一种永生化牦牛瘤胃上皮细胞系及其构建方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种永生化牦牛瘤胃上皮细胞系及其构建方法。


背景技术：

2.牦牛是世界上能够适应青藏高原地区特殊严酷自然环境的特有牛种，是当地牧民赖以生存的重要生活和生产资料，也是牧区脱贫致富的主要支柱产业。我国是世界上牦牛养殖大国，占世界牦牛养殖总量的92％以上，主要分布在我国的西藏、青海、四川、甘肃、云南和新疆等地。有关牦牛的遗传育种、营养与饲料、疫病防控等基础研究和应用基础研究，我国处于世界领先水平。迄今为止国内外对瘤胃的研究越来越多，瘤胃上皮细胞内的调控机制也备受关注。反刍动物在生理结构上不同于单胃动物的最大特点是反刍动物具有复胃结构，在复胃中瘤胃最重要。瘤胃上皮组织是瘤胃内环境与宿主机体环境的重要屏障，瘤胃上皮是瘤胃的主要部位，大量的上皮乳头从瘤胃表面伸入内腔，极大的增加了吸收挥发性脂肪酸和电解质的表面积，瘤胃上皮层吸收的营养物质是整个动物能量代谢不可或缺的。牦牛作为一种常年生活在青藏高原特殊地域环境中的优势畜种，其瘤胃代谢与其他反刍动物相比存在许多特异性。然而目前的研究中，牦牛瘤胃上皮细胞的研究较少并且稳定来源的瘤胃上皮细胞系还未建立，制约了对牦牛瘤胃上皮细胞相关的研究，使其相关领域的技术匮乏影响更多分子生物学领域的发展。目前牦牛来源的原代细胞或者细胞系匮乏，获得更多牦牛来源的细胞系丰富牦牛相关的细胞分子调控机制至关重要。
3.绝大多数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力，在不能分裂后就进入衰老状态。此时细胞仍然是存活的，但细胞的基因和蛋白的表达谱发生了很大改变。衰老的细胞不能在一些常规的刺激下再诱导细胞分裂，并且衰老细胞的细胞周期分布也比较特殊，不同于一些损伤诱导的细胞休眠，也不同于细胞生长接触抑制的情况，衰老细胞通常体积变大。研究发现原代牦牛瘤胃上皮细胞在体外培养也出现无法长期传代保存，传代次数增加对原代细胞形态和生理功能有严重的损害作用。同时数量有限的分离组织，严重限制了外源营养物质在细胞水平上的分子表达机制。
4.公开号为cn107881197a的中国专利公开了一种永生化奶牛瘤胃上皮细胞系及其构建方法，所述构建方法包括如下步骤：步骤a)将采集到的奶牛瘤胃上皮组织在培养基中剪碎清洗消化后进行原代培养，得到瘤胃上皮细胞；步骤b)将步骤a)所述的瘤胃上皮细胞与携带sv40t抗原基因的病毒液进行孵育得到感染的瘤胃上皮细胞；步骤c)将步骤b)感染的瘤胃上皮细胞进一步培养得到永生化的奶牛瘤胃上皮细胞系。虽然本发明的永生化奶牛瘤胃上皮细胞系为奶牛瘤胃生理调控和营养吸收机制研究提供试验细胞模型，培养方法简单、生长速度快，本发明的构建方法可获得具有生理功能且能连续传代的brecs，但是由于奶牛和牦牛物种的显著差异，导致该方法培养不出永生化的牦牛瘤胃上皮细胞系。经检索，关于永生化牦牛瘤胃上皮细胞系的建立至今未有见报道。因此迫切需要建立一株能够稳定传代的永生化牦牛瘤胃上皮细胞系，对牦牛的基础研究有着重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种细胞系功能完整，能维持牦牛瘤胃上皮细胞原有特性的永生化牦牛瘤胃上皮细胞系；
6.本发明的另一目的在于提供一种操作方法简单、永生化成功率高的构建永生化牦牛瘤胃上皮细胞系的方法。
7.本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种永生化牦牛瘤胃上皮细胞系，所述永生化牦牛瘤胃上皮细胞系保藏编号为：cctcc no.c2021245，分类命名为：永生化牦牛瘤胃上皮细胞系sv40t-yrec-htert。保藏日期为：2021年10月14日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学。
8.进一步地，所述的牦牛为成年牦牛。
9.一种永生化牦牛瘤胃上皮细胞系的构建方法，它包括以下步骤：
10.s1.样品前处理：采集牦牛的瘤胃上皮组织，清洗干净后剪取瘤胃乳头，加入含有抗生素的hanks溶液清洗干净；
11.s2.酶消化及培养：将清洗干净后的瘤胃乳头中加入i型胶原酶，37℃恒温气浴振荡30min后，将酶消化后的瘤胃乳头置于改良的dmemf/12细胞完全培养基中4-8min，并将消化后带有少量培养基的瘤胃乳头均匀平铺在鼠尾胶原蛋白包被的培养皿中，各组织块间距分散，倒置培养皿在37℃、5％co2培养箱中培养，培养至瘤胃乳头周围爬出的细胞增殖融合至50％时，去除组织块并清洗细胞；其中，所述改良的dmemf/12细胞完全培养基为dmemf/12细胞完全培养基中还含有200u/ml青霉素，0.2mg/ml链霉素，100μg/ml庆大霉素和10％胎牛血清；
12.s3.纯化：将步骤s2中清洗后的细胞中加入胰蛋白酶的edta溶液，放入37℃、5％co2培养箱中消化处理细胞2min后终止消化，清洗后得到纯化的牦牛瘤胃上皮细胞；
13.s4.病毒感染：将纯化的牦牛瘤胃上皮细胞置于细胞完全培养基生长至细胞70％融合时，添加携带有sv40t和htert基因的慢病毒感染细胞过夜，且慢病毒的moi＝80，持续培养4d后添加嘌呤毒素后并持续培养96h，进行筛选细胞系；其中，所述的细胞完全培养基为：rpmi-1640 10％fbs 10ng/ml egf 2ng/ml bfgf 2ng/ml igf-1 0.5ug/ml氢化可的松 1％青霉素-链霉素；
14.s5.扩大培养及传代：将筛选的细胞系扩大培养至细胞系生长覆盖培养瓶90％时，加入胰蛋白酶的edta溶液消化细胞，消化至细胞回缩变圆时终止消化，得到原代牦牛瘤胃上皮细胞，原代细胞传代至20代以上即为永生化牦牛瘤胃上皮细胞系。
15.进一步地，步骤s1中所述的抗生素为青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素b。
16.进一步地，步骤s2中所述i型胶原酶为浓度为0.1％，i型胶原酶与瘤胃乳头的体积比为5:1。
17.进一步地，步骤s3和步骤s5中所述胰蛋白酶的edta溶液中胰蛋白酶的含量为0.25％，edta的含量为0.02％。
18.进一步地，步骤s4中所述慢病毒还含有5ug/ml聚凝胺用于增强慢病毒感染效率。
19.进一步地，步骤s4中所述sv40t的逆转录病毒载体是pgmlv-sv40t-puro，所述htert的逆转录病毒载体为哺乳动物基因表达慢病毒载体plv[exp]-puro-ef1a》htert。
[0020]
进一步地，步骤s5中所述的永生化牦牛瘤胃上皮细胞采用冻存的方式保存，所述
冻存液为完全培养基、fbs和dmso的混合液，且体积比为：完全培养基:fbs:dmso＝7:2:1，其中，所述的完全培养基为rpmi-1640 10％fbs 10ng/ml egf 2ng/ml bfgf 2ng/ml igf-1 0.5ug/ml氢化可的松 1％青霉素-链霉素。
[0021]
本发明具有以下优点：
[0022]
(1)本发明使用ⅰ型胶原蛋白消化牦牛瘤胃上皮乳头后结合组织块贴壁法成功分离出牦牛瘤胃上皮细胞，相比组织块培养法减少了培养周期，细胞增殖形态良好，细胞活性较强，酶消化组织块培养法节约了成本，减少了试验时间，提高了原代细胞培养的成功率，本发明方法获得了生长稳定的牦牛瘤胃上皮细胞，丰富了牦牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法；
[0023]
(2)本发明使用携带sv40t和htert基因的慢病毒感染原代牦牛瘤胃上皮细胞，嘌呤毒素筛选培养后得到永生化牦牛瘤胃上皮细胞系，本发明通过实验证明了单独使用携带sv40t基因的慢病毒感染牦牛瘤胃上皮细胞时，原代细胞不能成功转化为细胞系，因此未得到上皮细胞系，本发明方法将sv40t和htert组合使用时能提高试验的成功率；
[0024]
(3)本发明构建的永生化牦牛瘤胃上皮细胞系能够稳定传代，未出现衰老的状态，细胞形态符合原代瘤胃上皮细胞形态；
[0025]
(4)本发明在慢病毒感染细胞过程中通过优化完全培养基成分，提高了试验的成功率，增加了原代细胞转化为细胞系的成功率，而且该培养基更适宜永生化牦牛瘤胃上皮细胞系的生长，细胞系增殖速度较快，细胞状态更好，能在较短时间获取更多数量的细胞，培养基中含有充分的营养物质，满足新细胞的合成，细胞代谢等生化反应所需的物质和能量。
[0026]
(5)本发明方法建立的细胞系解决了原代瘤胃上皮细胞培养难、传代次数有限的缺陷，丰富了目前牦牛源细胞系的资源，该永生化牦牛瘤胃上皮细胞系稳定传代，可保持原代瘤胃上皮细胞的形态特征并且功能正常，为应用研究瘤胃上皮营养消化吸收代谢，细胞信号通路机制等提供了有用的体外细胞模型。
附图说明
[0027]
图1为本发明牦牛瘤胃上皮细胞分离培养过程图，图中，a：培养原代细胞所用的瘤胃上皮组织；b：瘤胃上皮组织剪取的瘤胃乳头；c：清洗的瘤胃乳头；d：0.1％ⅰ型胶原酶消化瘤胃乳头；e：消化后瘤胃乳头组织块平铺10cm培养皿。
[0028]
图2为本发明酶消化结合组织块培养法培养的牦牛瘤胃上皮细胞形态学特征图；图中，a：组织块周围爬出的上皮细胞形态学特征(100x)；b：观察上皮细胞呈典型的鹅卵石铺路石状上皮样细胞形态(200x)。
[0029]
图3为sv40t和htert慢病毒载体图，图中，a：sv40t；b：htert。
[0030]
图4为本发明嘌呤毒素筛选扩大培养后的永生化牦牛瘤胃上皮细胞系的形态学特征图；图中，a：永生化第2代牦牛瘤胃上皮细胞；b：永生化第15代牦牛瘤胃上皮细胞。
[0031]
图5为本发明原代牦牛瘤胃上皮细胞和永生化牦牛瘤胃上皮细胞系角蛋白18免疫荧光鉴定图，图中，a：原代牦牛瘤胃上皮细胞；b：永生化牦牛瘤胃上皮细胞系。
[0032]
图6为本发明第10代永生化牦牛瘤胃上皮细胞系生长曲线测定图。
[0033]
图7为qrt-pcr鉴定sv40t和htert基因在第1代原代牦牛瘤胃上皮细胞和第10代永
生化牦牛瘤胃上皮细胞系的表达图。
[0034]
图8为细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测本发明第3代原代牦牛瘤胃上皮细胞和第30代永生化牦牛瘤胃上皮细胞系图，图中，a：第3代原代牦牛瘤胃上皮细胞；b：第30代永生化牦牛瘤胃上皮细胞系。
[0035]
图9为本发明第20代永生化牦牛瘤胃上皮细胞系染色体核型分析图。
具体实施方式
[0036]
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
[0037]
以下实验中用到的主要试剂有：rpmi-1640培养基、dmem/f12培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶-0.02％edta(gibco)；egf、bfgf、igf-1(rd公司)；ⅰ型胶原酶(mp公司)；嘌呤霉素puromycin、聚凝胺polybrene、氢化可的松hydrocortisone(sigma)；sv40t和htert慢病毒包装(云舟生物)；青霉素、链霉素、庆大霉素、两性霉素b、hank’s、pbs、秋水仙素、吉姆萨染液、甲醇、鼠尾胶原蛋白(solarbio公司)；cck-8(abmole公司)；角蛋白cytokeratin 18抗体购自santa cruz公司；triton-100、4％多聚甲醛、山羊血清、fitc标记山羊抗小鼠igg(h l)、cy3标记山羊抗小鼠igg(h l)、dapi染色液、细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(beyotime公司)；molpurecell rnakit培养细胞rna提取试剂盒、hifair
tm
ii1st strand cdna synthesis super mix for qpcr逆转录试剂盒、hieffuniconuniversal blue qpcr sybr green master mix试剂盒(yesen公司)。其他试剂均为试验室常规试剂。
[0038]
实施例1：一种永生化牦牛瘤胃上皮细胞系的构建方法，它包括以下步骤：
[0039]
s1.样品前处理：四川省某屠宰场采集健康成年牦牛的瘤胃上皮组织，放入含有抗生素(200u/ml青霉素，0.2mg/ml链霉素，100μg/ml庆大霉素和1μg/ml两性霉素b)的hanks溶液的自封袋置于冰上带回实验室，在无菌超净台中剪取瘤胃乳头，加入含有抗生素的(200u/ml青霉素，0.2mg/ml链霉素，100μg/ml庆大霉素和1μg/ml两性霉素b)的hanks溶液清洗4～5次，每次3～5分钟；
[0040]
s2.酶消化及培养：将0.1％ⅰ型胶原酶以体积比为5：1加入到装有瘤胃乳头的250ml玻璃瓶，放入37℃恒温气浴振荡箱中30min后，弃去上清液，使用hanks溶液清洗一次，将瘤胃乳头置于改良的dmemf/12细胞完全培养基中5min，其中，所述改良的dmemf/12细胞完全培养基为dmemf/12细胞完全培养基中还含有200u/ml青霉素，0.2mg/ml链霉素，100μg/ml庆大霉素和10％胎牛血清；
[0041]
将消化后的瘤胃乳头带有少量培养基均匀平铺在1ug/cm2鼠尾胶原蛋白包被的10cm培养皿中，组织块间距分散5mm，倒置培养皿放置在37℃、5％co2培养箱中大概3-4h后，观察组织块水分是否蒸发减少到使组织块能够紧紧贴住底部，如果水分较多延长倒置时间，之后拿出培养皿缓慢在培养皿的底部轻轻加入改良的dmemf/12细胞完全培养基5ml，使每个组织小块都有培养基覆盖，尽量使培养皿保持静止，培养24h后补加改良的dmemf/12细胞完全培养基至10ml，每五天换一次液；观察细胞的形态学变化，当消化后的瘤胃乳头周围爬出的细胞增殖融合至50％时，去除组织块，pbs清洗细胞；
[0042]
s3.纯化：将步骤s2中清洗后的细胞中加入2ml 0.25％胰蛋白酶-0.02％edta于培养皿中，轻轻摇晃培养皿使消化液铺满整个皿底，放入37℃、5％co2培养箱中消化处理细胞
2min，拍打细胞培养皿侧壁几下，迅速加入改良的dmemf/12细胞完全培养基终止消化，拍打摇晃培养皿以尽量去除成纤维细胞，pbs清洗细胞两次，纯化细胞后，加入改良的dmemf/12细胞完全培养基继续培养即得到纯化的牦牛瘤胃上皮细胞；
[0043]
s4.病毒感染：将纯化的牦牛瘤胃上皮细胞置于细胞完全培养基生长至细胞70％融合时，添加携带有sv40t和htert基因慢病毒moi＝80(含5ug/ml聚凝胺增强慢病毒感染效率)感染细胞过夜，每2天进行换液，持续培养4天，整个过程观察存活的细胞状态，添加1ug/ml嘌呤毒素持续培养96h进行筛选细胞系，存活的细胞系进行扩大培养，进行换液传代直到细胞形态逐渐稳定；其中，所述的细胞完全培养基为：rpmi-1640 10％fbs 10ng/ml egf 2ng/mlbfgf 2ng/ml igf-1 0.5ug/ml氢化可的松 1％青霉素-链霉素；
[0044]
所述sv40t的逆转录病毒载体是pgmlv-sv40t-puro，所述htert的逆转录病毒载体为哺乳动物基因表达慢病毒载体plv[exp]-puro-ef1a》htert；
[0045]
s5.扩大培养及传代：将筛选的细胞系扩大培养至覆盖培养瓶90％时，pbs溶液清洗细胞，0.25％胰蛋白酶-0.02％edta消化细胞，倒置显微镜观察待细胞回缩变圆时轻轻吹打细胞使之脱落，加入细胞完全培养基终止消化，消化时间大约5min，细胞悬液1200rpm/min，离心5min，进行传代或者冻存，所述冻存液为完全培养基、fbs和dmso的混合液，且体积比为：完全培养基:fbs:dmso＝7:2:1，其中，所述的完全培养基为rpmi-1640 10％fbs 10ng/ml egf 2ng/ml bfgf 2ng/ml igf-1 0.5ug/ml氢化可的松 1％青霉素-链霉素；细胞传代至20代以上，得到永生化牦牛瘤胃上皮细胞系。
[0046]
本发明中牦牛瘤胃上皮细胞分离培养过程如图1所示，酶消化结合组织块培养法培养的牦牛瘤胃上皮细胞形态学特征如图2所示；sv40t和htert慢病毒载体如图3所示；嘌呤毒素筛选扩大培养后的永生化牦牛瘤胃上皮细胞系的形态学特征如图4所示。
[0047]
实施例2：角蛋白cytokeratin 18免疫荧光鉴定第1代原代牦牛瘤胃上皮细胞和第5代永生化牦牛瘤胃上皮细胞系
[0048]
将瘤胃上皮细胞1
×
106个细胞/ml接种在6孔板中，细胞稳定贴壁后观察细胞生长状况，当细胞生长均匀，细胞间留有空隙，未连接成片后取出培养皿，加入预冷的pbs缓冲液，放在摇床上清洗3次每次10min。加入预冷的4％多聚甲醛固定液15min，去除固定液后加入预冷的pbs,放在摇床上清洗3次每次10min。加入预冷的0.1％triton
×
100处理细胞10min，去除透析液后加入预冷的pbs,放在摇床上清洗3次每次10min。加入5％bsa，室温封闭30min。去除封闭液，每孔加入稀释好的500μl一抗ck18抗体(1:50)4℃冰箱过夜。去除一抗后加入预冷的pbs，放在摇床上清洗3次每次10min。加入稀释好的荧光二抗(1：200)避光，37℃摇床1h，去除二抗加入预冷的pbs，放在摇床上清洗3次每次10min。加入稀释好的dapi完全覆盖住细胞就可以，避光5min，去除染色液后加入预冷的pbs，放在摇床上清洗3次每次10min。在荧光倒置显微镜下观察并拍照，鉴定结果如图5所示。
[0049]
由图5可知：所有细胞的角蛋白18呈现荧光，细胞核被染成蓝色，蛋白表达，细胞纯度高，说明培养的原代细胞和细胞系均为上皮细胞样细胞。
[0050]
实施例3：细胞增值生长曲线
[0051]
取第10代生长状态良好的牦牛瘤胃上皮细胞，消化细胞制成细胞悬液，将细胞以5
×
103个/ml的密度接种于96孔板中培养，每板设置6个重复，接种10板置于37℃，5％co2饱和湿度的细胞培养箱中培养。从第2天开始每天只拿出一板进行测定，每孔加入10％cck8溶
液，放置2h后，用酶标仪测450nm处od值。以培养时间为横坐标，od值平均值为纵坐标，绘制细胞的生长曲线，如图6所示。结果表明细胞增殖生长曲线呈现“s”形，符合上皮细胞的生长规律。
[0052]
实施例4：第1代原代牦牛瘤胃上皮细胞和第10代永生化牦牛瘤胃上皮细胞系的表达
[0053]
取第1代原代牦牛瘤胃上皮细胞和第10代永生化牦牛瘤胃上皮细胞系以1
×
106个细胞/ml接种于6孔板中，设置三个重复，细胞生长24h后，pbs清洗两遍后，按照试剂盒操作说明使用molpurecell rnakit培养细胞rna提取试剂盒提取细胞总rna，hifair
tm
ii 1st strand cdna synthesis super mix for qpcr进行逆转录反应，在10μl反应体积中逆转录不少于1μg的细胞总rna。hieffuniversal blue qpcr sybr green master mix试剂盒进行rt-pcr。试验中pcr使用的引物序列见表1，引物由上海生工合成。
[0054]
表1：引物序列信息
[0055][0056]
qrt-pcr鉴定sv40t和htert基因在第1代原代牦牛瘤胃上皮细胞和第10代永生化牦牛瘤胃上皮细胞系的表达图如图7所示，结果表明永生化细胞系稳定高表达sv40t和htert基因，也进一步说明了慢病毒感染原代细胞成功。
[0057]
实施例5：β-半乳糖苷酶染色实验
[0058]
取第3代原代牦牛瘤胃上皮细胞和第30代永生化牦牛瘤胃上皮细胞系接种在6孔板中，细胞稳定贴壁后观察细胞生长状况，生长密度达到90％时根据细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒操作说明进行检测。检测结果如图8所示：原代细胞传达至第3代，细胞状态异常，细胞衰老形态不规则，衰老细胞通常体积变大，在光学显微镜下很容易观察到变成蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞。而永生化牦牛瘤胃上皮细胞系未观察到明显的深蓝色说明细胞系并未出现衰老，细胞系稳定传代，细胞活性高，增殖状态稳定。
[0059]
实施例6：第20代永生化牦牛瘤胃上皮细胞系染色体核型分析
[0060]
第20代永生化牦牛瘤胃上皮细胞系以1
×
106个细胞/ml接种于培养瓶中培养72h，培养到68h时，培养瓶中加秋水仙素，培养瓶中秋水仙最终浓度达到0.1-0.2ug/ml，温箱中继续培养2-4h使细胞分裂停止在中期相。然后进行以下处理：
[0061]
收集细胞：将培养物吹打混匀后转移到10ml玻璃离心管，1800rpm离心6min。
[0062]
低渗处理：弃上清，加入37℃预温的0.075mol/l氯化钾8ml，吸管轻轻吹打混匀，37℃低渗处理20min。
[0063]
预固定：加入1ml新鲜配制的固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，轻轻混匀，1800rpm离心6min。
[0064]
固定：弃上清，加入上述新鲜固定液8ml，轻轻混匀，室温下静置固定20min，1800rpm离心6min。弃上清，重复固定一次，1800rpm离心6min。弃上清，根据沉淀量多少加入适量新鲜固定液，轻轻混匀，制成磨砂状悬液。
[0065]
制片：取上述悬液1-2滴，滴至沾有冰水或干燥的洁净载玻片上，吹散，过火，空气干燥。37℃温箱放置3-4天或70℃烘烤2-3h进行老化处理，以备显带分析。
[0066]
染色：用ph6.8磷酸缓冲稀释giemsa原液(9∶1)，取1张制备好的染色体标本片子染色15～20min，水冲洗，空气干燥。
[0067]
观察：先在低倍镜下选择染色体分散良好的中期相，再转换油镜观察。制好的玻片标本如需要保存较长时间，可用封固剂加以封固，以隔绝与外界接触。
[0068]
拍照：将制备好的标本片放在物镜下，显微镜调好；先用低倍镜观察，找到细胞分裂中期相，选择分散良好的中期相，放大、计数。
[0069]
染色体数目统计：可用一定数量染色体分散良好的分裂细胞进行计数。
[0070]
形态特点的记录和测量计算。
[0071]
染色体核型分析系统：video test.karyo染色体核型分析系统。
[0072]
结果如图9所示，从图9可知：永生化牦牛瘤胃上皮细胞系表现出牦牛物种的二倍体特征，并未发生突变成为多倍体，永生化后细胞染色体数目明显增多，这与慢病毒感染原代细胞转化为永生化细胞的情况一致，属于正常现象。
[0073]
对比例1：
[0074]
将剪取的瘤胃乳头剪碎清洗干净后，直接放在细胞完全培养基中5min，将组织小块带有少量培养基均匀平铺在10cm培养皿中，组织块间距分散5mm，倒置培养瓶放置在培养箱中大概3-4h后，观察组织块水分是否蒸发减少到使组织块能够紧紧贴住底部，如果水分较多延长倒置时间，之后拿出培养瓶缓慢在培养瓶的底部侧面轻轻加入2ml细胞完全培养基，小心正置培养瓶，尽量使培养瓶保持静止，培养24h后补加培养基置10ml，每五天换一次液。观察细胞的形态学变化。组织块培养法牦牛瘤胃上皮组织周围爬出上皮细胞的时间至少需要两周以上的时间，大概一个月培养皿中细胞密度才能达到80％，而酶消化结合组织块培养法两周时间，组织块周围爬出的细胞密度就能达到80％。
[0075]
对比例2：
[0076]
仅用携带sv40t病毒基因的慢病毒感染原代牦牛瘤胃上皮细胞时，细胞转化成永生化细胞系的成功率非常低，原代细胞死亡，无法筛选出稳定传代的永生化细胞系，细胞形态与上皮细胞形态完全不一样，造成细胞系建立失败。同时使用携带sv40t和htert基因的两种慢病毒感染原代牦牛瘤胃上皮细胞，细胞转化为永生化细胞系的成功率高，细胞系在体外连续传代，细胞系活力旺盛，细胞系增殖速度快。
[0077]
对比例3：
[0078]
使用慢病毒感染原代细胞转化永生化细胞系过程中仅使用完全培养基dmemf/12(200u/ml青霉素，0.2mg/ml链霉素，100μg/ml庆大霉素，10％胎牛血清)培养时细胞，细胞生长状态并不稳定，将完全培养基进行优化，使用rpmi-1640 10％fbs 10ng/ml egf 2ng/ml bfgf 2ng/ml igf-1 0.5ug/ml氢化可的松 1％双抗的完全培养基细胞系生长状态正常，细胞增殖速度快，细胞活力强，稳定传代保持原代牦牛瘤胃上皮细胞形态。
[0079]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。