一种基于目标区域捕获的甲基化突变检测方法及试剂盒与流程

：
1.本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于目标区域捕获的甲基化突变检测方法及试剂盒。


背景技术：

2.恶性肿瘤目前已成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一，在充分有效且不良反应极低的抗肿瘤药物被开发之前，肿瘤的早期发现仍然是降低肿瘤病死率的最有效方法。早期原位肿瘤在发生转移之前，可以通过手术切除，但肿瘤一旦发生转移，则很难通过手术根治。从肿瘤细胞产生到发生转移之前的窗口期，是检测和诊断肿瘤的黄金时期。研究表明，初期转移肿瘤患者的预后效果明显优于已发生转移的晚期肿瘤患者。对于多数肿瘤患者，早期发现能够使患者得到及时的治疗，并拥有更大的治愈机会。因此，癌症的早筛具有重要的医学价值和社会价值，且肿瘤的早期发现能够极大的提高治愈率、降低死亡率、降低治疗副作用和治疗费用。近年来随着表观遗传学研究的进展，dna甲基化已经成为目前研究最多且最清楚的表观修饰方式，在肿瘤的发生发展中，dna甲基化异常是其重要的诱因，其在肿瘤发生的早期阶段即可发生并具有组织特异性，提示了甲基化可以作为新的肿瘤分子标志物具有独特的优势。
3.dna甲基化是表观遗传中最常见的一种修饰现象，指的是甲基转移酶将一个甲基基团可逆地添加到dna序列中胞嘧啶的第五号位置的碳原子上面，从而形成5-甲基胞嘧啶。dna的甲基化与许多人类复杂的疾病有关，包括癌症、肥胖和肥胖相关疾病、糖尿病、神经退行性疾病及年龄相关的常见疾病等。由于dna甲基化而导致的基因沉默，在胚胎的早期发育、基因组印记和x染色体失活等诸多方面起着重要的作用，但是某些基因的异常甲基化也会使得基因表达调控发生紊乱，进而导致疾病的发生。所以dna的甲基化状态与癌症密切相关，异常的甲基化能够在早期癌症中被检测到，因此，dna的甲基化状态可以用来作为泛癌种诊断的标志物。
4.高通量测序(high-throughput sequencing)又称为下一代测序(nextgeneration sequencing，ngs)，通过ngs技术能够同时处理数以百万计的基因片段，相较于第一代测序方法，它的基因检测的灵敏度更高，效率更快且耗费成本更低，能够实现大规模的高通量、高深度并行测序。ngs技术的特点使其迅速运用在医学基础与临床的研究，在检测病原微生物、药物基因组、各类遗传病，尤其是在肿瘤基因学方面发挥的巨大的作用。ngs技术广泛应用于实体肿瘤中，发现了更多新的基因突变，在人类恶性肿瘤变异遗传途径的研究中发挥了重大的作用。虽然ngs测序与传统的sanger法测序相比成本大大降低，但全基因组测序成本仍然较高，且许多研究应用并不需要全基因组测序，而对于一个或多个样本的目标区域测序的需求较为迫切，因此对目标区域有针对性地测序方法能够显著地降低测序成本，同时也能缩短测序时间和生物信息分析周期。
5.目标序列捕获技术的出现，满足了上述需求。目标序列捕获测序是针对已知的特定基因组区域设计探针捕获后进行测序，在靶向富集过程中不感兴趣的dna片段会被最大
限度的去除，使得测序所产生的结果主要集中于感兴趣的目标区域。目前常用的序列捕获方法有：pcr法、分子倒置探针法(molecular insersion probe，mip)和杂交捕获法。pcr法具有高灵敏性、高特异性和重复性好等优点，不过这种方法并不能很容易扩大目标区域，适合捕获一些很小的区域，且部分区域扩增困难，针对突变频率较低的体细胞突变检测灵敏度不够等问题没有很好的解决办法。分子倒置探针法具有样品前期处理简单、样品需求量小等优点，然而其分子探针合成成本较高，均一性较差，难以对一些区域较大的基因组序列进行捕获。杂交捕获法通过目标dna片段和已带有生物素标记探针特异性杂交方式将目标序列捕获和分离出来。这一技术在二代测序平台中应用较为广泛，尤其是液相杂交捕获方法在目标区域捕获技术领域有着独有的优势。液相杂交捕获技术可以克服上述pcr法和分子倒置探针法的问题，具有更好的捕获效率，更少的偏好性，更高的检测灵敏度，更简便的操作和适合的成本等优点。
6.重亚硫酸盐测序(bisulfite-seq)是前期用重亚硫酸盐处理，将基因组中未发生甲基化的c碱基转换成u，然后进行pcr扩增变成t，与原本甲基化修饰的c碱基进行区分，再对pcr产物进行高通量测序的方法。该方法具有通量高、耗时少、单碱基分辨率高与高覆盖率的优点，被称为甲基化测序的金标准。避免了酶切法中因为酶切不完全而导致的假阳性问题，且敏感性较高。


技术实现要素：

7.为解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种基于目标区域捕获的甲基化突变检测方法及试剂盒，本发明的检测方法灵敏、可靠、可用于早期癌症的筛查。
8.本发明目的是通过以下方式实现：
9.本发明提供一种基于目标区域捕获甲基化突变检测方法，主要包括以下步骤：
10.(1)提取全血游离dna，经过末端修复、末端加“a”、连接illumina测序平台专用index测序接头，构建游离dna基因文库；
11.(2)将步骤(1)得到的游离dna基因文库经重亚硫酸盐处理后，进行pcr扩增，通过ampure xp磁珠纯化；
12.(3)将步骤(2)纯化的产物进行甲基化探针液相杂交，对混合物中的高dna甲基化片段进行甲基化捕获，然后经纯化得到捕获后产物片段；
13.(4)对步骤(3)所得的产物片段进行扩增，然后利用ampure xp磁珠对扩增产物进行纯化回收，得到上机文库；
14.(5)使用illumina测序平台进行测序，通过生物信息学对得到实验数据进行分析，获得目标区域内甲基化突变情况。
15.进一步地，步骤(1)中所述的游离dna通过circulating nucleic acid kit试剂盒提取获得。
16.进一步地，步骤(1)中所述的末端修复、末端加“a”通过end repair&a-tailing enzyme mix反应体系完成。
17.进一步地，步骤(2)中所述的重亚硫酸盐处理通过qiagen epitect fast bisulfite kit试剂盒完成。
18.进一步地，步骤(3)中所述的甲基化探针液相杂交通过甲基化捕获biscap试剂盒
完成。
19.进一步地，步骤(3)中所述的甲基化探针液相杂交捕获目标区域为610个与肿瘤发生发展密切相关的基因启动子区域。
20.进一步地，步骤(4)中所述的扩增通过pcr反应进行。
21.进一步地，步骤(5)中所述的illumina测序平台包括illmina nextseq 500、illumina hiseq2000、illumina hiseq2500和illumina miseq。
22.本发明一方面提供一种用于上述的基于目标区域捕获甲基化突变检测方法的试剂盒，试剂盒包括以下成分：游离dna文库构建的试剂，重亚硫酸盐处理、扩增及纯化回收试剂，甲基化探针液相杂交的试剂，文库扩增富集试剂。
23.进一步地，所述的游离dna文库构建的试剂主要包括游离dna提取试剂、文库构建中常用的末端修复、加“a”及连接接头所需要的酶、缓冲液及illumina测序平台专用测序接头。
24.进一步地，所述的重亚硫酸盐处理、扩增及纯化回收试剂主要包括重亚硫酸盐处理使用的重亚硫酸盐、dna保护缓冲液、清洗液，pcr扩增反应体系以及磁珠纯化所用的洗脱缓冲液。
25.进一步地，所述的甲基化探针液相杂交的试剂主要包括甲基化捕获探针、捕获磁珠、洗脱缓冲液。
26.进一步地，所述的文库扩增富集试剂主要包括文库扩增所需要的酶及缓冲液，以及产物回收纯化所需要的磁珠。
27.本发明还提供上述试剂盒在泛癌种早筛中的应用。
28.本发明的有益效果：
29.本发明提供的一种基于目标区域捕获的甲基化突变检测方法及试剂盒，能够一次性捕获多个基因的目标甲基化检测区域，获得样本多个基因目标区域甲基化突变序列信息，能够准确有效分析目标区域甲基化状态，使得对目标基因区域进行高通量、高灵敏度、高准确度的甲基化检测成为现实，极大降低成本；以非入侵的方式用于无症状人群的早期筛查，降低了侵入性检测造成的危害；提供了一种肿瘤早筛的检测方法，能够获得更准确有效的检测结果。
具体实施方式
30.以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
31.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细的描述，但是本领域技术人员将会理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本技术而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节，也可以实现本技术各权利要求保护的技术方案。
32.实施例1
33.实验选取4个游离dna血浆样本，对样本进行文库构建，液相杂交捕获与捕获后上机测序。
34.血浆游离dna的提取方法参照qiagen公司的circulating nucleic acid kit试剂盒，操作步骤如下所示：
35.1.cfdna的提取
36.1)用移液器将1ml的血浆样本加入一个干净的50ml离心管中，做好标记，加入200μl的proteinase k与0.8ml的acl，点振涡流30s，在60℃水浴孵育30min；
37.2)加入1.8ml的acb buffer(确认已加入异丙醇)，点振涡流30s，冰上孵育5min；
38.3)将小的20ml扩张器插入mini柱上，将mini柱插入真空器上待用，将步骤2)中所得溶液倒入扩张器中后打开真空泵(真空压在-200～-800mpa)液体抽干后关闭真空泵，做好标记；
39.4)加入600μl的acw1(确认加入无水乙醇)到扩张器中开真空泵(真空压在-200～-800mpa)液体抽干后关闭真空泵；
40.5)加750μl的acw2(确认加入无水乙醇)到扩张器中开真空泵(真空压在-200～-800mpa)液体抽干后关闭真空泵；
41.6)加750μl的无水乙醇(96％～100％)到扩张器中开真空泵(真空压在-200～-800mpa)液体抽干后关闭真空泵；
42.7)弃扩张器，留mini柱放到2ml离心管中，14000rpm离心3min；
43.8)放入56℃金属浴干燥10min(开盖)；
44.9)将mini柱放到新的1.5ml离心管中，加入55μl的水室温放置5min；注：洗脱缓冲液ave平衡至室温(15-25℃)且必须分配到膜的中心；
45.10)在14000rpm离心1min洗脱cfdna。
46.2.将提取好的游离dna样本分别进行文库构建，经过末端修复、加“a”及连接等过程，将4组dna片段连上不同的index测序接头(相关试剂来自kapa hyper prep kit illumina platforms)；首先进行末端修复及3’端加a，反应体系如表1所示：
47.表1.游离dna末端修复及3’端加a的反应体系
[0048][0049]
使用移液器吸打混匀(避免剧烈震荡混匀)，短暂离心；
[0050]
反应条件：热盖温度85℃，20℃30min，65℃30min，4℃ever。
[0051]
3.连接接头
[0052]
将上述反应的pcr管中，按如表2在冰盒上配制反应体系：
[0053]
表2.连接接头的反应体系
[0054][0055]
使用移液器吸打混匀(避免剧烈震荡混匀)，短暂离心；
[0056]
反应条件：关闭热盖，20℃15min，4℃ever。
[0057]
4.连接后纯化：
[0058]
1)pcr反应结束后向样品中加入88μl agencourt ampure xp磁珠，用移液器吸打混匀；
[0059]
2)室温孵育5min后，将pcr管置于磁力架上3min待溶液澄清；
[0060]
3)保持pcr管在磁力架上，移除上清，向pcr管中加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s；
[0061]
4)保持pcr管在磁力架上，移除上清，向pcr管中加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清；
[0062]
5)室温孵育5min，使残留的乙醇彻底挥发；
[0063]
6)加入42μl nuclease-free water，将pcr管从磁力架取下，吸打混匀；
[0064]
7)室温静置2min后，将pcr管置于磁力架上2min待溶液澄清；
[0065]
8)吸取40μl上清液转移到新的pcr管中，标记样品信息。
[0066]
5.重亚硫酸盐处理：
[0067]
1)重亚硫酸盐处理所需试剂均来自于qiagen epitect fast bisulfite kit试剂盒，根据表3配制反应体系进行重亚硫酸盐处理：
[0068]
表3.重亚硫酸盐处理的反应体系
[0069][0070]
吸打混匀后，置于pcr仪上，反应条件：热盖温度105℃，95℃5min，60℃10min，95℃5min，60℃10min，4℃ever。
[0071]
2)反应程序结束后，将样品转移至1.5ml离心管中，加入310μl buffer bl与250μl乙醇，涡旋混匀15s，短暂离心后将混合液体加入带有收集管的离心柱中；
[0072]
3)静置1min，10000rpm离心1min，将收集管中的液体重新转移至离心柱中，1000rpm离心1min，弃掉离心柱中的液体；
[0073]
4)加入500μl buffer bw，10000rpm离心1min，弃废液；
[0074]
5)加入500μl buffer bd，盖好管盖，室温放置15min，10000rpm离心1min，弃废液；
[0075]
6)加入500μl buffer bw，10000rpm离心1min，弃废液；
[0076]
7)重复步骤6)一次；
[0077]
8)加入250μl乙醇，10000rpm离心1min，弃废液；
[0078]
9)将离心柱放置到2ml收集管中，10000rpm离心1min，弃废液；
[0079]
10)将离心柱放置到干净的1.5ml离心管中，加入20μl rnase-free water到离心柱膜中心，室温放置1min，10000rpm离心1min；
[0080]
11)将收集管中的液体重新转移至离心柱中，室温放置1min，10000rpm离心1min。
[0081]
6.pre-pcr反应：
[0082]
根据所选择的index类型的不同，按照对应体系在冰盒上进行配制pcr反应体系：
[0083]
表4.pcr的反应体系
[0084][0085]
吸打混匀后，置于pcr仪上，反应条件：热盖温度105℃，98℃2min；98℃20s，60℃30s，72℃30s，共13个循环；72℃1min，4℃ever。
[0086]
7.pcr扩增后纯化
[0087]
将agencourt ampure xp磁珠从4℃冰箱取出至室温，涡旋震荡混匀后备用。
[0088]
1)在步骤6的pcr产物中，加入50μl磁珠，吸打混匀，室温静置5min后，将pcr管置于磁力架上3min，待溶液澄清；
[0089]
2)保持pcr管置于磁力架上，移除上清，向pcr管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s；
[0090]
3)保持pcr管置于磁力架上，移除上清，再次向pcr管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清；
[0091]
4)室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发；
[0092]
5)加入30μl的nuclease-free water，将pcr管从磁力架取下，吸打混匀，静置2min；
[0093]
6)将pcr管置于磁力架上2min待溶液澄清，吸取28μl上清液，转移到新的pcr管中，做好标记；
[0094]
7)经质检后进行后续实验。
[0095]
8.甲基化探针液相杂交捕获
[0096]
甲基化探针液相杂交捕获所需试剂均来自于甲基化捕获biscap试剂盒。其中hyb buffer组分为100-150mm的磷酸二氢钠、4
×
柠檬酸钠缓冲液、1-3mm的乙二胺四乙酸、2
×
denhardt溶液、2-5mg/ml的carrier rna及15-20w/w％的硫酸葡聚糖；biscap enhancer为100％甲酰胺溶液；hyb human block为购买的商品化thermo fisher human cot-1 dna；adaptor block为购买艾吉泰康eubo-illumina试剂；rnase block为购买艾吉泰康rnase block试剂；biscap target probe为根据表8提供的目标基因序列人工合成的探针混合物。
[0097]
1)取750ng步骤7制备的文库加入pcr管中，做好标记，多个文库混合杂交时，每个
文库加入500ng，往pcr管中加入10μl biscap enhancer。将pcr管放入真空浓缩离心机，打开pcr管盖，启动离心机，打开真空泵开关旋干混合组分。
[0098]
2)文库浓缩完成后配制杂交反应体系：
[0099]
表5.杂交反应体系
[0100][0101]
3)吸打混匀并简短离心；
[0102]
4)将pcr管置于pcr仪上，反应条件：热盖温度105℃，95℃5min；65℃hold，运行以上程序结束后，孵育过夜。
[0103]
5)从4℃取出捕获磁珠(cap heads)，涡旋震荡重悬，置于室温平衡30min；
[0104]
6)取50μl磁珠加入新的pcr管内，置于磁力架上1min待溶液澄清，移除上清；
[0105]
7)从磁力架上取下pcr管，加入180μl binding buffer轻轻吸打数次混匀，重悬磁珠；
[0106]
8)将pcr管置于磁力架上1min，移除上清；
[0107]
9)重复步骤3)～4)一次，共清洗磁珠2次；
[0108]
10)从磁力架上取下pcr管，加入180μl binding buffer轻轻吸打重悬混匀磁珠待用。
[0109]
11)保持杂交产物在pcr仪上，将上步重悬后的180μl cap heads加入到杂交产物中，用移液器吸打混匀，置于旋转混匀仪上室温结合30min；
[0110]
12)将pcr管置于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清液；
[0111]
13)向杂交产物内加入150μl的wash buffer1，轻轻吸打混匀，置于旋转混匀仪上清洗15min，然后短暂离心，将pcr管放于磁力架上2min，使溶液澄清，移除上清；
[0112]
14)加入150μl 50℃预热的targetseq one wash buffer，轻轻吸打混匀，然后短暂离心，置于恒温震荡混匀仪上50℃孵育10min；
[0113]
15)短暂离心，将pcr管放置于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清；
[0114]
16)重复步骤4)～5)两次，共清洗磁珠3次；
[0115]
17)保持样品在磁力架上，向pcr管内加入150μl 80％乙醇，静置30s后彻底移除乙醇溶液，室温晾干；
[0116]
18)向pcr管中加入24μl nuclease-free water，从磁力架上取下pcr管，用移液器轻轻吸打重悬混匀磁珠待用。
[0117]
9.捕获后pcr扩增
[0118]
1)捕获后需要对dna文库进行pcr扩增，按下表配制反应体系：
[0119]
表6.pcr扩增反应体系
[0120][0121]
轻轻吹打混匀，立即置于pcr仪上，运行pcr仪程序：95℃1min；98℃20s，60℃30s，72℃30s，共16个循环；72℃5min，4℃ever。
[0122]
pcr后产物纯化回收：
[0123]
2)pcr结束后向样品加入55μl agencourt ampure xp磁珠，吸打混匀，室温静置5min；
[0124]
3)短暂离心，将pcr管置于磁力架上3min待溶液澄清；
[0125]
4)保持pcr管在磁力架上，移除上清，向pcr管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s；
[0126]
5)保持pcr管在磁力架上，移除上清，再次向pcr管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s，彻底移除上清；
[0127]
6)室温静置5min，使残留乙醇彻底挥发；
[0128]
7)加入25μl的nuclease-free water，将pcr管从磁力架取下，吸打混匀，室温静置2min；
[0129]
8)短暂离心，将pcr管置于磁力架上2min待溶液澄清，吸取23μl上清液转移到1.5ml离心管，标记样品信息。
[0130]
9)取1μl文库使用qubit dsdna hs assay kit进行定量，记录文库浓度；
[0131]
10)取1μl样品使用qsep进行片段长度测定，主峰长度约在270bp-320bp之间。得到捕获后样本文库，利用illumina高通量测序平台测序得到下机数据，经过生信分析后可得到目标区域内甲基化突变情况数据结果。结果如表7所示。
[0132]
表7. 4例血浆游离dna样本检测数据结果
[0133][0134]
由上表可知，4例样本目标区域覆盖度均大于99％，捕获效率较高，bismark比对率大于70％，目标区域平均深度满足甲基化突变分析条件，检测相关性能参数优越，具有良好的检测性能及应用价值。
[0135]
本实施例中甲基化液相杂交捕获目标区域为610个与肿瘤发生发展密切相关的基因启动子区域，具体基因名称与染色体定位如表8所示：
[0136]
表8.基于甲基化突变检测的610个目标基因信息表
[0137]
[0138]
[0139]
[0140]
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145]
[0146]
[0147]
[0148]
[0149]
[0150]
[0151][0152]
实施例2
[0153]
选取5例肠癌患者样本，5例健康人群样本，按照实施例1的方法对这10例样本进行血浆样本的采集；cfdna提取；文库构建；甲基化液相杂交捕获等实验流程，并通过illumina平台测序，得到测序数据后经过生物信息分析方法经过数据预处理、bismark比对、cpg识别分析出样本甲基化突变信息，计算样本甲基化突变评分，最终得到检测结果如表9所示。
[0154]
表9. 10例临床样本甲基化突变检测结果
[0155][0156]
根据检测结果，肠癌样本组样本检测结果甲基化突变评分均高于cut-off值0.730，结果判断为肿瘤高风险，健康人群样本组检测结果甲基化突变评分均低于cut-off值0.730，结果判断为肿瘤低风险，检测结果符合临床信息。
[0157]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。