一种检测中华绒螯蟹呼肠孤病毒荧光定量PCR检测试剂盒的制作方法

技术特征：
1.一组检测中华绒螯蟹呼肠孤病毒的引物组，其特征在于，所述引物组由正向引物f、反向引物r和荧光探针q组成，所述正向引物f的核苷酸序列如seq id no:3所示，反向引物r的核苷酸序列如seq id no:4所示，荧光探针q的核苷酸序列如seq id no:5所示。2.一组检测中华绒螯蟹内参基因的引物组，其特征在于，所述引物组由正向引物f、反向引物r和荧光探针q组成，所述正向引物f的核苷酸序列如seq id no:9所示，反向引物r的核苷酸序列如seq id no:10所示，荧光探针q的核苷酸序列如seq id no:11所示。3.根据权利要求1或2所述的引物组，其特征在于，所述荧光探针q的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。4.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物组。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，还包含权利要求2所述的引物组。6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含dna聚合酶、反转录酶、ung酶、2
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反应缓冲液、密封液、阳性对照参考品和/或阴性对照参考品。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述dna聚合酶为tth dna polymerase和热启动抗体的混合液，反转录酶为m-mlv逆转录酶，ung酶为尿嘧啶-n-糖基化酶，2
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反应缓冲液是含有datp、dctp、dgtp和dutp的2
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浓度的反应溶液，密封液为矿物油。8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照参考品为含有中华绒鳌蟹呼肠孤病毒检测靶标基因和内参基因的质粒dna，所述阴性对照参考品为无rna酶的去离子水。9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：权利要求1中所述的引物组中，正向引物f、反向引物r和荧光探针q引物在反应体系中的终浓度分别为0.4～0.6μm、0.4～0.6μm和0.2～0.3μm；权利要求2中所述的引物组中，正向引物f、反向引物r和荧光探针q引物在反应体系中的终浓度分别为0.2～0.4μm、0.2～0.4μm和0.1～0.2μm；2
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反应缓冲液12.4～12.6μl，dna聚合酶2～4u，反转录酶2～4u、ung酶0.3～0.5u，待检样品2～5μl，加无rna酶的去离子水至25μl。10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述反应体系的反应条件为50℃5min；95℃5min；95℃15s、60℃30s，45个循环。

技术总结
本发明公开了一种检测中华绒螯蟹呼肠孤病毒探针法荧光定量PCR检测试剂盒。该试剂盒包含一组检测中华绒螯蟹呼肠孤病毒的引物组和一组检测中华绒螯蟹内参基因的引物组，两组引物组均包括一对特异性引物及对应的TaqMan探针，试剂盒还包括DNA聚合酶，反转录酶，UNG酶，2


技术研发人员：张璜 胡金春 常彦磊 叶霆 高金艳 史文竞 林雪金
受保护的技术使用者：衢州市水产技术推广中心（衢州市渔业环境监测与疫病防控中心）
技术研发日：2021.11.25
技术公布日：2022/2/18