一种水凝胶/金属有机框架复合载体的制备方法及应用与流程

1.本发明涉及酶的固定化方法，具体涉及一种水凝胶/金属有机框架复合载体的制备方法及应用。


背景技术：

2.多酶级联反应是活细胞中介导信号转导和代谢途径的一类主要化学转化；不同于分步合成，中间体在活性位点之间的有效转运可以使级联反应以无与伦比的效率完成，同时，省去了繁琐的中间体分离纯化过程。由于其催化优势，人们致力于利用介孔二氧化硅、有机聚合物、水凝胶和dna等不同材料作为酶载体，构建人工多酶级联体系。其中，水凝胶是一种备受青睐的酶固定化载体。这是因为水凝胶具有类似细胞的生物相容性微环境和大孔结构，可以使被固定的酶保持原有的天然构象，进而表现为较高的催化活性。但是，水凝胶差的机械强度阻碍了它作为酶固定化载体的实际应用。近年来，利用无机材料制备水凝胶杂化物正成为一种改善水凝胶机械强度的新方法。但是，如何在无机杂化物中保持水凝胶原有的大孔结构和含水微环境仍具有很大的挑战性。
3.金属有机框架是近年来发展起来的一种新型酶固定化载体材料。相较于传统的二氧化硅等酶固定化，金属有机框架具有表面积大、表面化学可控、热稳定性和化学稳定性高等独特优点。尽管如此，在酶固定化过程中，金属有机框架会经常与酶发生一些特异性或非特异性的相互作用，进而限制酶的空间构象变化。虽然这种限制状态有利于提高酶的稳定性，但是会对酶的催化活性产生负面影响。因此，国内外的研究者提出了通过制备中空或分层多孔结构来克服金属有机框架孔道体积小缺陷的设想。虽然这些研究取得了有趣的结果，但是酶的构象独立性仍是极其有限的，并且酶在有限的空间中也会不可避免地发生聚集，影响酶的空间构象。


技术实现要素：

4.针对现有酶固定化载体的不足，本发明提出了一种水凝胶/金属有机框架复合载体的制备方法，该方法制备的复合载体具有保护酶空间构象的特点，能够有效增强酶的催化活性和稳定性。
5.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
6.一种水凝胶/金属有机框架复合载体的制备方法，使用水凝胶为酶的固定化基底材料，通过聚多巴胺表面改性后，在多巴胺表面原位生长金属有机框架结构，具体步骤为：
7.1)将酶溶解于预凝胶溶液中配置酶/预凝胶溶液，利用微流控技术促使酶/预凝胶溶液的凝胶化，以制备酶固定化水凝胶材料；
8.2)将步骤1)制备得到的水凝胶材料以材料/多巴胺溶液＝1/10的体积比置于1.5mg/ml～2mg/ml多巴胺溶液中搅拌1h，洗涤后即得到表面改性处理的酶固定化水凝胶改性材料；
9.3)将步骤2)制备的改性材料和125mm金属盐硝酸锌溶液以体积比为1/10混合搅拌
3h后，加入与金属盐溶液等体积浓度为500mm的2
‑
甲基咪唑溶液继续搅拌7h，得到复合材料。该复合材料即为水凝胶/金属有机框架复合载体。
10.优选的，所述的酶溶液是葡萄糖氧化酶(gox)和辣根过氧化物酶(hrp)。
11.优选的，所述的预凝胶包括丙烯酰胺、n,n
‑
亚甲基双丙稀酰胺和2
‑
羟基
‑4‑
(2
‑
羟乙氧基)
‑2‑
甲基苯丙酮。
12.优选的，所述丙烯酰胺、n,n
‑
亚甲基双丙稀酰胺和2
‑
羟基
‑4‑
(2
‑
羟乙氧基)
‑2‑
甲基苯丙酮的质量比为15：1：1。
13.优选的，所述的金属盐与配体的摩尔比为1:4。
14.本发明还提供一种通过上述方法制备得到的固定化酶的水凝胶/金属有机框架复合材料。
15.本发明还包括上述的固定化酶的水凝胶/金属有机框架复合材料在酶固定化领域中的应用。
16.本发明的有益效果：
17.本发明的复合载体的制备方法简单，条件要求温和，易于实现。制备了水凝胶/金属有机框架复合材料，水凝胶能保护固定化酶的空间构象；金属有机框架层能够提高水凝胶机械强度，同时能有效保留酶固定化的微水环境，从而提高固定化酶的催化活性和稳定性。
附图说明
18.图1为本发明的实施例1中的水凝胶(paam)，多巴胺修饰的水凝胶(paam@pda)，水凝胶/金属有机框架复合材料(paam@zif
‑
8)的扫描电镜图。
19.图2为本发明的实施例1中的free gox/hrp，gox/hrp@paam，
20.gox/hrp@paam@pda，gox/hrp@paam@zif
‑
8的红外二阶导数图。
21.图3为本发明的实施例2中的free gox/hrp，gox/hrp@paam，
22.gox/hrp@paam@pda，gox/hrp@paam@zif
‑
8的催化活性比较。
23.图4为本发明的实施例3中的free gox/hrp，gox/hrp@paam，
24.gox/hrp@paam@pda，gox/hrp@paam@zif
‑
8的循环稳定性比较。
具体实施方式
25.为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。
26.在以下的实施例中，葡萄糖氧化酶标记为gox，辣根过氧化物酶标记为hrp，丙烯酰胺标记为aam，n,n
‑
亚甲基双丙稀酰胺标记为bis，2
‑
羟基
‑4‑
(2
‑
羟乙氧基)
‑2‑
甲基苯丙酮标记为pi，固定化葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的水凝胶标记为gox/hrp@paam，多巴胺表面改性后的gox/hrp@paam标记为gox/hrp@paam@pda，固定化葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的水凝胶/金属有机框架复合材料标记为gox/hrp@paam@zif
‑
8。
27.实施例1
28.按照以下步骤制备固定化葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的水凝胶/金属有机框架复合材料(gox/hrp@paam@zif
‑
8)：
29.(1)称取3mg/ml gox和5mg/ml hrp，aam(15％wt)，bis(1％wt)，pi(1％wt)配置成1ml酶/预凝胶混合溶液；
30.(2)利用紫外聚合技术固化酶/预凝胶溶液，制备得到gox/hrp@paam；
31.(3)将200μl的gox/hrp@paam浸泡在2ml tris
‑
hcl缓冲液(10mm,ph＝8.5)中，加入4mg多巴胺进行水凝胶表面改性；在温和搅拌下反应1h后，离心收集得到gox/hrp@paam@pda，再用超纯水洗涤3次；
32.(4)将得到的洗涤后的gox/hrp@paam@pda置于2ml 125mm硝酸锌水溶液中常温孵化3h；离心洗涤后，继续加入2ml 500mm 2
‑
甲基咪唑水溶液中再反应7h，最后用超纯水洗涤得到gox/hrp@paam@zif
‑
8。
33.实施例2
34.结合2,2'
‑
联氮
‑
双
‑3‑
乙基苯并噻唑啉
‑6‑
磺酸(abts)氧化实验，利用紫外分光光度计记录其最大吸收峰对应的吸光度，以检测gox/hrp@paam@zif
‑
8的催化活性。具体方法步骤为：
35.(1)以ph＝7.4的磷酸盐(pbs)作为缓冲溶液，总体积300μl，反应温度37℃，反应时间为30min；
36.(2)在上述步骤(1)的反应条件下，用4支0.5ml离心管，分别编号为a、b、c、d；
37.(3)离心管a中溶液的配制方法为：10μl abts(35mm)、10μl葡萄糖(100mm)和2μl gox/hrp混合液于278μl ph＝7.4的pbs缓冲溶液中；
38.(4)离心管b中溶液的配制方法为：取10μl abts(35mm)、10μl葡萄糖(100mm)和2μl gox/hrp@paam于278μl ph＝7.4的pbs缓冲溶液中；
39.(5)离心管b中溶液的配制方法为：取10μl abts(35mm)、10μl葡萄糖(100mm)和2μl gox/hrp@paam@pda于278μl ph＝7.4的pbs缓冲溶液中；
40.(6)离心管b中溶液的配制方法为：取10μl abts(35mm)、10μl葡萄糖(100mm)和2μl gox/hrp@paam@zif
‑
8于278μl ph＝7.4的pbs缓冲溶液中；
41.(7)将4支离心管置于反应温度37℃下反应30min后，利用紫外分光光度计分别测得在405nm处测定它们的最大吸光度。
42.检测结果如图3所示，gox/hrp@paam，gox/hrp@paam@pda和gox/hrp@paam@zif
‑
8体系的催化活性接近，同时测得的催化活性要运高于gox/hrp混合体系，说明水凝胶作为载体极大的增强了gox/hrp的级联催化活性，且zif
‑
8的存在不会影响固定化gox/hrp的级联反应活性。
43.实施例3
44.游离gox/hrp，gox/hrp@paam，gox/hrp@paam@pda，gox/hrp@paam@zif
‑
8体系循环使用稳定性的比较，随后利用紫外分光光度计记录最大吸收峰对应的吸光度。具体方法是：
45.(1)以ph＝7.4的磷酸盐(pbs)作为缓冲溶液，总体积300μl，反应温度37℃，反应时间为30min；
46.(2)用4支0.5ml离心管，4支离心管都加入2μl gox/hrp、2μl gox/hrp@paam、2μl gox/hrp@paam@pda、2μl gox/hrp@paam@zif
‑
8；
47.(3)在各试管中加入底物10μl abts(35mm)、10μl葡萄糖(100mm)反应后，利用紫外分光光度计记录在405nm处的最大吸收峰；
48.(4)在检测固定化gox/hrp的重复使用过程中，收集样品，用pbs(10mm,ph 7.4)洗涤3次，去除残留的底物，用于下一个反应循环。
49.检测结果如图4所示，在反应循环6次后，仅gox/hrp@paam@zif
‑
8体系仍具有初始酶级联反应活性的90％以上，说明paam@zif
‑
8作为载体材料能极大程度的保持酶高效催化的稳定性。
50.综上所述，本发明提出了一种新的复合载体的制备方法，利用水凝胶对酶空间构象的保护作用以及mofs层对复合材料稳定性的增强，制备了杂化paam@zif
‑
8材料用于gox和hrp的共固定化。在制备过程中，由于条件温和，不改变固定化酶的空间构象，所以酶仍保持高效的催化活性和稳定性。
51.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。