一种基于目标区域捕获的甲基化突变检测方法及试剂盒与流程

技术特征：
1.一种基于目标区域捕获甲基化突变检测方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)提取全血游离dna，经过末端修复、末端加“a”、连接illumina测序平台专用index测序接头，构建游离dna基因文库；(2)将步骤(1)得到的游离dna基因文库经重亚硫酸盐处理后，进行pcr扩增，通过ampure xp磁珠纯化；(3)将步骤(2)纯化的产物进行甲基化探针液相杂交，对混合物中的dna甲基化片段进行捕获，然后经纯化得到捕获后产物片段；(4)对步骤(3)所得的产物片段进行扩增，然后利用磁珠对扩增产物进行纯化回收，得到上机文库；(5)使用illumina测序平台进行测序，通过生物信息学对得到实验数据进行分析，获得目标区域内甲基化突变情况。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的游离dna通过circulating nucleic acid kit试剂盒提取获得；所述的末端修复、末端加“a”通过end repair&a-tailing enzyme mix反应体系完成。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的重亚硫酸盐处理通过qiagen epitect fast bisulfite kit试剂盒完成。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述的甲基化探针液相杂交捕获的目标区域为610个与肿瘤发生发展密切相关的基因启动子区域。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述的扩增通过pcr反应进行。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(5)中所述的illumina测序平台包括illmina nextseq 500、illumina hiseq2000、illumina hiseq2500和illumina miseq。7.一种用于权利要求1-6任一项所述的基于目标区域捕获甲基化突变检测方法的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括以下成分：游离dna文库构建的试剂，重亚硫酸盐处理、扩增及纯化回收试剂，甲基化探针液相杂交的试剂，文库扩增富集试剂。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的游离dna文库构建的试剂主要包括游离dna提取试剂、文库构建中的末端修复、加“a”及连接接头所需要的酶、缓冲液及illumina测序平台专用测序接头；所述的重亚硫酸盐处理、扩增及纯化回收试剂主要包括重亚硫酸盐处理使用的重亚硫酸盐、dna保护缓冲液、清洗液，pcr扩增反应体系以及磁珠纯化所用的洗脱缓冲液。9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的甲基化探针液相杂交的试剂主要包括捕获探针、捕获磁珠、洗脱缓冲液；所述的文库扩增富集试剂主要包括文库扩增所需要的酶及缓冲液，以及产物回收纯化所需要的磁珠。10.权利要求7-9任一项所述的试剂盒在泛癌种早筛中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于目标区域捕获的甲基化突变检测方法及试剂盒，属于分子生物学技术领域。首先构建游离DNA基因文库，经重亚硫酸盐处理后，进行PCR扩增，通过磁珠纯化，纯化的产物进行甲基化探针液相杂交，对混合物中的DNA甲基化片段进行捕获，然后经纯化得到捕获后产物片段，扩增后利用磁珠对扩增产物进行纯化回收，得到上机文库，使用Illumina测序平台进行测序，通过生物信息学对得到实验数据进行分析，获得目标区域内甲基化突变情况。本发明的检测方法能够一次性获得样本多个基因目标区域甲基化突变信息，使得对目标基因区域进行高通量、高灵敏度、高准确度的甲基化检测成为现实。现实。


技术研发人员：李宏志 刘琦 赵金银 杨金 许立志 李杰
受保护的技术使用者：大连晶泰生物技术有限公司
技术研发日：2021.12.01
技术公布日：2022/2/18