工程化葡萄糖脱氢酶和用于酮和胺化合物的还原胺化的方法与流程

技术特征：
1.一种工程化葡萄糖脱氢酶多肽，所述工程化葡萄糖脱氢酶多肽包含与seq id no:4、14、34、112、736、908、956和/或1062具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的多肽序列或其功能片段，其中所述工程化葡萄糖脱氢酶多肽在所述多肽序列中包含至少一个取代或取代集，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:4、14、34、112、736、908、956和/或1062编号。2.根据权利要求1所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述葡萄糖脱氢酶多肽包含表5.1、表6.1、表7.1、表8.1、表9.1、表10.1、表11.1和/或表12.1中提供的至少一个突变。3.根据权利要求1所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述多肽序列与seq id no:4具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，其中所述工程化葡萄糖脱氢酶多肽在所述多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：147、96、96/118、155、155/253、195、200和256，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:4编号。4.根据权利要求1所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述多肽序列与seq id no:14具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，其中所述工程化葡萄糖脱氢酶多肽在所述多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：17、95/96、95/96/118、95/96/118/156/200/253、95/96/147、95/96/147/200、95/96/147/200/253、95/96/155/156、95/96/155/195/200、95/96/159/195/253、95/155/156、95/155/159/200、95/155/200、96、96/147/195/200/253、96/155、96/155/159、96/155/159/195、96/155/159/200、96/156/159/195、96/156/159/195/200、96/195、147、147/155、147/155/156、147/155/156/200、147/155/159、147/195/200/253、155、155/156、155/156/195/200/253、155/159/200和253，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:14编号。5.根据权利要求1所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述多肽序列与seq id no:34具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，其中所述工程化葡萄糖脱氢酶多肽在所述多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：17、17/21、17/21/42、17/21/42/155/260、17/21/49、17/21/49/51、17/21/49/51/96、17/21/49/51/260、17/21/49/96/155/260、17/21/49/260、17/21/51/96、17/21/51/195、17/21/96、17/21/96/155、17/21/96/195/260、17/21/96/253、17/21/147/155/253、17/21/155/253、17/21/195、17/21/253、17/42、17/42/49/195/260、17/42/96、17/44、17/44/47/51/96、17/44/47/51/96/114/147/195/199/253、17/44/47/51/96/114/147/199、17/44/47/51/96/114/195/199、17/44/47/51/96/147/253、17/44/47/51/178/195、17/44/47/195/199、17/44/51/114/195/253、17/46/47/51/96/147、17/46/47/51/96/195/253、17/46/47/51/155、17/46/47/51/155/195/199、17/46/47/96/195、17/46/47/178、17/46/96/253、17/47、17/47/51、17/47/51/96/114/147/195、17/47/51/96/114/155/178/253、17/47/51/96/195、17/47/51/96/195/199、17/47/96/114/155/253、17/47/96/147/155/195/199、17/47/96/147/195/199/253、17/47/96/155、17/47/96/195/199、17/47/114、17/47/114/155/195/199/253、17/47/147/195/199/253、17/49、17/49/51、17/49/51/96/195/253、17/49/51/155/253、17/49/51/155/253/260、
17/49/51/155/260、17/49/51/253、17/49/96、17/49/96/155/253、17/49/96/195、17/49/260、17/51、17/51/96/114、17/51/96/155/178、17/51/96/155/195/199/253、17/51/96/155/199、17/51/96/155/253、17/51/96/178/195/199、17/51/96/195、17/51/96/260、17/51/114、17/51/114/253、17/51/147、17/51/155/195、17/51/178/195/253、17/51/253、17/96、17/96/114/147/155、17/96/114/147/155/178/195/199、17/96/147、17/96/147/155、17/96/155/178、17/96/155/178/253、17/96/155/195、17/96/155/195/199、17/96/178、17/96/178/195、17/96/195、17/96/195/199、17/96/195/199/253、17/96/253、17/114、17/114/253、17/147/155/253、17/147/178、17/147/199、17/155、17/155/178、17/155/178/195、17/155/195、17/155/195/253、17/155/199、17/155/253、17/178、17/178/195/253、17/195、17/195/199、17/195/199/253、17/195/253、17/199、17/253、17/260、21/49/51、21/49/96/195、21/49/96/253、21/49/195、21/51/96/155、21/96、21/96/195、21/96/253、44/46/47/51/114/178/253、44/46/47/51/155/178/253、44/46/47/96/155/195、44/46/51/96/147/178/195/199、44/46/51/96/155/195/199/253、44/46/51/96/195、44/46/51/147/155/178/195/253、44/47/51/96/114、44/47/51/96/177/178/199/253、44/47/51/114/178/253、44/47/96/114、44/47/96/195/253、44/47/147/155、44/47/147/155/199、44/96/155/178、46/47/51/96/114/178、46/47/51/114/147/195/199、46/47/51/155/195/199、46/47/96/114/195/199、46/47/96/155/178/195/253、46/47/155/195/199、46/114/147/155/178/195/199、46/114/195/199/253、47/51/96、47/51/96/114、47/51/96/147/155/195/199、47/51/96/147/195/199、47/51/96/178/195/199/253、47/51/96/195、47/51/96/195/199/253、47/51/114/253、47/51/155/178/195、47/51/155/195/253、47/96/114、47/96/114/253、47/96/155/178/195、47/96/155/195、47/96/155/195/199、47/96/178/195/253、47/96/178/253、47/96/195/199/253、47/96/195/253、47/114、47/114/155/195/199、47/114/178、47/147/195、47/155/253、47/178/195、47/178/195/199、47/195/199、49/51/96、49/96、49/96/253、51/96、51/96/114/155/195/199/253、51/96/155/178、51/96/155/178/195/253、51/96/155/195、51/96/155/195/253、51/96/195/253、51/96/199、51/96/253、51/114/155/195/199、51/114/195/199、51/147/253、51/155/195/199、51/195、51/253、96、96/114/147/155/195/199、96/114/155/178/195/199/253、96/114/155/195/253、96/114/199、96/147、96/147/155/178/195/253、96/147/178/195/199、96/147/195、96/147/195/199、96/147/253、96/155/178/199、96/155/195、96/155/199、96/155/253、96/178/195、96/178/195/199、96/195、96/195/199、96/195/253、96/199、96/199/253、96/253、114、114/147/155/253、114/178/195/199/253、114/195、114/195/199/253、132、147/155、149、154、155/178、155/178/195/199、155/195、155/195/199、155/195/199/253、155/195/253、155/253、157、167、170、178、178/195、178/199、195、196、198、214、218、251、252、256、257、259和260，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:34编号。6.根据权利要求1所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述多肽序列与seq id no:112具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，其中所述工程化葡萄糖脱氢酶多肽在所述多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：21/42/96/178/195/253、21/42/96/195、21/96、21/96/147/195、21/96/149、21/96/155/195/253、21/96/167、21/96/
167/195、21/96/178、21/96/179/195/251/253、21/96/195、21/147/149、21/147/253、21/149/178/195、21/155/178/253/256、21/178/195/256、42/96/149/253/256、94、96、96/114/155/198/218/253/256/257、96/114/155/252/253/257、96/114/155/253、96/114/196/214/253/256、96/114/214/253/256、96/147、96/147/149、96/147/149/155、96/147/167/195、96/149/155/167/178/253、96/149/155/195、96/149/178/179/251/256、96/149/178/253、96/149/198/252/253/257、96/155、96/155/167、96/155/167/178、96/155/195、96/155/196/218/253/256/257、96/155/196/252/253、96/155/198、96/155/252/253、96/167、96/178、96/178/179/195、96/195、96/196、96/196/198、96/196/201/256、96/251/253/256、96/253/257、96/256/257、98、103、114/253/256/257、147、147/149、149/167、149/195、149/218、149/253、149/257、155/167、155/178/195、155/178/195/251/253、155/195/251/253/256、155/195/253/256、155/196/198/253、167、167/195、167/195/251/253、196、196/253/256/257、198/253/256、198/256、205、214/253/256、251和257，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:112编号。7.根据权利要求1所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述多肽序列与seq id no:736具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，其中所述工程化葡萄糖脱氢酶多肽在所述多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：21/47/96/114/155/251、21/47/149/257、21/47/155/178/257、21/47/178、21/47/178/251/256/257、21/96/114/155/178、21/114/155/251/257、21/114/178/179、21/155/178/209/256、25/155、25/178/256、42/47/155/178、47/114/149/178/251、47/114/178/257、47/149、47/178、47/178/179/251/257、47/178/251/257、96/114/155/198、96/114/155/253/257、96/253、114/149/155/251/256、114/149/178/256/257、114/155/195/198/256、114/209/256/257、149、149/256/257、155、155/178/179、155/178/198/252/253、155/195/198、155/195/198/253/256/257、155/256/257、178/253、178/256、179/256/257、251和253，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:736编号。8.根据权利要求1所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述多肽序列与seq id no:908具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，其中所述工程化葡萄糖脱氢酶多肽在所述多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：21/42/149、21/42/149/214/253、21/42/179/214/244/253、21/42/253/260/261、21/149、21/149/179、21/149/179/253、21/149/179/253/260、21/149/179/253/260/261、21/149/179/261、21/149/260/261、21/149/261、21/179/214/253、21/179/253、21/179/261、21/214/253、21/253、40、42/149/179/253/260、42/149/179/260/261、42/149/214/253、42/179/253/261、42/253、104、111、149、149/179、149/179/253、149/179/253/260/261、149/179/260、149/179/260/261、149/179/261、149/253、149/261、160、178、179/214/253、179/253、179/253/260、179/253/260/261、179/253/261、179/260/261、179/261、253、253/260/261、253/261和255，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:908编号。9.根据权利要求1所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述多肽序列与seq id no:956具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更多的序列同一性，其中所述工程化葡萄糖脱氢酶多肽在所述多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：3、21/104/160/178/179、21/104/160/255/258、21/104/178/179/255、21/104/178/255/258、21/104/255、21/104/255/258、21/178/179/255/260、21/255/260、31、32、40、40/104/178/179、40/160/178、46/82/259、103、104/149/255/258/260、104/149/258、104/160、104/160/178、104/160/178/179/255、104/160/178/179/260、104/160/178/255/260、104/160/179、104/178/179/255/258、104/178/255/258/260、104/178/255/260、104/179、104/255/260、104/258/260、111/149/255/258、111/149/255/260、111/160/178/179/255/258/260、111/160/255/260、154、156、160、160/178/179、174、194、197、205、205/229、222、253、257、258/260和260，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:956编号。10.根据权利要求1所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述多肽序列与seq id no:1062具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，其中所述工程化葡萄糖脱氢酶多肽在所述多肽序列中选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：3/31/154/205/257、3/31/205、3/154/205、31/55/154/205、31/55/205、31/154/205、31/154/205/257、31/205、31/205/222、40/55/205、40/154/205、40/154/205/257、40/174/205/229、40/205/229、54/205/253、63、63/149/154/174/178/253、63/149/154/174/205/253、63/149/156/178/205/253、63/149/205、63/149/205/229/253、63/149/205/253、63/154、63/154/178/205/253、63/154/205、63/154/205/229、63/154/205/229/253、63/154/205/253、63/156、63/156/205、63/205、63/205/253、63/253、67、98、149/154、149/154/205、149/156/253、149/205、149/205/253、154、154/160、154/160/205、154/160/205/222/257、154/160/253、154/174、154/174/178/205、154/174/205/229、154/205、154/205/222、154/205/222/257、154/205/229、154/205/253、154/205/257、154/229、154/253、156/205、156/205/253、156/229/253、160、160/205、160/205/229、194、205、205/222、205/229、205/229/253、205/253、208、226和253，并且其中所述多肽序列的氨基酸位置参考seq id no:1062编号。11.根据权利要求1所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述工程化葡萄糖脱氢酶多肽包含与seq id no:4、14、34、112、736、908、956和/或1062至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多相同的多肽序列或其功能片段。12.根据权利要求1所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述工程化葡萄糖脱氢酶多肽包括seq id no:4、14、34、112、736、908、956和/或1062或其功能片段。13.根据权利要求1所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述工程化葡萄糖脱氢酶多肽包含与seq id no:6至seq id no:1384中列出的任何偶数编号序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。14.根据权利要求1所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述工程化葡萄糖脱氢酶多肽包括seq id no:6-1384的偶数编号序列中列出的多肽序列。15.根据权利要求1-14中任一项所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述工程化葡萄糖脱氢酶多肽包含与seq id no:4的工程化葡萄糖脱氢酶多肽相比表现出至少一种改进的性质的多肽序列。
16.根据权利要求15所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述改进的性质包括结构式(iv)的化合物的改进的产生其中r1选自氢原子、或任选地被取代的烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基烷氧基、羟烷基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、卤代烷基、烷硫基烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、杂环烃基、杂芳基和杂芳基烷基；并且其中r2独立地选自烷基、烯基、炔基、羟烷基、羧基、氨基羰基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、羧基烷基、烷基氨基、卤代烷基、烷硫基烷基、环烷基、芳基、芳基烷基、杂环烃基、杂芳基和杂芳基烷基；并且其中r3独立地选自甲基、d3-甲基和乙基。17.根据权利要求15所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述改进的性质包括化合物(1)的改进的产生18.根据权利要求15所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述改进的性质包括改进的对化合物(2)的利用19.根据权利要求15所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述改进的性质包括改进的对化合物(3)的利用20.根据权利要求15所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述改进的性质包括化合物(1)
从化合物(2)和化合物(3)的改进的产生。21.根据权利要求15所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述改进的性质包括改进的对映选择性。22.根据权利要求15所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述改进的性质包括改进的稳定性。23.根据权利要求1-22中任一项所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述工程化多肽是纯化的。24.一种组合物，所述组合物包含至少一种根据权利要求1-23中任一项提供的葡萄糖脱氢酶多肽。25.一种工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸编码至少一种根据权利要求1-23中任一项所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽。26.一种工程化多核苷酸序列，所述工程化多核苷酸序列编码至少一种工程化葡萄糖脱氢酶多肽，其中所述多核苷酸序列包含与seq id no:3、13、33、111、735、907、955和/或1061的至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，其中所述葡萄糖脱氢酶多肽的多核苷酸序列在一个或更多个位置处包含至少一个取代。27.根据权利要求25或26所述的工程化多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列包含与seq id no:3、13、33、111、735、907、955和/或1061的至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。28.根据权利要求25-27中任一项所述的工程化多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列
包括seq id no:3、13、33、111、735、907、955和/或1061。29.一种工程化多核苷酸，所述工程化多核苷酸包括seq id no:5至seq id no:1383中列出的奇数编号序列。30.一种载体，所述载体包含根据权利要求25至29中任一项所述的工程化多核苷酸。31.根据权利要求30所述的载体，所述载体还包含至少一种控制序列。32.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求30和/或31所述的载体。33.根据权利要求32所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞产生至少一种根据权利要求1-23中任一项所述的工程化葡萄糖脱氢酶多肽。34.一种在宿主细胞中产生工程化葡萄糖脱氢酶多肽的方法，所述方法包括在合适的条件下在培养基中培养根据权利要求32和/或33所述的宿主细胞，从而产生至少一种工程化葡萄糖脱氢酶多肽。35.根据权利要求34所述的方法，所述方法还包括回收所述工程化葡萄糖脱氢酶多肽的步骤。36.根据权利要求34和/或35所述的方法，所述方法还包括纯化所述至少一种工程化葡萄糖脱氢酶多肽的步骤。

技术总结
本申请提供了具有亚胺还原酶活性的工程化葡萄糖脱氢酶多肽、编码该工程化多肽的多核苷酸、能够表达该工程化多肽的宿主细胞、以及使用这些工程化多肽和一系列酮和胺底物化合物以制备仲胺和叔胺产物化合物的方法。物以制备仲胺和叔胺产物化合物的方法。


技术研发人员：易翔 奥斯卡
受保护的技术使用者：科德克希思公司
技术研发日：2020.04.23
技术公布日：2022/2/24