川楝素的对照品的制备方法与流程

1.本发明涉及一种川楝素的制备方法，尤其涉及能够制备可以高纯度的川楝素的固体对照品的制备方法。


背景技术：

2.川楝子为楝科植物川楝(melia toosendansieb.et zucc.)的成熟果实，是一味传统中药，功能舒肝行气、止痛、驱虫，用于胸胁、脘腹胀痛，疝痛，虫积腹痛等证有近二千年的用药历史，为中国历版药典收载。现代研究结果表明，川楝子提取物具有抗菌、抗病毒、抗炎、镇痛、杀虫等多种药理活性。
3.川楝素，又称苦楝素，是从楝属植物的根皮、枝皮和果实中提取出的四环三萜类化合物，其具有驱虫、杀虫等功效，同时具有非常好的抗肉瘤效应，能够诱导细胞分化、凋亡并抑制人和动物的多种肿瘤细胞繁殖。其具体化学结构如下：
[0004][0005]
川楝素不但是具有众多功能的活性化合物，也是中药川楝质量检测的特征成分之一。因此，如何快速、高效的获取川楝素的高纯度的对照品，对于与川楝子的中药现代化研究有着非常重要的现实意义。
[0006]
与川楝素相关专利和参考文献较多，cn112940068 a报导了一种提取方法，获得了川楝素母液浓度≥1％，并未涉及到单体化合物的制备方法；cn107474100 a报导川楝子乙酸乙酯层，经硅胶、mci、凝胶及重结晶，从10kg药材中获得川楝素15.56mg，提取率0.000156％。此外还有利用酶解、高压脉冲电场提取、澄清剂除杂、活性炭脱色、树脂纯化及石油醚反复沉淀获得川楝素，但纯度最高只能达到97.1％。文献大多是关于药材提取、含量检测方法，王鑫等(川楝子中川楝素的分离纯化[j].中南药学，2016，14(4)：395-397.)报导从150g川楝子中，通过硅胶和凝胶分离，获得23mg产品，纯度98％，提取率0.015％，陈玉等(从植物中寻找农药活性物质-川楝子化学成分的研究(ⅰ)[j].湖北化工，1996增刊：43，66.)报道从川楝子氯仿部位过硅胶获得川楝素，但并未报导相关的得率及产品纯度。然而现有的方式，都难以快速的获得纯度达到99％以上的对照品的提取方法。
[0007]
总之，现实情况是，仍然需要开发足够简便快速、提取率高、纯度达到99％以上的川楝素的提取方法。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的在于提供一种高通量、能提供高纯度川楝素，且适合大量制备的川楝素对照品制备方法，并且该方法的川楝素的提取率也比较高。
[0009]
具体而言，本发明提供一种川楝素的对照品的制备方法，该方法依次包括以下步骤：
[0010]
正相色谱纯化工序：将含有川楝素的原料提取物粗品上样至正相色谱柱，用包含卤代烷烃类溶剂、醇类溶剂的洗脱液进行洗脱，卤代烷烃类溶剂:醇类溶剂的比例为100～25:1，根据tlc或者hplc检测收集洗脱液，将洗脱液浓缩、干燥，得到第一粗品粉末；
[0011]
溶剂处理工序：将第一粗品粉末利用甲醇或乙醇溶解，过滤得到第1滤液，在第1滤液中，缓慢加入水，析出固体沉淀，过滤沉淀，干燥，得到第二粗品粉末；
[0012]
中压反相色谱纯化工序：将第二粗品粉末上样至中压反相色谱，用浓度30～60％的甲醇水溶液以压力为0.02～1mpa进行洗脱，根据tlc或者hplc检测收集洗脱液，将洗脱液在50～57℃浓缩至原体积的10～30％，析出沉淀，将沉淀过滤、干燥，得到川楝素半成品粉末；
[0013]
目标物回收工序，将川楝素半成品粉末利用甲醇或乙醇溶解，过滤去除不溶物得到滤液，在40～80℃浓缩至原体积的10～40％，放冷至0～30℃，析出固体沉淀，过滤沉淀，将沉淀干燥得到川楝素对照品。
[0014]
在本发明优选的实施方式中，所述含有川楝素的原料提取物粗品的制备方法如下：将原料川楝子粉碎，利用醇系的水溶液浸泡，过滤，滤液，在30～80℃的温度下避光浓缩至无醇味，在其中加入有机溶剂，按照体积比计有机溶剂：浓缩液为0.5～3：1进行萃取，重复2～5次萃取，合并有机溶剂，除去有机溶剂，得到川楝素的原料提取物粗品。
[0015]
在本发明优选的实施方式中，正相色谱纯化工序中，所述卤代烷烃类溶剂:醇类溶剂的混合比例为70～30:1。
[0016]
在本发明优选的实施方式中，正相色谱纯化工序中，所述卤代烷烃类溶剂为二氯甲烷，所述醇类溶剂为甲醇。
[0017]
在本发明优选的实施方式中，中压反相色谱纯化工序中，用浓度40～60％的甲醇水溶液以压力为0.1～0.3mpa进行洗脱。
[0018]
在本发明优选的实施方式中，醇系的水溶液为60％～85％的甲醇水溶液或者60％～85％的乙醇水溶液，有机溶剂为二氯甲烷或者三氯甲烷。
[0019]
在本发明优选的实施方式中，正相色谱纯化工序中，正相色谱柱的填料为粒径为100～300目的硅胶。
[0020]
在本发明优选的实施方式中，中压反相色谱柱的填料为粒径为40-60μm的十八烷基硅烷键合硅胶，高压反相色谱柱的填料为粒径为5-10μm的十八烷基硅烷键合硅胶。
[0021]
在本发明优选的实施方式中，溶剂处理工序中：用以质量比计0.5倍～5倍的甲醇量将第一粗品粉末溶解，在第1滤液中，缓慢加入的水量为滤液体积的2～5倍。
[0022]
本发明还提供一种纯度为99％以上的川楝素的固体对照品，其利用本发明的制备
方法制备得到。
[0023]
本发明制备的川楝素纯度较文献及以往的专利报导提高很多，能迅速获得纯度达到99％以上的川楝素，按照川楝子药材测算，提取率也能实现0.0347％，相比于文献报导的提取率0.015％而言，提高了2.3倍，而且通量上有较大改进。
[0024]
本发明具有如下特点：
[0025]
1.本专利能够获得大量的川楝素纯品，为川楝子药材的鉴别、药材质量标准及药理实验提供坚实的物质基础，具有较高的经济价值。
[0026]
2.本发明利用目标化合物及杂质在不同溶剂体系中的溶解性差异，将硅胶后的川楝素粗品，用甲醇溶解，加水超声析出的方法，迅速将目标化合物hplc纯度提升至97％以上，极大简化了分离过程、提高效率。
[0027]
3.本专利大大降低了川楝素对照品制备成本、使用溶剂更少，更加环保、利于规模化生产。
附图说明
[0028]
图1为本发明实施例1的川楝素提取大致的流程图；
[0029]
图2为本发明实施例1获得的川楝素纯品的ms图谱；
[0030]
图3为川楝素纯品的h-nmr图谱；
[0031]
图4为川楝素纯品的c-nmr图谱。
具体实施方式
[0032]
以下记载本发明的具体实施方式。
[0033]
本发明中，川楝素有时也称为目标物、或分离目标物。
[0034]
如果并未特殊说明，本发明中目标物的纯度和含量的百分数，为以质量比计的含量。如果并未特殊说明，本发明中液体与液体含量配比的百分数，例如甲酸在乙腈水溶液中的含量配比，以体积分数计量。
[0035]
本发明通过简单高效的操作流程，能够分离得到纯度很高的川楝素。本发明的制备分离方法依次包括以下步骤：
[0036]
一种川楝素的对照品的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
[0037]
正相色谱纯化工序：将含有川楝素的原料提取物粗品上样至正相色谱柱，用包含卤代烷烃类溶剂、醇类溶剂的洗脱液进行洗脱，卤代烷烃类溶剂:醇类溶剂的比例为100～25:1，根据tlc或者hplc检测收集洗脱液，将洗脱液浓缩、干燥，得到第一粗品粉末；
[0038]
溶剂处理工序：将第一粗品粉末利用甲醇或乙醇溶解，过滤得到第1滤液，在第1滤液中，缓慢加入水，析出固体沉淀，过滤沉淀，干燥，得到第二粗品粉末；
[0039]
中压反相色谱纯化工序：将第二粗品粉末上样至中压反相色谱，用浓度30～60％的甲醇水溶液以压力为0.02～1mpa进行洗脱，根据tlc或者hplc检测收集洗脱液，将洗脱液在50～57℃浓缩至原体积的10～30％，析出沉淀，将沉淀过滤、干燥，得到川楝素半成品粉末；
[0040]
目标物回收工序，将川楝素半成品粉末利用甲醇溶解，过滤去除不溶物得到滤液，在40～80℃浓缩至原体积的10～40％，放冷至0～30℃，析出固体沉淀，过滤沉淀，将沉淀干
燥得到川楝素对照品。
[0041]
上述的正相色谱纯化工序的目的是将极性差别较大的杂质与目标物区分开，原料粗品上样的方式并无特别限制，可以采用良溶剂溶解滴加上样，也可以通过填料拌样上样，为了将上样体积压缩的较低，优选拌样填料上样。
[0042]
正所使用的正相色谱柱的填料，可以用公知的正相填料，所谓正相填料，就是固定相的极性大于流动相的极性的填料，如果流动相为有机溶剂，常用的填料为硅胶(具体为sio2，二氧化硅)、al2o3、极性键合相填料等，本发明中优选使用硅胶。硅胶的粒径大小没有特别限制，从效率和填料易得的角度出发，在优选的本发明的制备方法中，第一正相色谱柱提纯工序中，正相色谱柱的填料为粒径为100～300目的硅胶。为了更好的获得分离效率，并且从分离度和吸附损失的角度出发，优选使用硅胶，进一步优选使用100～300目的硅胶。
[0043]
卤代烷烃类溶剂和醇类溶剂的混合洗脱液，将目标物与杂志区分开的效果较好，其中，作为卤代烃溶剂，是指1或2个碳原子的饱和的或不饱和的氯代烃，通常是选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷、1，1，1-三氯乙烷、1，1，2-三氯乙烷、1，1，1，2-四氯乙烷、1，1，2，2-四氯乙烷、五氯乙烷、1，1-二氯乙烯、1，2-二氯乙烯、三氯乙烯及四氯乙烯。更好地是二氯甲烷、三氯甲烷、1，1，1-三氯乙烷、三氯乙烯及四氯乙烯，进一步优选的是二氯甲烷、三氯甲烷。醇类溶剂，可使用常用的甲醇、乙醇、异丙醇。作为本发明中的优选组合，可以使用二氯甲烷和甲醇的组合，获得更好的分离效果。
[0044]
在正相色谱纯化工序中，卤代烷烃类溶剂:醇类溶剂的混合比例优选为70～30:1。
[0045]
上述溶剂处理工序，是本发明中最重要的工序，该工序与前后工序的组合顺序也非常重要。本发明人发现，利用正相色谱纯化工序中获得的与川楝素极性类似的物质中，川楝素本身的溶剂溶解行为有自身的特点，可以利用该特点，迅速的将其与其他杂质区分开。具体而言，正相色谱纯化工序中获得的部位，如果用甲醇或乙醇溶解，加水析出的方法，使样品纯度迅速提高到97％，将极大简化了分离过程，降低分离难度，提高最终产品的收率和纯度。而且此步骤处理的通量也非常大，非常适合大量的对照品的制备。
[0046]
本发明中，即使没有溶剂处理工序，也能够常规的获得川楝素，然而，为了获得高纯度的川楝素，需要更多的溶剂、时间，同时还会极大的降低回收率。与之相对的是，通过将溶剂处理工序在正相色谱纯化工序中和中压反相色谱纯化工序之间进行能够获得最高的分离效率，如果调换处理工序，分离效率和回收率就会显著降低。
[0047]
溶剂处理工序，用甲醇或乙醇溶解第一粗品粉末时甲醇或乙醇的用量没有特别限制，一般而言，优选用以质量比计0.5倍～5倍的甲醇或乙醇的量将第一粗品粉末溶解；在第1滤液中，加入水就会使目标物析出，加入水的量没有特别限制，本领域人员可以根据实际情况选择，一般而言缓慢加入的水量为滤液体积的2～10倍，优选2～5倍。溶剂处理工序中，使用甲醇或乙醇，和水进行溶剂处理是重要的，能够使本发明的效果最大化。
[0048]
本发明中过滤的方法没有特别限制，可以使用常规的过滤器、抽滤装置、微孔滤膜装置进行过滤。本发明中的干燥也没有特别限制，可以使用烘箱、红外灯、加热板等，干燥的温度，本领域人员可以适当选择。
[0049]
本发明中，浓缩方法以及除去有机溶剂的方法，没有特别限制，可以使用加热蒸发浓缩，旋转蒸发仪浓缩等。本发明中使用的水，没有特别限制，可以使用自来水、蒸馏水、去离子水等常用的水。
[0050]
本发明中，中压反相色谱分离用于将与目标物极性有差异的其他成分分离。该工序中，上样的方式并无特别限制，可以采用良溶剂溶解滴加上样，也可以通过填料拌样上样，为了将上样体积压缩的较低，优选拌样填料上样。该工序中采用0.02～1mpa的洗脱压力能够实现分辨率和速度之间的平衡，进一步优选的柱压力是0.05～0.5mpa。中压柱分离工序中，中压反相色谱柱的压力更进一步优选为0.1mpa～0.3mpa，此压力因为能平衡分离效果和分离速度而特别优选。本发明的中压反相色谱纯化工序中，进一步优选用浓度40～60％的甲醇水溶液溶液以压力为0.1～0.3mpa进行洗脱。
[0051]
本发明中色谱柱制备工序中使用的反相色谱柱的反相填料，可以用公知的非极性的，键合的官能团为烷烃的(例如：c18(ods)、c8、c4等)的硅胶。优选c18(ods)硅胶柱，即十八烷基硅烷键合硅胶，优选使用40～60μm的填料，合理的粒径有利于维持适当的柱压和分辨率，十八烷基硅烷键合硅胶在市场上易于购买。从效率和填料易得的角度出发，在优选的本发明的制备方法中，反相色谱柱的填料为粒径为40～60μm的十八烷基硅烷键合硅胶。
[0052]
根据本发明的原理，在目标物回收工序中，可使用的中压反相色谱柱可以是任意的中压反相色谱柱，只要填料承载量能够满足目标物的容量的中压反相色谱柱即可。
[0053]
上述目标物回收工序，与溶剂处理工序类似，都是利用目标物和杂质溶解行为的区别，进一步进行精制除杂的过程。在较高温度下，目标物川楝素更易于溶于甲醇中，放冷过程，相当于是缓慢析出，目标物的纯度进一步提高。该步骤使用甲醇和乙醇都能实现提纯的效果。
[0054]
过滤去除不溶物得到滤液，在40～80℃浓缩至原体积的10～40％，放冷至0～30℃，析出固体沉淀，过滤沉淀，将沉淀干燥得到川楝素对照品。作为本发明的优选方式，在50～60℃浓缩至原体积的10～40％，放冷至室温，析出固体沉淀可以进一步提高效率和回收率。
[0055]
本发明中，所谓的含有川楝素的原料提取物粗品，可以是任意的含川楝素的提取物，例如市售的川楝子提取物。为了使本发明获得更优异的分离效果和回收率，本发明中，优选含有川楝素的原料提取物粗品的获得方法为：
[0056]
将原料川楝子药材粉碎，利用醇系的水溶液浸泡，过滤，滤液，在30～80℃的温度下避光浓缩至无醇味，在其中加入有机溶剂，按照体积比计，有机溶剂：浓缩液为0.5～3：1进行萃取，重复2～5次萃取，合并有机溶剂，除去有机溶剂，得到川楝素的原料提取物粗品。本发明中优选3次萃取合并有机溶剂，即可比较完整的萃取川楝素。
[0057]
此时，在本发明优选的实施方式中，上述的醇系的水溶液为60％～85％的甲醇水溶液或者60％～85％的乙醇水溶液。本发明中的所谓浓缩至无醇味，实质混合溶液中的醇类溶剂基本已经被蒸发去除了(含量小于5％)，仅剩下难以蒸干的水。因此，上述提取过程，后期相当于是水与有机溶剂的两相萃取。有机溶剂没有特别限制，可以是常用的苯、甲苯、三氯甲烷、四氯化碳、二氯甲烷、正丁醇、乙酸乙酯、正己烷、环己烷等，这里，优选有机溶剂为二氯甲烷或者三氯甲烷。
[0058]
本发明还提供一种纯度为99％以上的川楝素的固体对照品，其通过上述制备方法制备得到。
[0059]
基于以上说明可知，本发明具有以下特点：本发明操作简单高效，能够进行工艺放大，分离得到大量川楝素单体。本发明，利用川楝素与杂质溶解性差异，将硅胶后的川楝素
粗品，用甲醇溶解，加水析出的方法，使样品纯度迅速提高到97％，极大简化了分离过程，降低分离难度。本发明可以很容易的获得高于99％的纯度的川楝素，特别适合作为高质量的对照品使用。同时整个过程适合放大，可以极大的提高对照品的制备通量。
[0060]
实施例
[0061]
以下，通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
[0062]
实施例中所使用的试剂购自aldrich公司、国药试剂公司等公司。仪器条件如下：
[0063]
ms分析条件
[0064]
仪器sciextripletof4600lc/ms
[0065]
检测模式positiveionmode
[0066]
esi源参数：
[0067][0068]
hplc色谱条件
[0069]
供试品溶液取1.28mg样品，加1ml甲醇溶解，配成1.28mg/ml样品，现配现测。
[0070][0071][0072]
流动相组成a-0.01％甲酸水，b-乙腈
[0073]
时间(min)流速(ml/min)％b0.01.00031.020.01.00031.030.01.00090.0
45.01.00090.045.11.00031.050.01.00031.0
[0074]
实施例1川楝子中川楝素对照品的制备方法
[0075]
按照图1的流程，按如下工艺步骤进行：
[0076]
步骤a：药材提取：采购川楝子药材200kg，产地云南，用粉碎机粉碎成粗颗粒状，注意不可粉碎过细，否则会导致药材粉末阻力大，不利于溶剂充分扩散。加入80％乙醇2000l，于提取罐中冷浸提取72h，提取1次，过滤得提取液，注意过滤很重要，否则引入的药渣将影响下一步萃取分层效果。滤液于60℃下浓缩至300l得提取浓缩液；
[0077]
步骤b：萃取：将步骤a的浓缩液，加入等体积的二氯甲烷萃取3次，二氯甲烷为分析纯，采购于上海泰坦公司。合并二氯甲烷层，共约900l，于35℃下浓缩，除去二氯甲烷，得萃取浓缩液；
[0078]
步骤c：硅胶纯化：将步骤b的萃取浓缩液，与100-200目硅胶拌样，硅胶产自青岛海洋化工厂，于60℃烘干24h，用粉碎机粉碎过筛，备用。装硅胶柱一根，取100-200目青岛海洋硅胶6.5kg，加二氯甲烷：甲醇＝70:1溶剂充分搅拌，装柱。待硅胶柱装好后，上样，先以二氯甲烷：甲醇＝70:1洗脱5个柱体积，二氯甲烷：甲醇＝50:1洗脱5个柱体积，除去色素和低极性杂质，最后改用二氯甲烷：甲醇＝30:1洗脱目标，前期用tlc点板，待目标开始洗脱下来，改用hplc检测跟踪。收集目标流份，于40℃下浓缩干，得川楝素粗品；
[0079]
步骤d：溶剂法处理：将步骤c所得到的川楝素粗品124g，加纯甲醇约250ml超声溶解，过滤除去不溶杂质成分，滤液中逐渐加水，一共加入约800ml水，边加边超声，使目标大量析出，抽滤，得到hplc 97％的川楝素半成品。此步骤通过甲醇溶解，逐渐加水析出的方法，除掉了大量前杂，并进一步脱色，迅速提高产品纯度；
[0080]
步骤e：中压制备：将步骤d所得到的hplc 97％左右的川楝素半成品，用纯甲醇溶解，体积约150ml左右，上1根中压制备柱，中压制备柱型号100
×
460mm，为苏州汇通色谱公司生产，填料为大曹ods-rps，粒径40-60μm。上样后，先用50％甲醇水以10ml/min低流速洗脱1h左右，以免目标被过快洗脱下来，改用60ml/min流速等度洗脱，hplc检测，收集目标流份；
[0081]
步骤f：产品回收：将步骤e得到的目标流份，于55℃下浓缩至2l左右，目标大量析出，抽滤，得固体-1，hplc纯度99.9％，为纯白色粉末。固体-1用纯甲醇约200ml溶解，过滤除去不溶物，滤液浓缩至约80ml左右，封口，于冰箱中冷藏4-5h，目标大量析出，抽滤，得固体-2，此步骤主要是除去产品中的水分。固体-2再次用纯甲醇溶解，于60℃下浓缩干，刮出粉末，研碎后置于真空干燥箱中，60℃真空干燥24h，获得纯度99.9％的川楝素69.4g。
[0082]
获得的川楝素nmr图谱参考图3和图4，质谱图谱参见图2。
[0083]
比较例1
[0084]
采购川楝子200kg，前处理阶段与实施例1步骤a、b、c相同。药材经粉碎、提取、过滤、浓缩、萃取及硅胶纯化后，得到川楝素粗品，用纯甲醇溶解，体积约250ml左右，因为浸膏量相对较大，分2根中压制备柱纯化，上样后，同样以50％甲醇水等度洗脱，hplc检测，收集目标流份，经浓缩，析出后抽滤，结果只能获得纯度96％的川楝素，颜色为淡黄色，经甲醇反复重结晶3次，能够获得纯度99％的川楝素35g。工作量和试剂消耗量明显增大，结果产品纯
度相对要低很多，按照川楝子药材测算，提取率也仅为0.0175％，只能达到实施例1的一半。
[0085]
上述披露的各技术特征并不限于已披露的与其它特征的组合，本领域技术人员还可根据发明之目的进行各技术特征之间的其它组合，以实现本发明之目的，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。