定引物经pcr鉴定后确认得到完全纯化的重组病毒rhvt-us2-egfp(图2)。
74.us2重组鉴定引物序列为：
75.p1:5
’‑
acgcaggtatcataggggtaat-3’；
76.p2:5
’‑
tggtatcgagtccacatgca-3’。
77.5、火鸡疱疹病毒基因组提取：用传统方法提取含标记基因的重组火鸡疱疹病毒rhvt-us2-egfp总dna；
78.6、重组火鸡疱疹病毒的拯救：将转移载体pb-lr-us2-ltb-vp2c与步骤5获取的重组火鸡疱疹病毒基因组共转染cef细胞，具体操作方法参照thermo fisher公司的磷酸钙转染的操作说明进行，获得f1代重组火鸡疱疹病毒rhvt-us2-ltb-vp2c。
79.7、重组火鸡疱疹病毒的纯化：将转染得到的重组病毒的孔，标记转染得到的重组
病毒蚀斑非荧光区域，进行挑版纯化，即，挑取标记的病变细胞再次接种新鲜的次代cef细胞，放入37℃，5％co2培养箱培养5-7天。反复筛选纯化4-5轮，至所有蚀斑均不显示荧光，用us2重组鉴定引物经pcr鉴定后确认得到重组病毒rhvt-us2-ltb-vp2c。
80.实施例3：重组病毒rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v的制备
81.1、火鸡疱疹病毒基因组提取：用传统的dna提取方法提取实施例2中的重组病毒rhvt-us2-ltb-vp2c总dna；
82.2、同源重组同源臂转移载体的设计与合成：根据genbank已发表的火鸡疱疹病毒us10基因序列设计左右同源臂各1200bp，并在同源臂中间引入pec-egfp表达盒(由pec启动子，egfp基因和us10自身终止子组成)及pec-ltb-vp2v(由pec启动子，ltb-vp2v基因和us10自身终止子组成)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成至pbluescriptⅱks。重组质粒命名为pb-lr-us10-egfp和pb-lr-us10-ltb-vp2v；
83.3、重组火鸡疱疹病毒的拯救：将转移载体pb-lr-us10-egfp与步骤1获取的火鸡疱疹病毒基因组共转染cef细胞，具体操作方法参照thermo fisher公司的磷酸钙转染的操作说明进行，获得f1代重组火鸡疱疹病毒rhvt-us10-egfp。
84.4、重组火鸡疱疹病毒的纯化：将转染得到的重组病毒的孔，标记转染得到的重组病毒蚀斑荧光区域，进行挑版纯化，即，挑取标记的病变细胞再次接种新鲜的次代cef细胞，放入37℃，5％co2培养箱培养5-7天。反复筛选纯化4-5轮，至所有蚀斑均显示荧光，用us10重组鉴定引物经pcr鉴定后确认得到重组病毒rhvt-us10-egfp。
85.us10重组鉴定引物序列为：
86.p3:5
’‑
cagctcgccgatcatatgg-3’；
87.p4:5
’‑
tgtaacatcagagcgtgcct-3’。
88.5、火鸡疱疹病毒基因组提取：用传统方法提取含标记基因的重组火鸡疱疹病毒rhvt-us10-egfp总dna；
89.6、重组火鸡疱疹病毒的拯救：将转移载体pb-lr-us10-ltb-vp2v与步骤5获取的重组火鸡疱疹病毒基因组共转染cef细胞，具体操作方法参照thermo fisher公司的磷酸钙转染的操作说明进行，获得f1代重组火鸡疱疹病毒rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v。
90.7、重组火鸡疱疹病毒的纯化：将转染得到的重组病毒的孔，标记转染得到的重组病毒蚀斑非荧光区域，进行挑版纯化，即，挑取标记的病变细胞再次接种新鲜的次代cef细胞，放入37℃，5％co2培养箱培养5-7天。反复筛选纯化4-5轮，至所有蚀斑均不显示荧光，用us10重组鉴定引物经pcr鉴定后确认得到重组病毒rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v。
91.重组病毒rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v和hvt野毒感染cef细胞病变图见图1。
92.实施例4：重组病毒rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v的制备
93.1、表达蛋白鉴定：
94.(1)将实施例3获取的重组病毒rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v接种cef细胞，37℃，5％co2培养3-7天，收集培养物，破碎离心，上清即为ltb-vp2c和ltb-vp2v蛋白；
95.(2)sds-page鉴定：将上述上清液进行sds-page电泳；电泳结束后，经染色和脱色后发现，大约在45kda位置，其分子量与理论大小相符，说明表达成功(图3)。
96.(3)western blot鉴定：取sds-page电泳后凝胶，直接用bio-lab转印装置将其转印到nc膜上，转印结束后，按常规方法进行western blot鉴定。用鸡传染性法氏囊病毒阳性
血清参考品(1:200)作为一抗；用辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡igg(1:2000)作为酶标二抗；最后用tmb显色(碧云天生物技术研究所)。结果表明，在45kda处出现1条明显的特异性条带，而阴性对照无此特异性反应，说明该重组蛋白可被传染性法氏囊病毒阳性血清中的抗体识别，具有良好的特异性和反应原性(图4)。
97.(4)间接免疫荧光鉴定(ifa)：将重组病毒rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v接种单层cef细胞，培养至细胞病变效应(cpe)达到80％时，以pbs洗涤、冷4％甲醛固定细胞，以鸡抗ibdv阳性血清(1：100)为一抗，兔抗鸡igg-fitc(1：500)为二抗，于荧光显微镜下观察，并以hvt感染的cef细胞作为阴性对照。
98.实施例5：疫苗制备
99.1、重组病毒的收获：将实施例3获取的重组病毒rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v接种cef细胞，37℃，5％co2培养3-5天，弃去培养基，加入适量胰酶-edta消化液，待cef细胞单层出现疏松拉网接近脱落瓶壁现象时，立即加入与消化液等量的含10％牛血清的培养液，停止消化。收集细胞于离心管中，经2000rpm/min离心10min，弃上清，获得的细胞沉淀即为重组病毒培养物。
100.2、半成品检验
101.(1)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
102.(2)病毒含量测定：按空斑法检测病毒含量，病毒含量应≧2.5
×
105pfu/ml。
103.3、活载体疫苗制备：
104.经过检验合格后的半成品，向细胞沉淀中加入适量spga稳定剂，采用超声波裂解器进行裂解，摇匀后以两层纱布进行过滤，分装于小瓶中，立即进行冷冻真空干燥，获得重组病毒疫苗rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v。
105.实施例6：疫苗成品检验
106.1、性状
107.外观：疫苗应为乳酪海绵状且外包装应合格；
108.剂型：粉剂。(补充说明)。
109.2、装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
110.3、无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
111.4、安全检验：
112.4.1实验方法
113.4.1.1 rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v疫苗单剂置接种的安全性实验
114.将40只1日龄实验鸡随机分为2组，每组20只。其中组1实验鸡以2000蚀斑形成单位(pfu)/只的剂量(1羽份)腹腔接种实施例5中获取的重组病毒疫苗rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v；组2实验鸡接种疫苗稀释液作为空白对照。接种后每天观察各组鸡的临床症状。分别在接种后2、4、8、12周，每组随机选取实验鸡5只，称取体重，评价重组病毒疫苗对实验鸡生长发育的影响。将各组选取的5只鸡剖杀，采集法氏囊、胸腺、脾脏、肝脏、腺胃等器官，称重，观察有无萎缩或肿大症状。观察所采集组织的病变情况，并进行组织病理学检查。提取上述器官组织dna，应用荧光定量pcr方法检测疫苗株病毒在上述组织的分布和增殖情况。
115.4.1.2 rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v疫苗单剂量重复接种的安全性实验
116.将40只1日龄实验鸡随机分为2组，每组20只。其中组1实验鸡以2000pfu/只的免疫剂量颈部皮下接种重组疫苗rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v；组2实验鸡接种疫苗稀释液作为空白对照，免疫后2周同上方法和剂量进行重复接种。接种后每天观察2组鸡的临床症状。分别在接种后2、4、8、12周，每组随机选取实验鸡5只，称取体重，评价重组病毒疫苗对实验鸡生长发育的影响。将各组选取的5只鸡剖杀，采集法氏囊、胸腺、脾脏、肝脏、腺胃等器官，称重，观察有无萎缩或肿大症状。观察所采集组织的大体病变情况，并进行组织病理学检查。
117.4.1.3 rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v疫苗大剂量接种的安全性实验
118.将40只1日龄实验鸡随机分为2组，每组20只。其中组1实验鸡以20000pfu/只最大剂量(相当于10个免疫剂量)腹腔接种重组病毒疫苗rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v；组2实验鸡接种疫苗稀释液作为空白对照。接种后每天观察各组鸡的临床症状。分別在接种后2、4、8、12周，每组随机选取实验鸡5只，称量体重，评价重组病毒疫苗对实验鸡生长发育的影响。将各组选取的5只鸡剖杀，采集法氏囊、胸腺、脾脏、肝脏、腺胃等器宫，称重，观察有无萎缩或肿大症状。观察所采集组织的大体病变情况，并进行组织病理学检验。
119.4.2实验结果
120.4.2.1 rhvt-ibdv-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v疫苗单剂最接种的安全性实验
121.重组疫苗rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v以2000pfu/只免疫剂量接种1日龄实验鸡后，实验鸡精神状况、采食饮水状况良好，体重发育正常，未见任何临床症状。免疫后2、4、8、12周，对接种鸡进行剖检，统计主要器宫指数(法氏囊、胸腺、肝脏、脾脏和腺胃)。结果表明，经重组疫苗rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v免疫后，实验鸡各器官发育正常，没有萎缩和肿大现象。将上述采集的各组织进行组织病理学检测，结果表明，重组疫苗rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v免疫后，实验鸡法氏囊滤泡轮廓清晰，淋巴细胞未见减少，无明显病理变化；其他组织同样完好无损，均未见明显病理变化。提取上述组织基因组dna，进行荧光定量pcr，结果表明，疫苗株病毒rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v在免疫接种鸡法氏囊、胸腺、肝脏、脾脏和腺胃中均有分布，病毒载量在各组织间没有显著差异。结果表明，重组疫苗rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v对鸡没有致病性，对鸡始安全的。
122.4.2.2 rhvt-ibdv-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v疫苗单剂量重复接种对鸡的安全性分析
123.重组疫苗rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v以2000pfu/只免疫剂量接种1日龄实验鸡后2周以相同剂量和途径进行从重复接种。重复接种后，实验鸡精神状况良好，采食饮水均正常，体重发育正常，未见任何临床症状。免疫后2、4、8、12周，对接种鸡进行剖检，统计主要器官(法氏囊、胸腺、肝脏、脾脏和腺胃)与体重的比值，计算器官体重比，以评价各器官有无萎缩或肿大现象。结果表明，重组疫苗rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v重复免疫后，实验鸡各器官均发育正常，与对照组无明显差异，没有萎缩和肿大现象。将上述采集的各组织进行组织病理学检测，结果表明，重组疫苗rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v重复免疫后，实验鸡法氏囊滤泡轮廓清晰，淋巴细胞未见减少，无明显病理变化；其他组织同样完好无损，均未见明显病理变化。以上结果表明，重组疫苗rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v重复接种对靶动物鸡没有致病性，对靶动物是安全的。
124.4.2.3 rhvt-ibdv-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v疫苗大剂量接种对鸡的安全性分析
125.为了进一步评估重组疫苗rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v对靶动物鸡的毒理学反应，将该疫苗株病毒以20000pfu/只最大剂量(相当于10个免疫剂量)对实验鸡进行免疫接种。结果表明，大剂量接种后，实验鸡没有出现任何不良临床反应，采食饮水和生长发育状况良好，体重增长正常。将实验鸡剖检后，发现免疫接种鸡各器官发育正常，没有可见病变，无萎缩和肿大现象。将采集的各组织进行组织病理学检测，结果表明，大剂量免疫后，实验鸡法氏囊、胸腺、肝脏、脾脏和腺胃均完好无损，与对照组无明显差异，均未见明显病理变化。以上结果表明，重组疫苗rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v即使以10倍免疫剂量对靶动物鸡进行接种，对实验鸡也不会造成临床反应和病理损伤，进一步表明该疫苗株病毒对靶动物鸡是安全可靠的。
126.5、效力检验：
127.rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v重组疫苗，批号分别为rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v-001p、rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v-002p、rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v-003p共3批。校检毒株分别为经典株bc6/85和变异株sn-18。
128.5.1实验方法
129.5.1.1分组与免疫
130.将100只1日龄spf鸡随机分成5组。任选三组分别免疫rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v-001p、rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v-002p、rhvt-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v-003p批次疫苗，免疫剂量为2500pfu/只，第4组接种rhvt-vp2(鸡传染性法氏囊病病毒火鸡疱疹病毒载体活疫苗rhvt-013-69株，购自梅里亚动物保健有限公司)，免疫剂量为2500pfu/只，第5组为非免疫对照组，各实验组鸡分别做好标记。
131.5.1.2 ibdv抗体检测
132.各实验组鸡免疫后每周逐只采血至免疫后28日，分离血清，按ibdv抗体检测试剂盒说明，采用间接elisa方法对血清样品进行检测。
133.5.1.3攻毒保护实验
134.在免疫28d后，用鸡传染性法氏囊病毒强毒株bc6/85(购自中国兽医药品监察所)和变异株sn18(由扬州优邦生物药品有限公司分离并制备)分别进行攻毒保护实验，攻毒剂量为105eid
50
。攻毒后观察鸡的临床症状。攻毒后12天剖杀实验鸡，采集法氏囊，统计囊重比(f/b)和囊指数(bbix)，f/b＝(法氏囊重/体重)x1000；bbix＝实验组鸡囊重比/空白对照组鸡囊肿比；当bbix＜0.7时，判为法氏囊萎缩；bbix＞0.7时，判为法氏囊正常。将采集的法氏囊组织制作病理切片，进行组织病理学观察，统计病变分值(hbls)。hbls的统计方法如下：0，没有任何病变；1，轻微病变；2，散在的或部分滤泡病变；3，小于或等于50％的滤泡发生病变；4，50％－75％的滤泡发生病变；5，75％－100％的滤泡发生病变。当hbls幻时，判为保护；hbls＞1时，判为未保护。
135.5.2实验结果
136.5.2.1血清抗体检测
137.免疫后第1周和第2周，所有组的抗体效价都不高；免疫后第21天，实验组经典ibdv抗体和变异株ibdv抗体抗体效价均明显升高，且达到峰值，其中rhvt-ibdv-us2-us10-ltb-vp2c-vp2v免疫组抗体效价达到5.7
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103，非免疫对照组的抗体均为阴性，市售疫苗的变异株ibdv抗体检测为阴性，具体结果见图5。
138.5.2.2攻毒保护实验结果
139.攻毒后4天采食、饮水、精神状态均正常，连续观察至第12日，12天后非免疫对照组全部死亡。对照苗对变异株几乎不保护。攻毒12d后解剖所有鸡，可见患病鸡的腿肌有出血点，法氏囊出现不同程度的肿大，表面有黄色胶冻样渗出物。攻毒保护结果显示，3批疫苗被动免疫组均可以在一定程度上保护机体均不受两种ibdv毒株的攻击，保护率可达到100％以上，攻毒保护结果见表1。
140.表1 1日龄雏鸡被动免疫攻毒
[0141][0142]
上述实验结果表明，3批次疫苗对健康易感鸡具有很好的免疫效果，使雏鸡出雏时血清中含有较高水平的hvt重组病毒，含有ltb活性佐剂的抗体及保护效果优于市售疫苗，可以有效的抵抗传染性法氏囊病毒的攻击。
[0143]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。