一种老香黄年份的判别方法与流程

1.本发明涉及医药技术领域，尤其涉及化学标志物定量分析及其模式识别技术，能够应用于快速判别不同年份的老香黄。


背景技术：

2.老香黄(也称老香橼、佛手香黄)是岭南特有的保健和药用制品，具有增进食欲、理气化痰的功效，可治胃痛、腹胀、呕吐、嗝噎、痰多咳喘病症。它是由芸香科植物佛手(citrus medica l.var.sarcodactylis swingle)的果实炮制而成的。佛手是我国传统的“药食两用”中药之一，但本身味道苦涩辛辣，不宜直接食用，故岭南地区的潮汕乡民就开始以佛手(也称香橼)为原料，经过盐腌、晒干、炊熟、浸中药份液、九蒸九晒，腌制成色黑如漆、口感绵软的老香黄，同时可以久藏不坏，又可以保存药效，在市场上，贮藏时间越长的老香黄身价就越高，一块十年制的价达百元之多。
3.目前老香黄多以作坊制作为主，没有标准的制备方法，导致老香黄成品在化学成分、组成及含量上差异很大，并且在腌制的过程中，工序较为复杂，这些因素都可以直接影响到老香黄的质量。迄今为止，缺少有效可靠的质量控制及其品质鉴定的方法。正因如此，不同贮藏年份的老香黄，表现出功能和品质上的差异。因此，建立老香黄的质量评价体系，找到差异性化学标志物去判别不同年份的老香黄，成为难点。
4.目前，老香黄成品以佛手为原料，经过盐浸、蒸煮等多道工序，加配多种中药材，成分复杂。佛手的主要化学成分有挥发油类、黄酮类、香豆素类、多糖、氨基酸和无机盐等多种生理活性物质，在调节免疫、抗氧化、抗肿瘤、降糖、降脂、改善胰岛素抵抗方面发挥着重要的作用。随着对这些药理作用的深入研究，其化学成分的快速定性定量需要亟待解决。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种老香黄年份的判别方法。
6.本发明解决其技术问题的技术方案是：
7.本发明提出了一种老香黄年份的判别方法，包括以下步骤：
8.步骤s1、选取化学标志物；取不同年份的多种老香黄，分别采用相同的湿法破碎过滤方案处理所述多种老香黄，得到所述多种老香黄的供试品溶液；再分别检测分析所述多种老香黄的供试品溶液中化学标志物的含量；
9.步骤s2、取待测试老香黄，采用所述湿法破碎过滤方案处理该待测试老香黄，得到待测试老香黄的供试品溶液；再检测分析待测试老香黄的供试品溶液中化学标志物的含量；
10.步骤s3、将待测试老香黄的供试品溶液中化学标志物的含量分别与所述多种老香黄的供试品溶液中化学标志物的含量进行对比，根据老香黄的供试品溶液中化学标志物的含量与老香黄的年份的相关性，确定待测试老香黄的年份。
11.本发明上述的老香黄年份的判别方法中，步骤s1还包括：
12.步骤s1.1、采用uplc-ms/ms检测所述多种老香黄的供试品溶液，从而获得所述多种老香黄的供试品溶液的mrm叠加色谱图；选择并根据其中一种老香黄的供试品溶液的mrm叠加色谱图通过定性分析确定所选择的老香黄的供试品溶液中的化学成分，并根据特征峰的显著性选择所分析确定的化学成分中的部分或全部作为候选标志物；
13.根据所述多种老香黄的供试品溶液的mrm叠加色谱图通过定量分析得到所述多种老香黄的供试品溶液中候选标志物的含量；
14.步骤s1.2、基于所述多种老香黄的供试品溶液中候选标志物的含量采用主成分分析和/或聚类分析和/或正交偏最小二乘法-判别分析从候选标志物中筛选确定能够区分不同年份老香黄的物质，并以此作为化学标志物。
15.本发明上述的老香黄年份的判别方法中，在步骤s1.1中，在对老香黄的供试品溶液进行uplc-ms/ms检测之前，将内标物添加到老香黄的供试品溶液中；
16.所述定量分析是基于候选标志物对应的特征峰面积与内标物对应的特征峰面积的比值进行。
17.本发明上述的老香黄年份的判别方法中，步骤s2还包括：
18.采用uplc-ms/ms检测待测试老香黄的供试品溶液，从而获得待测试老香黄的供试品溶液的mrm叠加色谱图；根据待测试老香黄的供试品溶液的mrm叠加色谱图通过定量分析得到待测试老香黄的供试品溶液中化学标志物的含量。
19.本发明上述的老香黄年份的判别方法中，在对待测试老香黄的供试品溶液进行uplc-ms/ms检测之前，将内标物添加到待测试老香黄的供试品溶液中；
20.所述定量分析是基于化学标志物对应的特征峰面积与内标物对应的特征峰面积的比值进行。
21.本发明上述的老香黄年份的判别方法中，化学标志物建议采用5,7-二甲氧基香豆素、香叶木苷、山柰酚、黄柏酮、金圣草素、柠檬苦素中的一种或多种。
22.本发明上述的老香黄年份的判别方法中，内标物采用山柰酚-3-o-芸香糖苷。
23.本发明上述的老香黄年份的判别方法中，在步骤s1中，所述湿法破碎过滤方案包括称量步骤、剪碎步骤、浸泡步骤、超声处理步骤、过滤步骤、收集滤液作为供试品溶液步骤。
24.本发明提出了一种老香黄年份的判别方法，一方面建立老香黄的质量评价体系，控制其质量，另一方面，寻找可靠的方法对不同腌制年份老香黄进行判别，进而对市场上的老香黄进行品质鉴别。为此，能够对老香黄产业的保存、发展、商业推广提供助力。本发明的老香黄年份的判别方法设计巧妙，实用性强。
附图说明
25.下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
26.图1示出了空白甲醇、对照品混标溶液(23.80μg/ml)、老香黄(lxh0_1)的供试品溶液中初选标志物的mrm色谱图；
27.图2示出了不同年份老香黄的pca图；
28.图3示出了老香黄中15种候选标志物的载荷图；
29.图4示出了不同年份老香黄在无监督模式下的hca聚类分析图；
30.图5示出了不同年份老香黄的opls-da图；
31.图6示出了老香黄中15种候选标志物的vip得分图；
32.图7示出了不同年份老香黄在opls-da有监督的判别模式条件下的hca聚类分析图。
具体实施方式
33.本发明所要解决的技术问题是：迄今为止，缺少有效可靠的质量控制及其品质鉴定的方法。正因如此，不同贮藏年份的老香黄，表现出功能和品质上的差异。因此，建立老香黄的质量评价体系，找到差异性化学标志物去判别不同年份的老香黄，成为难点。同时，老香黄的化学成分的快速定性定量需要亟待解决。本发明就该技术问题而提出的技术思路是：以原料佛手中的化学成分为基准，通过文献筛选具有代表性化学质量标志物。随着液质联用技术的高速发展，超高液相多重质谱联用法(uplc-ms/ms)具有快速、分离度好、灵敏度高的特点，被广泛应用到中药多组份的分析。本发明采用uplc-ms/ms的方法对老香黄中的化学标志物进行快速定性定量。
34.化学计量学是以计算机和近代计算技术为基础的一门新兴交叉学科，通过统计学或数学方法在化学体系的测量值与体系的状态之间建立联系，在中药鉴别、定性表征、质量控制、组效关系等研究中均有广泛应用，尤其在中药的质量控制与评价研究中具有重要意义。化学模式识别是化学计量学的重要组成部分，也是筛选中药化学标志物的重要数学方法，按照有无训练可划分为无监督的模式识别和有监督的模式识别方法。前者指在无样品类别信息的情况下，进行学习或训练，获取分类信息的方法；后者则根据样品特征和已知类别的样品(训练集)，用特定的方法或模型进行学习或训练，从而建立分类模型，再根据获取的分类模型和未知样品的特征，对未知样品进行分类。其中无监督的模式识别方法包括聚类分析(hierarchical cluster analysis，hca)、主成分分析(principal component analysis,pca)等。有监督的模式识别方法包括偏最小二乘法-判别分析(partial least squares discriminant analysis，pls-da)、正交偏最小二乘法分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,opls-da)、人工神经网络(artificial neural networks,anns)。本发明采用主成分分析、聚类分析、正交偏最小二乘法-判别分析区别不同年份的老香黄和筛选差异性化学标志物。
35.具体地，本发明提出了一种老香黄年份的判别方法，包括以下步骤：
36.步骤s1、选取化学标志物；取不同年份的多种老香黄，分别采用相同的湿法破碎过滤方案处理所述多种老香黄，得到所述多种老香黄的供试品溶液；再分别检测分析所述多种老香黄的供试品溶液中化学标志物的含量；
37.进一步地，在本发明中，步骤s1还包括：
38.步骤s1.1、采用uplc-ms/ms检测所述多种老香黄的供试品溶液，从而获得所述多种老香黄的供试品溶液的mrm叠加色谱图；选择并根据其中一种老香黄的供试品溶液的mrm叠加色谱图通过定性分析确定所选择的老香黄的供试品溶液中的化学成分，并根据特征峰的显著性选择所分析确定的化学成分中的部分或全部作为候选标志物；
39.根据所述多种老香黄的供试品溶液的mrm叠加色谱图通过定量分析得到所述多种老香黄的供试品溶液中候选标志物的含量；
40.步骤s1.2、基于所述多种老香黄的供试品溶液中候选标志物的含量采用主成分分析(pca)和/或聚类分析(hca)和/或正交偏最小二乘法-判别分析(opls-da)从候选标志物中筛选确定能够区分不同年份老香黄的物质，并以此作为化学标志物；
41.进一步地，在步骤s1.1中，在对老香黄的供试品溶液进行uplc-ms/ms检测之前，将内标物添加到老香黄的供试品溶液中；
42.所述定量分析是基于候选标志物对应的特征峰面积与内标物对应的特征峰面积的比值进行。
43.进一步地，化学标志物建议采用5,7-二甲氧基香豆素、香叶木苷、山柰酚、黄柏酮、金圣草素、柠檬苦素中的一种或多种。
44.进一步地，内标物采用山柰酚-3-o-芸香糖苷。
45.在步骤s1中，所述湿法破碎过滤方案包括称量步骤、剪碎步骤、浸泡步骤、超声处理步骤、过滤步骤、收集滤液作为供试品溶液步骤；
46.步骤s2、取待测试老香黄，采用所述湿法破碎过滤方案处理该待测试老香黄，得到待测试老香黄的供试品溶液；再检测分析待测试老香黄的供试品溶液中化学标志物的含量；
47.进一步地，在本发明中，步骤s2还包括：
48.采用uplc-ms/ms检测待测试老香黄的供试品溶液，从而获得待测试老香黄的供试品溶液的mrm叠加色谱图；根据待测试老香黄的供试品溶液的mrm叠加色谱图通过定量分析得到待测试老香黄的供试品溶液中化学标志物的含量；
49.进一步地，在对待测试老香黄的供试品溶液进行uplc-ms/ms检测之前，将内标物添加到待测试老香黄的供试品溶液中；
50.所述定量分析是基于化学标志物对应的特征峰面积与内标物对应的特征峰面积的比值进行。
51.步骤s3、将待测试老香黄的供试品溶液中化学标志物的含量分别与所述多种老香黄的供试品溶液中化学标志物的含量进行对比，根据老香黄的供试品溶液中化学标志物的含量与老香黄的年份的相关性，确定待测试老香黄的年份。
52.为了使本发明的技术目的、技术方案以及技术效果更为清楚，以便于本领域技术人员理解和实施本发明，下面将结合附图及具体实施例对本发明做进一步详细的说明。
53.实施例1 uplc-ms/ms检测不同年份老香黄中化学标志物
54.1材料
55.不同年份(7个年份)的老香黄[0年(lxh0_1～6)、3年(lxh3_1～6)、5年(lxh5_1～6)、8年(lxh8_1～6)、10年(lxh10_1～6)、15年(lxh15_1～6)、20年(lxh20_1～6)]来自于广东济公保健食品有限公司，每个样品各六批，所有样品均保存于香港科技大学深圳研究院；对照品异莨菪亭(批号：wkq20051501)、东莨菪内酯(批号：wkq20011001)、6,7-二甲氧基香豆素(批号：wkq20050602)、5,7-二甲氧基香豆素(批号：wkq20051402)、水合氧化前胡素(批号：wkq20051311)，柠檬苦素(批号：wkq20022104)、诺米林(批号：wkq20051401)、佛手柑内酯(批号：wkq19112507)、香叶木素(批号：wkq20051211)、金圣草素(批号：wkq20051204)、圣草次苷(批号：wkq20042403)、7-甲氧基香豆素(批号：wkq20051801)、野漆树苷(批号：wkq20051212)、芦丁(批号：wkq20030203)、橙皮苷(批号：wkq20030407)、新橙皮苷(批号：
wkq20020402)、甲基橙皮苷(批号：wkq20051210)、香叶木苷(批号：wkq20051312)、黄柏酮(批号：wkq20012303)、7-羟基香豆素(批号：wkq20051404)、山柰酚(批号：wkq20042613)、山柰酚-3-o-芸香糖苷(批号：wkq20032407)由四川省维克奇生物科技有限公司提供，其纯度超过98％。
[0056]
vgt-2227qtd型数码超声波清洗机(广东固特超声股份有限公司)；bsa2245型电子天平(万分之一，德国赛多利斯公司)；milli-qb型超纯水净化系统(美国millipore公司)；a-30型超高效液相色谱-q-sight型三重四极杆质谱仪(珀金埃尔默仪器有限公司)；sab 225i型电子天平(十万分之一，英国adam衡器公司)。
[0057]
2方法与结果
[0058]
2.1初选标志物的选择
[0059]
参考前人佛手中化学成分的定性鉴定和定量研究(吴春蓉，2018，广东药科大学；zhong yanmeia等，2014，natural product research)，筛选出报道较多或含量较高的21个化合物作为本发明的初选标志物，其中包括异莨菪亭、东莨菪内酯、6,7-二甲氧基香豆素、5,7-二甲氧基香豆素、水合氧化前胡素，柠檬苦素、诺米林、佛手柑内酯、香叶木素、金圣草素、圣草次苷、7-甲氧基香豆素、野漆树苷、芦丁、橙皮苷、新橙皮苷、甲基橙皮苷、香叶木苷、黄柏酮、7-羟基香豆素、山柰酚。
[0060]
2.2对照品溶液及其内标物溶液的制备
[0061]
分别精密称定21个各初选标志物适量，置于10ml的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。摇匀，制成浓度为1mg/ml的对照品单标溶液；各取适量对照品单标溶液，混合制成23.80μg/ml的对照品混标溶液。另取山柰酚-3-o-芸香糖苷10mg适量置于容量瓶中，用甲醇稀释，配制成5μg/ml的内标物溶液。
[0062]
2.3标准曲线的制备
[0063]
将对照品混标溶液用甲醇稀释成一系列的质量浓度为0.05μg/ml、0.09μg/ml、0.18μg/ml、0.37μg/ml、0.74μg/ml、1.47μg/ml、2.95μg/ml、5.95μg/ml、11.90μg/ml、23.80μg/ml的标准溶液。
[0064]
2.4老香黄的供试品溶液的制备
[0065]
准确称取不同年份各6批老香黄样品1.00g，减碎，置50ml的具塞锥形瓶中，精密吸取20ml超纯水，称定重量，浸泡24h过夜，80℃超声2h(500w，40khz)，放冷，用超纯水补足减失的重量，过滤并收集续滤液；所剩残渣按同样方法再提取一次，合并滤液，12000rpm高速离心，得到老香黄的供试品溶液，4℃保存，待分析。
[0066]
2.5样品的分析条件
[0067]
色谱条件：色谱柱：waters acquity uplc beh c18(2.1mm
×
50mm,1.7μm)；柱温：30℃；流动相：0.1％甲酸水溶液(a)-乙腈溶液(b)；梯度洗脱程序：0-2min，95％-85％a；2-6min，85％-85％a；6-10min，85％-47％a；10-12min，47％-5％a；12-14min，5％-95％a；14-17min，95％-95％a；流速：0.3ml
·
min-1；进样量：1μl。
[0068]
质谱条件：离子源检测模式：esi -多反应监测模式(mrm)；毛细管电压(electrospray voltage)：5500v；干燥气流速：100lpm：质谱接口温度(hsid temp)：280℃；雾化气流速：120lpm；离子源温度(source temp)：450℃；待测成分mrm质谱分析参数见表1。
[0069]
表1待测化学标志物质谱分析参数
[0070][0071][0072]
*定量离子，所述碰撞参数归为定量离子
[0073]
2.6方法学考察
[0074]
2.6.1成分检定及其专属性考察
[0075]
精密吸取本实施例中2.2项对照品混标溶液(23.80μg/ml)、老香黄(lxh0_1)的供试品溶液100μl，分别加入100μl内标，混匀，另取空白甲醇200μl，按照2.5项下进行分析，各初选标志物的mrm色谱图见图1。其中，a表示空白甲醇的mrm色谱图，b表示对照品混标溶液(23.80μg/ml)的mrm色谱图，c表示老香黄(lxh0_1)的供试品溶液的mrm色谱图；初选标志物采用编号表示：1、异莨菪亭；2、东莨菪内酯；3、6,7-二甲氧基香豆素；4、5,7-二甲氧基香豆；5、水合氧化前胡素；6、柠檬苦素；7、诺米林8、佛手柑内酯；9、香叶木素；10、金圣草素；11、圣草次苷12、7-甲氧基香豆素；13、野漆树苷；14、芦丁；15、橙皮苷；16、新橙皮苷；17、甲基橙皮苷；18、香叶木苷；19、黄柏酮；20、7-羟基香豆素；21、山柰酚；i.s、山柰酚-3-o-芸香糖苷。
[0076]
对照品混标溶液的21个初选标志物的特征峰及其内标物的特征峰均有很好的分离，无杂峰干扰，峰形良好，基线平稳。在老香黄(lxh0_1)的供试品溶液中除内标物外，共检
测到15个初选标志物，确定为候选标志物，并作为有关样品质量的方法学考察指标。
[0077]
2.6.2线性关系、定量下限、最低检出限考察
[0078]
精密吸取本实施例中2.3项下制备的的一系列的标准溶液各100μl，加入100μl内标，混匀，按照2.5项下的分析条件进行分析，以对照品混标溶液的浓度为横坐标(x)，以对照品混标溶液中初选标志物的特征峰面积和内标物的比值为纵坐标(y)，得到21个初选标志物的标准曲线。本实施例中结果见表2，结果表明该测定方法线性良好，最宽线性范围在0.05-23.80μg/ml之间，相关系数均大于0.990。以信噪比(s/n)约为10计算各成分的定量下限(loq)，以s/n≈3计算各成分的最低检出限(lod)，结果见表2，仪器所测定的21种化学标志物的定量下限范围在0.05-0.09ng之间，最低检测限在0.02-0.05ng之间。
[0079]
表2初选标志物的线性关系、检出限和定量下限
[0080][0081][0082]
2.6.3精密度、重复性与稳定性实验
[0083]
精密吸取本实施例中2.3项下对照品混标溶液(23.80μg/ml)，加入内标物100μl，按照2.5项下的分析条件进行分析，连续进样六次，测定各初选标志物和内标物的特征峰面积的比值，计算得21种初选标志物相对标准偏差(rsd)为0.56％-2.13％(见表3)，说明仪器精密度良好。
[0084]
称取老香黄0年(lxh0_1)样6份，每份1.00g，精密称定，分别按照本实施例中2.4项下制备供试品溶液，加入100μl内标物，混匀，进样测定，计算所测定到的15种候选标志物含量的rsd为0.31％-2.42％(见表3)，表明该方法重复性良好；取同一老香黄供试品溶液(lxh0_1)，加入100μl内标，混匀，分别在0、2、4、78、12、24h进样分析，测定15种候选标志物
和内标峰物的特征峰面积的比值的rsd为1.12％-2.13％(见表3)，表明供试品溶液在24h中具有良好的稳定性。
[0085]
表3精密度、重复性、稳定性及加标回收率
[0086][0087][0088]
2.6.4加标回收率实验
[0089]
精密称取已知含量的老香黄0年(lxh0_1)样品0.50g各6份，精密称定，分别加入近似等量的样品中可测到的15种候选标志物，按本实施例中2.4项下制备加标回收供试品溶液，加入100μl内标，混匀，按照2.5项下的分析条件进行测定分析，计算回收率及相对标准偏差(见表3)。15种候选标志物的回收率为92.31％～104.25％，rsd为0.49％～2.5％。结果表明该方法的准确度和精密度良好，可以满足日常样品的分析要求。
[0090]
2.7不同年份老香黄样品含量测定
[0091]
取本实施2.4项下供试品溶液100μl，加入内标物100μl混匀，按照2.5项下的分析条件进行分析，按照相应的线性关系分析不同年份老香黄的样品的15种候选标志物的含量，结果见表4。结果表明最初加工好的老香黄(lxh0)的各候选标志物含量较高，其中5,7二甲氧基香豆素，柠檬苦素，诺米林、7-羟基香豆素含量较高，分别为47.465
±
1.987、168.562
±
17.851、216.731
±
26.217、和243.242
±
31.430μg/g，随着老香黄储藏年份的增加，各成分或多或少的有所降低。可能是各候选标志物可能在炮制过程中转变为其他二级代谢产物，也可能是经过多道工艺的炮制，特别是盐浸和蒸煮等步骤严重流失了各标志物的含量。
[0092]
表4不同年份老黄香中15种候选标志物的含量(μg/g,n＝-6)
[0093][0094][0095]
3结论
[0096]
本实施例建立了21种与老香黄相关初选标志物及其内标山柰酚-3-o-芸香糖苷的uplc-ms/ms的方法，其方法操作简便，灵敏度高，专属性强。方法学考察结果符合日常分析要求和规范，在老香黄中共检定到15个候选标志物，并对其进行含量分析，结果表明，最初加工的老香黄(lxh0)中5,7-二甲氧基香豆素、柠檬苦素、诺米林、7-羟基香豆素含量较高，但随着老黄香腌制时间的增加，这些复杂的炮制过程造成了这些候选标志物的流失和变化，那么能否通过某些候选标志物的变化来表征不同年份的老香黄，需要下一个实施例进行模型数学分析。
[0097]
实施例2模式识别技术判别老香黄的年份
[0098]
1材料
[0099]
simca 14,1软件中pca分析模块、hca分析模块、opls-da分析模块(瑞士umetrics公司)
[0100]
2方法与结果
[0101]
2.1基于候选标志物的pca降维分析
[0102]
主成分分析(pca)是一种降维或将多个指标，克服了单一指标的局限性，可以筛选出不同组间的显著差异性候选标志物。本实施例中采用simca14.1软件对不同年份老香黄的15种候选标志物的含量(c1-c15，编号如实施例1中表4)进行pca分析，和无监督模式下的聚类分析(hca)，结果表明前两个主成分累积贡献率达79.1％，且特征值均大于1，满足主成分的选取要求，是可以揭示样品中的大多数差异信息的。进一步，根据前两个主成分进行得
分图、化合物载荷图、层次聚类分析图的制作，见图2-图4。结果表明7个贮藏年份的老香黄在无监督模式的pca(如图2所示)处理下并没有得到很好的区分，和载荷图(如图3所示)显示各成分未获得良好的得分(值大于0.30，表示载荷显著)。并且在无监督模式下的hca聚类分析(如图4所示)中无法明显区分不同年份的样品，为了进一步研究模式识别技术能否将不同年份的老香黄完全区分，进一步用opls-da法进行分析。
[0103]
2.2基于opls-da分析的差异性化学标志物筛选
[0104]
正交偏最小二乘判别分析(opls-da)结合了正交信号矫正(osc)和pls-da方法，能够将x矩阵信息分解成与y相关和不相关的两类信息，通过去除与分类信息无关的噪音，提高模型的有效性来筛选差异变量。本实施例将7个不同年份的老香黄分为7组，分组详细同实施例1下第1项一致。通过opls-da分析结果所知各组均有良好的区分(见图5所示)，图5分析，r2x(cum)＝0.943，r2y(cum)＝1，q2(cum)＝0.855，表明模型解释度和预测度好。
[0105]
通过提取opls-da模型中15个候选标志物的vip(variable importance in the projection，变量重要性)值(如图6所示)，对15个候选标志物的含量vip值大小进行排序，筛选出vip值大于1的差异候选标志物，结果显示，候选标志物c4，c12，c15，c13，c10，c6的vip值均大于1，说明以上六种化学成分，对7个贮藏年份的老香黄的分类有着显著的影响，这些成分是引起变化的主要差异性化学标志物，其中c4为5,7-二甲氧基香豆素，c12为香叶木苷，c15为山柰酚，c13黄柏酮，c10为金圣草素，c6为柠檬苦素，其他化学成分的vip值均小于1，对不同年份的老香黄的差异性影响不大。在opls-da有监督的判别模式条件下，hca聚类分析(如图7所示)可以明显区分不同年份，并且大多数同一年份样品聚为一类，其中老香黄8年和15年的距离较近，结果表明在此模式下，不同贮藏年份的老香黄在品质上存在一定的差异。
[0106]
3结论
[0107]
本实施例结合pca、hca、opls-da相关模式识别技术，可以有效判别不同年份的老香黄，找出能区分老香黄年份的差异候选标志物，其差异候选标志物为5,7-二甲氧基香豆素，香叶木苷，山柰酚，黄柏酮，金圣草素，柠檬苦素。综合分析表4含量分析结果和筛选出来的差异候选标志物，贡献最大的差异候选标志物5,7-二甲氧基香豆素在老香黄0年含量为47.465
±
1.987μg/g之间，老香黄3年含量为17.069
±
0.542μg/g之间，老香黄8年含量为11.073
±
1.862μg/g之间，老香黄10年含量为41.905
±
2.240μg/g之间，老香黄15年含量为43.267
±
2.432μg/g之间，老香黄20年含量为51.711
±
1.439μg/g之间，该候选标志物可作为化学标志物，其含量在一定程度上可以体现不同年份的老香黄。
[0108]
实施例3盲样能力测试结果验证
[0109]
1材料
[0110]
收集不同厂家不同年份测定用样品(proficiency test，pt)共9批，编号pt_1～pt_9。其它仪器材料同实施例1中1项。
[0111]
2方法与结果
[0112]
样品按实施例1中2.4项进行供试品溶液的制备，取100μl，加入内标物100μl混匀，按照实施例1中2.5项的分析条件进行分析，按照相应的线性关系分析样品中6种化学标志物的含量，结果见表5。通过比对表5和表4中5,7-二甲氧基香豆素含量，判断盲样中各批次的年份，验证所建方法的可靠性。检测表明pt_1～pt_3检测数值落在老香黄3年(lxh3)，pt_
4～pt_6落在老香黄5年(lxh5)，pt_7～pt_9落在老香黄8年(lxh8)，分析结果与厂家报告基本一致。
[0113]
表5市场上老黄香盲样能力测试结果(μg/g,n＝3)
[0114][0115]
本发明提出了一种老香黄年份的判别方法，一方面建立老香黄的质量评价体系，控制其质量，另一方面，寻找可靠的方法对不同腌制年份老香黄进行判别，进而对市场上的老香黄进行品质鉴别。为此，能够对老香黄产业的保存、发展、商业推广提供助力。本发明提供21种与老香黄相关的初选标志物及其内标物山柰酚-3-o-芸香糖苷的uplc-ms/ms的方法，在该条件下，各初选标志物的特征峰与内标物的特征峰无杂峰干扰，峰形良好，基线平稳。该方法线性良好，灵敏度高，专属性强，方法学考察结果符合日常分析要求。发明人采用该方法在老香黄样品中共检定15个候选标志物，并对不同年份的老香黄进行含量分析，实验证实，结果表明最初加工好的老香黄(lxh0)各标志物含量较高，但随着老黄香腌制时间的增加，这些复杂的炮制过程造成了候选标志物的流失，含量或多或少的减少。
[0116]
发明人联合pca、hca、opls-da相关化学计量学模式识别技术，可以对不同年份的老香黄进行快速有效的判别，找出能区分不同年份的老香黄的化学标志物。这些化学标志物为5,7-二甲氧基香豆素，香叶木苷，山柰酚，黄柏酮，金圣草素，柠檬苦素。综合分析表4含量分析结果和筛选出来的差异标志物，贡献最大的差异化学标志物5,7-二甲氧基香豆素在老香黄0年含量为47.465
±
1.987μg/g之间，老香黄3年含量为17.069
±
0.542μg/g之间，老香黄5年含量为11.073
±
1.862μg/g之间，老香黄8年含量为41.905
±
2.240μg/g之间，老香黄10年含量为21.079
±
2.270μg/g之间，老香黄15年含量为43.267
±
2.432μg/g之间，老香黄20年含量为51.711
±
1.439μg/g之间，该标志物的含量在一定程度上可以体现不同年份的老香黄。发明人进行对该判别方法进行盲样能力测试，检测表明pt_1～pt_3检测数值落在老香黄3年(lxh3)，pt_4～pt_6落在老香黄5年(lxh5)，pt_7～pt_9落在老香黄8年(lxh8)，分析结果与厂家报告基本一致。
[0117]
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。