富集细胞群的方法与流程

富集细胞群的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求2019年4月9日提交的美国临时专利申请号62/831,491的优先权。上述申请通过引用并入本文。
发明领域
3.本发明整体涉及富集所需细胞群的方法，更具体地，涉及富集包含多系分化持续应激(muse)细胞的所需细胞群的方法及其用途。
4.发明背景
5.多系分化持续应激(multilineage-differentiating stress-enduring，muse)细胞是间充质干细胞(msc)的一种亚型，其表达阶段特异性胚胎抗原3(state-specific embryonic antigen3，ssea3)。muse细胞可以在体外自发分化成内胚层、外胚层和中胚层谱系细胞，或者可以被诱导产生来自所有三种谱系的细胞类型。它们可以自我更新，但不会在体内形成畸胎瘤。muse细胞在静脉内施用时迁移到表达鞘氨醇-1的组织中，融入到体内受损组织中，分化为修复组织所需的特定细胞，并在动物体内存活超过6个月。muse细胞在许多动物疾病模型中都刺激组织再生并恢复功能，所述疾病例如肝脏疾病、中风、肌肉再生、皮肤再生、恶性胶质瘤和心肌梗塞。在动物体内移植后，未报告肿瘤。与胚胎干(es)和诱导多能干(ips)细胞相比，muse细胞还具有低端粒酶活性和低细胞周期基因表达。
6.在再生医学方面，muse细胞比其他干细胞具有多种优势。首先，它们是多能成体干细胞，可以产生自身和许多其他类型的细胞来修复各种组织。其次，muse细胞已从许多组织中分离出来，并可从自体和同种异体来源获得，包括脂肪、骨髓、成人血、脐带血和脐带。再次，muse细胞可以通过ssea3和间充质标志物(如cd105、cd29和cd90)的组合来识别。由于间充质细胞在塑料上附着和生长良好，因此在塑料上培养的来自华通氏胶(wharton’s jelly，wj)或脐带内膜(cord lining，cl)的细胞几乎100％都表达间充质标志物。在塑料上培养细胞有效地将细胞纯化为间充质细胞群。发现可以仅基于ssea3表达从生长于塑料上的细胞培养物分选和计数muse细胞。最后，不同于如胚胎或诱导多能干(ips)细胞的其他多能细胞，muse细胞不形成畸胎瘤或其他肿瘤。当在培养物中生长时，它们的自我更新率低于它们产生的非muse分化细胞，因此培养物中muse细胞的百分比总是随时间下降。
7.ssea3 细胞占培养的来自山羊皮、人真皮成纤维细胞、脂肪组织和骨髓的间充质细胞的0.03％到几个百分点。为了分离muse细胞，通常使用荧光激活细胞分选(facs)，但这种方法效率低下且成本高昂(heneidi，s.，等人plos one，2013.8(6)：p.e64752)。一些其他方法包括使用酶或对细胞施加应激，这依赖于muse细胞有应激抗性而存活而其他细胞则死亡。在通过这些方法纯化的间充质细胞群中，只有11.6％可以形成muse细胞簇(kuroda，y.，等人pnas，2010.107(19)：p.8639-43；dezawa，m.，cell transplant，2016.25(5)：p.849-61)。
8.因此，仍然强烈需要获得高纯度和高产量的细胞(例如muse细胞)的有效方法。


技术实现要素：

9.本公开在多个方面解决了上述需求。一方面，本公开提供了一种富集muse细胞的方法。所述方法包括：(i)提供muse细胞的细胞或组织来源；(ii)从muse细胞的细胞或组织来源分离第一细胞群，其中所述第一细胞群通过选择ssea3 细胞而分离并且包含ssea3 muse细胞；(iii)在培养基中培养第一细胞群的至少一个亚群；(iv)重复步骤(iii)至少1-10代；和(v)通过选择ssea3 细胞从所得的培养细胞分离富集的muse细胞群，由此所述富集的muse细胞群包含约或大于80％的ssea3 muse细胞。在一些实施方案中，培养基包含碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)。
10.在一些实施方案中，所述方法进一步包括：从muse细胞的细胞或组织来源分离第二细胞群和第三细胞群，其中通过在从muse细胞的细胞或组织来源分离第一细胞群之前或之后，选择cd4 和cd8 细胞来分离第二细胞群，并且在从muse细胞的细胞或组织来源分离第一细胞群和第二细胞群后，回收第三细胞群。在一些实施方案中，第二细胞群包含t淋巴细胞和自然杀伤(nk)淋巴细胞。在一些实施方案中，第三细胞群包含cd14 单核细胞、cd34 内皮祖细胞或cd133 多能细胞。
11.在一些实施方案中，muse细胞的细胞或组织来源获自动物的组织，例如脐带血、脐带、脐带基质细胞(华通氏胶)、羊膜、胎盘、脐带内膜、经血、外周血、骨髓、皮肤或脂肪。在一些实施方案中，动物是哺乳动物(例如人)。在一些实施方案中，muse细胞的细胞或组织来源包括间充质细胞或单核细胞。
12.在一些实施方案中，使用包含ssea3抗体的基于免疫亲和性的试剂分离第一细胞群。在一些实施方案中，使用包含cd4和cd8抗体的基于免疫亲和性的试剂分离第二细胞群。
13.在一些实施方案中，ssea3抗体或cd4和cd8抗体是单克隆抗体，例如小鼠单克隆igg或igm抗体或大鼠单克隆igg或igm抗体。在一些实施方案中，ssea3抗体或cd4和cd8抗体结合至磁性颗粒。
14.本公开的范围还包括包含通过上述方法富集的muse细胞的药物组合物。
15.在另一方面，本公开提供了包含通过上述方法富集的muse细胞的细胞治疗组合物，用于同种异体移植。
16.在又一方面，本公开提供了一种在受试者(例如人)中再生组织的方法。该方法包括向受试者施用有效量的通过上述方法富集的muse细胞。
17.前述概述并非旨在定义本公开的每个方面，并且在其他部分(例如以下详细描述)中描述了其他方面。整个文档作为统一的公开相关联，并且应当理解涵盖了本文描述的特征的所有组合，即使特征的组合未在本文的同一句子、段落或部分中出现。本发明的其他特征和优点将明显见于以下详细描述。然而，应当理解，详细描述和具体实施例虽然示明了本公开的具体实施方案但其仅作为示例给出，因为本领域技术人员通过该详细描述明显可知在本公开的精神和范围内的各种变化和修改。
18.附图简要说明
19.图1a和1b(统称为“图1”)是显示富集muse细胞的示例性方法的流程图。
20.图2是显示富集所需细胞群的示例性方法的流程图。
21.图3示出了用于实施所公开的富集muse细胞的方法的装置。该装置包括两个容器(容器1和容器2)，每个容器带有两个喷口。喷口b通过管路连接到另一个容器上的喷口b，这
样液体内容物就可以从容器1流入容器2中。所述容器可以包括围绕每个容器的磁体(magnet)(剖面)，以吸引细胞结合抗体包被的磁性微珠。
22.图4示出了wj-msc细胞数量与脐带重量之间的线性关系。
23.图5a和5b(统称为“图5”)示出了脐带内膜(cord lining，cl)细胞(图5a)和华通氏胶(wharton’s jelly，wj)细胞(图5b)中cd105 和ssea3 /cd105 的表达水平。灰色柱表示表达cd105 的细胞的百分比。黑色柱表示表达cd105和ssea3两者的细胞的百分比。数字代表不同的样品。p0、p1和p2表示1、2和3代。单向anova显示，cl组的p0和p1之间以及wj组的p0和p2之间ssea3 百分比急剧下降。
24.图6a示出了华通氏胶细胞的相衬图像(10x)。图6b示出了脐带衬里细胞的相差图像(10x)。将组织接种在虚线圆圈中，msc在此处开始生长。比例尺表示100μm。
25.图7示出了huc来源的msc的流式细胞术分析。样品取自96wj p2。ssc-a和fsc-a用于从碎片中门控细胞，fsc-h和fsc-a用于门控不成簇的单细胞。碘化丙啶(pi)染色用于排除死细胞。结果显示总细胞的92.98％是存活的，1.55％为ssea3 ，并且超过99％为cd105 、cd90 、cd73 、cd44 、cd166 和cd29 。所述细胞是cd14-和cd45-。
26.图8示出了来自96wj p2的磁激活细胞分选后(post-magnetically activated cell sorting，post-macs，macs后)的分离的ssea3 细胞的流式细胞术结果。在分选后立即分析样品。总细胞的大约89.84％是活的。分选群的92.31％为ssea3 ，而根据直径其他7.27％似乎是碎片。超过99.5％是cd105 、cd29 、cd90 、cd73 、cd44 和cd166 。所述细胞是cd14-和cd45-。
27.图9示出了在接下来的十代中macs后ssea3 细胞的百分比变化。96wj-p2-macs-p0在磁分选紧后，并且总细胞群的93.77％是ssea3 但cd14-。根据直径，其他6.19％是碎片。培养分选的细胞，并且每四天收集下一代细胞。在第一代中的ssea3 百分比下降到14.8％，但在p2到p5的ssea3 百分比范围为62.5％至75.9％。在p6到p9的ssea3 细胞百分比下降到42.0％-54.7％。即使在p10中，培养物仍然含有37.3％的ssea3 细胞。p10后，细胞被再分选，并获得89.4％的ssea3 的培养物。在所有代中，cd105 百分比都保持在99.0％以上。
28.图10a、10b和10c示出了96cl第1代的染色。图10a示出了96cl第1代的hoechst染色。图10b示出了96cl第1代的ki-67染色。图10c示出了图10a和图10b的合并图像。抗原ki-67是增殖细胞的标志物的一种核蛋白。总细胞的大约65％是ki-67 ，表明该细胞群的增殖非常活跃。比例尺＝50μm。
29.图11示出了macs后传代10次时muse和非-muse细胞的倍增时间(td)。左轴表示muse细胞和非-muse细胞的细胞倍增时间。右轴表示muse细胞的百分比。p1中的muse细胞的td为403小时，表明它们几乎不增殖，而非-muse细胞的td为14.4小时。从p2到p7，muse细胞的td为24.9 5.4小时，表明muse细胞的数量大约每天翻一番，而从p8到p11，td增加到39.8 5.4小时。对于非muse细胞，从p2到p11，td相当稳定地在31.2
±
7.8小时。所述数据表明p2到p7是再分选以获得数百万个muse细胞的最佳代次。
30.图12示出了在macs后与所分选的细胞结合的具有ssea3抗体的微珠的水平。分选的ssea3 细胞(96.29％)中，99.19％具有带标记的微珠，并且信号强。这些结果表明微珠非常有效。
31.发明详述
32.本公开描述了一种有效且廉价地分离和富集大量健康muse细胞的方法，例如，从分离自人脐带(huc)的间充质细胞分离和富集。在一个实例中，所述方法采用磁激活细胞分选(macs)以分离ssea3 细胞，然后在培养中进行细胞扩增，然后进行第二次macs程序以获得具有约或大于80％ssea3 细胞的高纯度细胞群。
33.所公开的方法在几个方面是有利的。首先，该方法温和且不会损伤细胞。抗ssea3抗体包被的珠子与细胞表面的ssea3结合，并将细胞移向涂覆在容器壁上的磁体，使得非ssea3表达细胞通过。其次，该方法非常高效，可以在几分钟内分选数十亿个细胞。第三，该方法保留了非muse细胞，允许它们流过、进行分析或再分选，其也可以用作与muse处理进行比较的对照细胞。第四，分离的muse细胞应该几乎没有或没有调节障碍，因为macs分选的细胞长期一直用于cd34 细胞的临床试验(richel，d.j.等人，bone marrow transplant，2000.25(3)：p.243-9)。最后，该方法产生相对高纯度的ssea3 细胞(例如，》80％的ssea3 细胞)，优于先前发表的使用macs的研究，后者产生77.1％和71.3％的分离的muse细胞(uchida，h.等人，stroke，2017.48(2)：p.428-435；kinoshita，k.等人，stem cells transl med，2015.4(2)：p.146-55)。
34.本公开还描述了一种从起始细胞(例如单核细胞)中分离所需细胞群，例如t-淋巴细胞和nk-淋巴细胞、ssea3 muse细胞以及cd14 单核细胞和cd34 内皮前体和cd133 多能干细胞的有效方法。所述淋巴细胞可以用cd4和cd8抗体包被的微珠进行选择。它们可以经修饰以表达嵌合抗原受体(car)，从而产生靶向特定肿瘤的car-t和car-nk细胞。muse细胞可以用ssea3抗体包被的微珠进行选择，并在贴壁培养中扩增，以产生大量的多能muse细胞。muse细胞可用于修复肝脏、肺、心脏、肾脏、脑和其他组织。针对剩余的细胞富集cd14 单核细胞、cd34 内皮祖细胞和/或cd133 多能细胞，这三种细胞被认为是分泌生长因子以再生脊髓和脑的m2巨噬细胞的来源。这三种细胞群可以根据临床状况和时间而按不同比例施用。
35.i.富集所需细胞群的方法
36.图1a示出了一种富集muse细胞的方法。该方法包括：(i)在101处提供muse细胞的细胞或组织来源；(ii)在103处，从muse细胞的细胞或组织来源分离第一细胞群，其中所述第一细胞群通过选择ssea3 细胞而分离并且包含ssea3 muse细胞；(iii)在105处在培养基中培养第一细胞群的至少一个亚群；和(iv)重复步骤(iii)至少1-10代(例如，至少1代、至少2代、至少3代、至少4代、至少5代、至少6代、至少7代，至少8代，至少9代，至少10代)。在107处，所述方法进一步包括通过选择ssea3 细胞从所得的培养细胞分离富集的muse细胞群，由此富集的muse细胞群包含约或大于80％的ssea3 muse细胞。在一些实施方案中，muse细胞的细胞或组织来源包括间充质细胞或单核细胞。
37.图1b示出了用于富集muse细胞的方法的实例。第一，对muse细胞的细胞或组织来源进行macs分离，例如，通过选择ssea3 细胞。第二，分离的muse细胞的亚群可以培养至少1到10代。然后，将所得的培养细胞进行第二次macs分离以富集muse细胞，例如，通过选择ssea3 细胞。富集的muse细胞可用于多种应用，包括移植。富集的muse细胞的应用进一步描述于本公开的后面部分。
38.术语“培养”是指维持细胞处于其可以增殖并避免衰老的条件下。例如，细胞在任选地含有一种或多种生长因子(即生长因子混合物)的培养基中培养。
39.术语“扩增”是指细胞的体外培养。此类细胞可以从哺乳动物中提取，并且通过在合适的环境中(例如在含有生长因子的培养基中)培养，产生额外量的细胞。如果可能，建立稳定的细胞系以允许细胞持续繁殖。
40.用于培养/扩增细胞的培养基可以是用于支持细胞生长的基础培养基，例如dmem/f-12(gibco)。所述培养基可以包含碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)。在一些实施方案中，所述培养基可包含约0.1ng/ml至100ng/ml bfgf(例如，0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml，50ng/ml)。在一些实施方案中，所述培养基可包含约1％至约20％fbs、约0.5mm至约10mm glutamaxtm-i、约0.1％至约5％psa和约0.1ng/ml至约100ng/ml bfgf。在一些实施方案中，培养基是dmem/f-12基础培养基，其包含约1％至约20％fbs、约0.5mm至约10mm glutamaxtm-i、约0.1％至约5％psa和约0.1ng/ml至约100ng/ml bfgf。在一些实施方案中，培养基是dmem/f-12基础培养基，其包含约10％fbs、约2mm glutamaxtm-i、约1％psa和约1ng/ml bfgf。
41.图2示出了一种富集所需细胞群的方法。所述方法包括：(i)在201处提供muse细胞的细胞或组织来源；(ii)在203处，从起始细胞分离第一细胞群、第二细胞群和第三细胞群。在203a处，通过选择ssea3 细胞获得第一细胞群。在203b处，通过选择cd4 和cd8 细胞获得第二细胞群。在从muse细胞的细胞或组织来源分离第一细胞群和第二细胞群后，在203c处，回收第三细胞群。
42.在一些实施方案中，第二细胞群包含t-淋巴细胞和自然杀伤(nk)淋巴细胞。在一些实施方案中，第三细胞群包含cd14 单核细胞、cd34 内皮祖细胞或cd133 多能细胞。
43.分离第一细胞群和分离第二细胞群可以任何顺序进行。在一个实例中，分离第一细胞群在分离第二细胞群之前进行。在另一个实例中，分离第一细胞群在分离第二细胞群之后进行。
44.在一些实施方案中，使用包含ssea3抗体的基于免疫亲和性的试剂分离第一细胞群。在一些实施方案中，使用包含cd4和cd8抗体的基于免疫亲和性的试剂分离第二细胞群。
45.在一些实施方案中，所述ssea3抗体或所述cd4和cd8抗体是单克隆抗体，例如小鼠单克隆igg或igm抗体或大鼠单克隆igg或igm抗体。在一些实施方案中，所述ssea3抗体或所述cd4和cd8抗体与磁性颗粒结合。
46.cd4抗体的非限制性实例可以包括4b12(thermo fisher scientific)、nbp1-19371(novus biologicals)、mab3791(r&d systems)和mt310(santa cruz biotechnology)。
47.cd8抗体的非限制性实例可包括yts169.4大鼠抗小鼠cd8抗体(bio-rad)、小鼠抗大鼠cd8抗体(novus biologicals)、抗鼠cd8a抗体(dianova)、山羊抗猫(goat anti-feline)cd8多克隆抗体(novus)等。抗人cd8抗体同样可用，即小鼠抗人cd8抗体克隆ravb3(biosource)、ab4055和ab203035(abcam)、yts169.4(bio-rad)、mab1509(r&d systems)和32-m4(santa cruz biotechnology)。
48.ssea3抗体的非限制性实例可包括ma1-020和mc-631(thermo fisher scientific)、ls-c179938(lsbio)和15b11(ibl)。
49.在某些情况下，分离单核细胞(例如cd14 单核细胞)是有用的。单核细胞是m1和m2巨噬细胞的前体，对于清理受损组织和刺激受损组织的修复很重要。单核细胞也可以分化
成在激活免疫系统的抗原呈递中发挥作用的树突状细胞。cd14抗体通常用于分离单核细胞。cd14在脂多糖结合蛋白(lpb)存在的情况下结合脂多糖(lbs)，但它也识别其他病原体相关分子，如脂磷壁酸。市售cd14抗体包括但不限于uchm-1(milliporesigma antibodies)、抗cd14抗体(sino biological)、5a3b11b5 cd14抗体(santa cruz biotechnology)、4b4f12抗cd14抗体(abcam)、克隆m5e2(stemcell technologies)、hcd14 cd14抗体(biolegend)、invitrogen cd14抗体(ebiosciences)、人cd14抗体mab3832-100(r&d systems)、克隆t
ü
k4(bio-rad)等。
50.如本文所用，术语“抗体”(ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体和多反应性抗体)和抗体片段。因此，在本说明书任何上下文中使用的术语“抗体”旨在包括但不限于任何特异性结合成员、免疫球蛋白类别和/或同种型(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga、igd、ige和igm)；及其生物学相关片段或其特异性结合成员，包括但不限于fab、f(ab
′
)2、fv和scfv(单链或相关实体)。本领域理解，抗体是具有通过二硫键互连的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白或其抗原结合部分。如本文所用，“抗体”的定义还包括嵌合抗体、人源化抗体和重组抗体、从转基因非人动物产生的人抗体，以及使用技术人员可用的富集技术从文库中选择的抗体。
51.如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能以少量存在的天然发生的突变之外，构成群体的个体抗体是相同的。术语“多克隆抗体”是指包含针对不同决定簇(“表位”)的不同抗体的制备物。
52.在一些实施方案中，通过所公开的方法分离和/或富集的细胞是基本上纯的。术语“基本上纯的”是指特定细胞构成了制备物中细胞的主要部分或大部分(即超过20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)。通常，基本上纯化的细胞群构成制备物中细胞的至少约70％，通常是制备物中细胞的约80％，并且尤其是制备物中细胞的至少约90％(例如，95％、97％、99％或100％)。
53.图3示出了用于实施所公开的方法的装置。该装置使两个连续的macs分选能够从各种来源分离三个细胞群，例如脐带血来源的单核细胞(ucbmnc)。所述装置包括两个容器(例如容器1和容器2)，每个容器具有两个喷口。喷口b通过管路连接到另一个容器上的第二喷口b。通过连接两个喷口b的管路，液体内容物可以从一个容器流入另一个容器。所述装置还包括围绕每个容器的磁体(剖面)，以吸引细胞结合抗体包被的磁性微珠。当存在磁体时，抗体包被的微珠保留在容器中。细胞悬液通过喷口a注入并通过喷嘴b流出。剩余的细胞悬液可以通过喷嘴c流出。在去除可重复使用的磁体后，单独的细胞群可以直接在两个容器中清洗，并通过喷嘴a和c从容器中收集。在一个实例中，容器1可以包括用于选择cd4/cd8淋巴细胞的cd4和cd8抗体-包被的磁性微珠，容器2可以包括用于选择ssea3 muse细胞的ssea3抗体包被的磁性微珠。在另一个实例中，容器1可以包括用于选择ssea3 muse细胞的ssea3抗体包被的磁性微珠，并且容器2可以包括用于选择cd4/cd8淋巴细胞的cd4和cd8抗体包被的磁性微珠。
54.如本文所用，术语“muse细胞”是指kuroda等人，2010和wakao等人，2011以及美国专利申请号20120244129和20110070647中描述的多能干细胞，其内容通过引用整体并入本文。更具体地，muse细胞是指一种特定类型的动物(例如人类)间充质多能干细胞，其能够从单个细胞产生具有所有三个胚层特征的细胞。muse细胞是耐受应激的(stress tolerant)；
在形态学上与贴壁培养中的一般间充质细胞(类似成纤维细胞)无法区分；能够在悬浮培养中形成多能性标志物和碱性磷酸酶染色阳性的m簇；能够自我更新；它们的增殖活性不是很高，并且在免疫缺陷小鼠睾丸中显示不形成畸胎瘤；能够在体外和体内分化为内胚层、外胚层和中胚层细胞；并且cd105和ssea3均呈阳性。
55.通过流式细胞术分析或rt-pcr，muse细胞也可表达多能性标志物，例如nanog、oct3/4和sox2，并且对以下呈阴性：ng2(血管周围细胞标志物)、cd34(内皮祖细胞和脂肪来源的干细胞的标志物)、willebrand因子(内皮祖细胞标志物)、cd31(内皮祖细胞标志物)、cd117(c-kit，成黑色素细胞标志物)、cd146(血管周围细胞和脂肪来源的干细胞的标志物)、cd271(神经嵴来源的干细胞的标志物)、sox10(神经嵴来源的干细胞的标志物)、snail(皮肤来源的前体的标志物)、slug(皮肤来源的前体的标志物)、tyrp1(成黑色素细胞标志物)和dct(成黑色素细胞标志物)。
56.来自骨髓、成纤维细胞或脂肪组织的muse细胞的数量和生长能力有限。这些细胞在骨髓穿刺物中并不丰富，并且大约只有1∶3,000的骨髓单核细胞是muse细胞。在间充质细胞培养物中，muse细胞仅占成纤维细胞和骨髓基质细胞的几个百分比。一旦分离并悬浮培养，muse细胞通常只生长几周，然后停止增殖，但在转移到贴壁培养后，它们开始增殖。因此，仅仅从骨髓单核细胞分离cd105 /ssea3 细胞并随后常规培养此类分离的细胞不可提供足够用于实际应用的muse细胞。
57.尽管muse细胞在悬浮培养中的增殖有限，但它们会继续生长，直到达到它们在贴壁培养中的hayflick极限。这个极限在人类胎儿细胞培养中为40-60次分裂。在较老的成人细胞培养中，根据细胞的年龄，hayflick极限应该更小。脐带血细胞是出生后最年轻的细胞来源，应该具有更多的增殖能力。类似于其他体干细胞和造血干细胞。muse细胞通过对称细胞分裂产生自身，但同时通过不对称细胞分裂随机产生非muse细胞。因此，最初纯化的muse细胞培养物在培养物中的浓度呈s型下降，达到几个百分点的平台，然后保持该较低的浓度。然而，如本文所公开的，本发明的方法允许人们在体外分离muse细胞并增加其浓度。
58.所公开的方法可用于从各种组织分离、富集或扩增muse细胞。在一些实施方案中，起始细胞是从脐带血获得的。由于以下原因，脐带血是muse细胞的一种有吸引力的来源。首先，hla匹配的脐带血是一种丰富且具有免疫相容性的muse细胞来源。许多脐带血库储存了数十万个脐带血单位，这些单位可以进行hla匹配，以提供免疫相容的muse干细胞用于移植目的。其次，脐带血细胞比获自骨髓、皮肤或脂肪的其他来源的成体间充质干细胞具有更大的扩增潜力。第三，脐带血在骨髓置换中已有长久的安全使用史，并且肿瘤发生风险低。
59.所公开的方法也适用于从脐带血以外的其他组织分离、扩增或富集muse细胞。muse细胞是从间充质干细胞分离出来的一个特殊的多能干细胞亚群。因此，适于分离间充质干细胞的任何来源均可用于实施所公开的方法。此类来源的非限制性实例包括脐带、脐带基质细胞(华通氏胶)、羊膜、胎盘、脐带内膜以及甚至经血。其他实例包括骨髓、皮肤、脂肪组织以及甚至外周血。然而，正如上面所指出的，这些来源都不具有像脐带血细胞那样多的muse细胞，并且其生长潜力可能更小。
60.一旦分离或富集了所需的细胞群(例如，muse细胞)，然后可以使用一种或多种谱系特异性标志物通过标准技术测试细胞，以确认细胞的分化潜力。也就是说，可以在合适的培养条件下测试是否可以诱导细胞分化并产生表达三个胚层标志物的细胞。外胚层细胞的
示例性标志物包括巢蛋白(nestin)、neurod、musashi、神经丝(neurofilament)、map-2和黑素细胞标志物(例如酪氨酸酶、mitf、gf100、trp-1和dct)；中胚层细胞的示例性标志物包括brachyury、nkx2-5平滑肌肌动蛋白、骨钙素、油红-( )脂滴和结蛋白(desmin)；内胚层细胞的示例性标志物包括gala-6、甲胎蛋白、细胞角蛋白-7和白蛋白。
61.例如，可以通过本领域已知的方法诱导分离/富集的细胞，以形成神经-胶质细胞、骨细胞和脂肪细胞。简而言之，可以将细胞传代并培养至汇合，转移至骨细胞培养基(osteogenic medium)或脂肪细胞培养基(adipogenic medium)并孵育合适的时间(例如，3周)。可以通过钙积累的矿化(mineralization of calcium accumulation)来评估成骨的分化潜力，这可以通过von kossa染色进行可视化。为了检查成脂肪分化，细胞内脂滴可以通过油红o染色并在显微镜下观察。对于神经分化，细胞可以在神经细胞培养基(neurogenic medium)中孵育合适的时间(例如7天)，然后进行血清耗竭和β-巯基乙醇孵育。分化后，细胞表现出可伸缩细胞体的形态，具有排列成网络的延伸的神经突状结构。可以进一步进行谱系特异性标志物的免疫细胞化学染色，以确认神经分化。所述标志物的实例包括神经元特异性iii型β-微管蛋白(tuj-1)、神经丝和gfap。
62.ii.组合物和治疗方法
63.通过上述方法富集的三种细胞群对许多病况都有有益的影响，并且可以以多种方式使用。例如，淋巴细胞，如t细胞和nk细胞，当被修饰以表达针对特定肿瘤抗原的嵌合抗原受体(car)时，显示出对肿瘤细胞的毒性。具有cd34/cd133 祖细胞的单核细胞是巨噬细胞前体细胞。巨噬细胞具有三种表型：m1是促炎吞噬细胞；m2是抗炎修复吞噬细胞；以及树突细胞，吞噬死亡或垂死的细胞，以将它们的抗原呈递给免疫细胞。单核细胞在移植到脊髓中时，可能是刺激再生的效应细胞。cd34 /cd133 细胞分别是内皮前体细胞和多能脐带血干细胞。两者都可以刺激单核细胞产生m2巨噬细胞。但是cd34 细胞具有价值，因为它们参与血管生成和可能的造血。cd133 细胞是多能细胞，可用于分化为多种细胞。
64.muse细胞是多能间充质干细胞，能够通过体外贴壁培养分化为三个胚层。具体地，所述多能干细胞通过体外诱导培养可分化为代表三个胚层的细胞，包括皮肤、肝脏、神经、肌肉、骨骼、脂肪等。此外，它们在体内移植时能够分化为具有三个胚层特征的细胞，并且当通过静脉内注射移植到活体的受损器官时能够存活并分化为器官(例如皮肤、脊髓、肝脏和肌肉)。
65.所述细胞或细胞群由于其多能性和非致瘤性，可用于治疗各种退行性疾病或遗传性疾病，同时避免人类胚胎操作的伦理考虑因素以及与其他干细胞(如es细胞和ips细胞)相关的致瘤风险。此外，由于所公开的方法允许获得大量的多能干细胞，例如muse细胞，因此还可以避免与其他类型干细胞相关的后勤保障难度。
66.因此，本公开还提供了包含通过上述方法富集的muse细胞的药物组合物。在另一方面，本公开提供了用于同种异体移植的细胞治疗组合物，其包含通过上述方法富集的muse细胞。所述组合物可包含用于将muse细胞递送至有需要的受试者的合适运载体(vehicle)。在一些实施方案中，所述组合物可包含muse细胞和冷冻保护剂。
67.分离的muse细胞用于治疗各种病况，包括脊髓损伤、脱髓鞘病况(demyelination condition)、外伤性脑损伤和中风，以及抑制不期望的免疫反应(例如炎症)和治疗心脏、肺、肠道、肝脏、胰腺、肌肉、骨髓和皮肤的病症。为此，可以先在体外，然后在体内，然后在未
受伤的免疫缺陷动物中，并且最后在脊髓损伤的动物和其他中枢神经系统和其他组织损伤的模型中，测试细胞的多能性。
68.因此，本公开提供了一种用于再生各种类型的组织、各种器官等的方法，实例包括皮肤、脑-脊髓、肝脏和肌肉。所述方法包括向受试者施用有效量的通过上述方法富集的muse细胞。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用有效量的通过上述方法分离的第一细胞群。在一些实施方案中，muse细胞可以直接施用于受伤或受损组织、器官等或其邻近区域，使得muse细胞进入组织或器官并分化成相关组织或器官特有的细胞。通过这种方式，muse细胞可以促进组织和器官的再生或重建。此外，muse细胞的全身施用可以通过静脉内施用等进行。在这种情况下，muse细胞通过归巢(homing)等导向受损的组织或器官，到达并进入该组织或器官，然后分化为该组织或器官的细胞，从而能够促成组织或器官的再生和重建。
69.要再生的器官的实例包括但不限于骨髓、脊髓、血液、脾脏、肝脏、肺、肠、眼睛、脑、免疫系统、循环系统、骨骼、结缔组织、肌肉、心脏、血管、胰腺、中枢神经系统、周围神经系统、肾脏、膀胱、皮肤、上皮附属物(epithelial appendages)、乳腺(breast-mammary gland)、脂肪组织以及口腔、食道、阴道和肛门的粘膜。此外，其中要治疗的疾病的实例包括癌症、心血管疾病、代谢疾病、肝病、糖尿病、肝炎、血友病、血液系统疾病、退行性或外伤性神经病症如脊髓损伤、自身免疫病、遗传缺陷、结缔组织病、贫血、传染病、移植排斥、缺血、炎症以及皮肤或肌肉损伤。
70.可以通过输注或注射(例如，静脉内、鞘内、肌肉内、腔内、气管内、腹膜内或皮下)、口服、透皮或本领域已知的其他方法将细胞施用于个体。此外，本文可以进行局部施用或全身施用。例如，可以使用导管进行局部施用。根据要再生的器官、组织类型或大小，适当地确定剂量。施用可以是每两周一次、每周一次或更频繁，但是在疾病或病症的维持阶段期间可以降低频率。
71.细胞可以与药学上可接受的基础物质(base material)一起施用。这种基础物质可以由具有高生物相容性的物质，例如胶原蛋白或可生物可降解物质制成。它们可以是颗粒、板、管、容器等形式。细胞可以在其与基础物质结合之后或在使基础物质在其中包含细胞之后施用。
72.本发明包括用于细胞移植疗法的材料或用于细胞移植疗法的组合物，或用于再生医学的材料或用于再生医学的组合物，其包含muse细胞、由muse细胞形成的胚状体样细胞簇，以及通过从muse细胞或上述胚状体样细胞簇分化而获得的细胞或组织/器官。除了muse细胞、由muse细胞形成的胚状体样细胞簇或通过从muse细胞或上述胚状体样细胞簇分化而获得的细胞或组织和/或器官之外，这样的组合物还包含药学上可接受的缓冲剂、稀释剂等。
73.异源和自体细胞均可使用。在前一种情况下，应进行hla匹配以避免宿主反应或使其最小化。在后一种情况下，从受试者富集和纯化自体细胞并储存以备后用。细胞可以在宿主或移植t细胞存在下离体培养并重新引入宿主。这可能具有的优势是宿主将细胞识别为自身并更好地提供t细胞活性的降低。
74.剂量和施用频率将取决于确认维持缓解期的临床体征，以及本领域技术人员已知的急性期的至少一种或多种优选多于一种临床体征的减少或不存在。更一般地，剂量和频
率将部分取决于考虑用上述组合物治疗的疾病状况或病症的病理体征以及临床和亚临床症状的消退。剂型和施用方案可以根据施用的年龄、性别、身体状况以及所述结合物的益处和待治疗的患者或哺乳动物受试者中的副作用以及医生的判断进行调整，正如本领域技术人员所理解的那样。在所有上述方法中，细胞可以1
×
104至1
×
10
10
/次施用于受试者。
75.此外，从患者采集细胞，分离muse细胞，然后muse细胞可用于各种诊断。例如，从muse细胞收集患者的基因，然后获取基因信息，从而使反映该信息的精确诊断成为可能。例如，可以通过使患者的细胞来源的muse细胞分化，来获得具有与受试者的特征相同的特征(例如，遗传背景)的各组织和/或器官的细胞。因此，对于疾病诊断、病理状况的阐明、药物作用或不良反应的诊断等，可以根据每个受试者的特征进行适当的诊断。具体地，muse细胞、由muse细胞形成的胚状体样细胞簇、通过muse细胞或上述胚状体样细胞簇分化而获得的细胞或组织和/或器官，可以用作诊断物质。例如，本发明包括使用从受试者分离的muse细胞或使用具有与受试者的遗传背景相同的遗传背景的组织或器官(通过从muse细胞的分化而获得的)诊断受试者的疾病等的方法。
76.如本文所用，术语“受试者”是指脊椎动物，并且在一些示例性方面，是指哺乳动物。此类哺乳动物包括但不限于啮齿目哺乳动物，例如小鼠和大鼠，以及兔形目哺乳动物，例如兔，食肉目哺乳动物，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)，偶蹄目哺乳动物，包括牛(奶牛)和猪类(swines)(猪(pigs))或奇蹄目，包括马类(equine)(马(horse))，灵长目、ceboids或simoids(猴)目和类人猿目(人和猿)哺乳动物。在示例性方面，哺乳动物是小鼠。在更示例性的方面，哺乳动物是人。
77.如本文所用，术语“施用”是指通过任何途径递送细胞，例如muse细胞，包括但不限于口服、鼻内、眼内、静脉内、骨内、腹膜内、脊柱内、肌肉内、关节内、心室内、颅内、病灶内、气管内、鞘内、皮下、皮内、经皮或经粘膜施用。
78.如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指导致特定病症的至少一种症状或参数的可测量改善的量。上述细胞的治疗有效量可以通过本领域已知的方法确定。可通过本领域普通技术人员已知的经验方法确定用于治疗病症的有效量。给患者施用的确切量将根据病症的状态和严重程度以及患者的身体状况而变化。任何症状或参数的可测量改善均可由本领域技术人员确定或由患者报告给医师。应当理解，上述病症的任何症状或参数的任何临床或统计学上显著的减轻或改善都在本发明的范围内。临床上显著的减轻或改善表示是患者和/或医生可察觉的。
79.药物组合物或细胞治疗组合物可以通过将治疗有效量的细胞和任选的其他活性剂/化合物与药学上可接受的载体混合来制备。载体是利用其施用化合物的稀释剂、赋形剂或运载体。载体可以有不同的形式，这取决于施用途径。载体可以是无菌液体，例如水和油。水或水溶液、盐水溶液以及水性葡萄糖和甘油溶液优选用作载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物载体在ew martin，第18版的“remington
′
s pharmaceutical sciences”中有描述。例如，所述组合物可以通过与常规药物赋形剂混合和制备方法来制备。赋形剂可以与崩解剂、溶剂、造粒剂、保湿剂和粘合剂混合。
80.短语“药学上可接受的”是指此类组合物的分子实体和其他成分在生理上是可耐受的，并且当施用于人时通常不会产生不期望的反应。优选地，术语“药学上可接受的”是指经过联邦或州政府的监管机构的批准或在用于哺乳动物更特别地用于人类的美国药典或
其他普遍认可的药典中列出的。药学上可接受的盐、酯、酰胺和前药是指在合理的医学判断范围内，适合与患者的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应等，与合理的收益/风险比相称，并且对它们的预期用途有效的那些盐(例如，羧酸盐、氨基酸加成盐)、酯、酰胺和前药。
81.iii.定义
82.为了帮助理解根据本公开的组合物和方法的详细描述，提供了一些明确的定义以促进本公开各个方面的明确公开。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
83.这里要注意的是，在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。除非另有说明，否则术语“包括”、“包含”、“含有”或“具有”及其变体旨在涵盖其后列出的项目及其等同物以及附加的主题。
84.重复使用短语“在一个实施方案中”、“在各种实施方案中”、“在一些实施方案中”等。这样的短语不一定指同一个实施方案，但除非上下文另有指示，否则它们可能是指同一个实施方案。
85.如本文所公开的，提供了多个数值范围。应当理解，还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值，到下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。任何所示数值或所示范围内的中间值和该所示范围内的任何其他所示值或中间值之间的每个较小范围也都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括或排除在该范围内，并且其中一个限值、没有限值或两个限值都包括在较小范围内的每个范围也包括在本发明内，接受所示范围内任何具体排除的限值。在所示范围包括限值的之一或两者的情况下，排除这些所包括的限值之一或两者的范围也包括在本发明中。
86.术语“约”通常是指所示数字的正或负10％。例如，“约10％”可表示9％至11％的范围，“约1”可表示0.9-1.1，“约4”可表示3.6-4.4。“约”的其他含义可以从上下文中显而易见，例如四舍五入，因此，例如，“约1”也可以表示从0.5到1.4。术语“约”可以指具体值的
±
5％、
±
10％、
±
20％或
±
25％的变化。例如，在一些实施方案中，“约50”％可以指45％到55％的变化。对于整数范围，术语“约”可包括比所述整数大和/或小一个或两个整数。除非本文另有说明，否则术语“约”旨在包括接近所述范围的值，例如重量百分比，其在单个成分、组合物或实施方案的功能方面是等效的。
87.术语“治疗”是指将组合物或药剂施用于患有病症或有发展病症风险的受试者，目的是治愈、缓解、减轻、矫正(remedy)、预防或改善病症、病症的症状、病症的继发疾病状态或发展病症的素因，或延迟其发作。
88.如本文所用，当用于指代项目的集合时，术语“每个”旨在说明集合中的单个项目，但不一定指集合中的每一个项目。如果明确披露或上下文另有明确规定，则可能会出现例外情况。
89.除非另有声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求的元素对于本发明的实施是必不可少的。
90.除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均以任何合适的顺序进行。关于所提供的任何方法，该方法的步骤可以同时或顺序发生。当该方法的步骤
顺序发生时，除非另有说明，否则这些步骤可以以任何顺序发生。
91.在方法包括步骤组合的情况下，除非本文另有说明，否则步骤的各个或每一个组合或子组合都包含在本公开的范围内。
92.在此引用的每个出版物、专利申请、专利和其他参考文献在与本公开内容不矛盾的范围内通过引用整体并入。本文公开的出版物仅是由于其在本发明的申请日之前公开。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权因在先发明而早于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，其可能需要独立确认。
93.应当理解，本文中描述的实例和实施例仅用于说明目的，并本领域技术人员了解根据其进行的各种修改或改变并将这些修改或改变包括在本技术的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。
iv.实施例
94.实施例1
95.本实施例描述了后续实施例中使用的材料和方法。
96.huc msc的分离
97.huc包装在一个装满运输介质的瓶子中，运输介质包括kh2po4(0.20g/l)、na2hpo4(无水，1.15g/l)、kcl(0.20g/l)和nacl(8.00g/l)。瓶子用冰包围以保持在4℃。所有脐带均在患者同意的情况下收集，符合罗格斯大学伦理委员会(rutgers university ethics committee)的要求。从患者到实验室的运输花了一天时间。表i列出了本研究中使用的抗体。
98.人脐带(huc)msc的分离遵循如下所述的规程。首先，将huc放置在10-cm的培养皿中。然后将huc切成1-cm的小块并纵向切开。接下来，取出huc动脉和静脉，并清洗huc组织，然后分离华通氏胶和脐带内膜组织。用胶原酶处理组织，并将细胞接种到细胞培养瓶中。简而言之，去除血管后，用手术刀从华通氏胶上刮下间充质组织，并在室温下以250x g离心5分钟，用无血清dulbecco改良eagle培养基(dmem，gibco，11330-032)洗涤沉淀。接下来，将细胞在室温下以250x g离心5分钟，然后用浓度为2mg/ml的i型胶原酶溶液(sigma，scr103)在37℃下处理16小时。然后洗涤细胞并用2.5％胰蛋白酶(10x)储备溶液(thermofisher scientific，15090046)在37℃搅拌下处理30分钟。最后，洗涤细胞并在含有10％胎牛血清(fbs，gibco 10437-028)细胞培养基中于5％co2下在37℃培养箱中培养，并将培养皿标记关于细胞传代、名称和日期的信息。
99.细胞培养和传代
100.来自wj或cl组织的细胞的第一次接种被命名为第0代(p0)，随后的代次被命名为p1和p2，等等。分析了前三代中ssea3阳性细胞的百分比。培养基含有10％fbs(gibco，10437-028)、2mm glutmax(gibco，35050-061)、1％青霉素-链霉素(gibco，15140-122)、1ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bfgf，peprotech，100-18b)，然后将dmem/f12(gibco，11330-032)装入250ml的培养瓶。当细胞达到90％汇合时传代(图4)，使用蛋白水解酶tryple
tm express(gibco，12604-013)从细胞培养皿、培养瓶或培养板中释放贴壁细胞，并将细胞重新接种其他培养皿、培养瓶或培养板。
101.免疫细胞化学染色
102.将细胞以2
×
104个细胞/孔的浓度转移到24孔板中。每个孔的底部都有一个圆形盖玻片(fisher scientific，1254580)。转移和适当的贴壁时间后，细胞用4％多聚甲醛(0.5ml/孔)固定，并在室温(rt)孵育10分钟，然后用pbs洗涤3次。然后将细胞用含5％正常山羊血清的pbs(不含triton
tm
x-100，sigma 234729，用于表面标志物，但含有0.3％triton
tm x-100用于ki-67核染色)孵育30分钟以阻断非特异性抗体结合，然后与一抗在4度下孵育过夜。细胞用pbs洗涤3次，并与二抗在rt下孵育30分钟。作为最后一步，将细胞在hoechst 33342核染色剂中孵育10分钟以标记核dna(thermofisher scientific，62249)。
103.流式细胞术
104.将细胞(～0.3
×
106细胞)用一抗在1.5ml微量离心管中孵育。对于ssea3，一抗孵育时间为4℃ 1小时，且二抗孵育时间为30分钟。对于来自miltenyi biotec的其他抗体，孵育时间为10分钟。上样前，将2.5μl 100μg/ml碘化丙啶溶液(miltenyi biotec，130093233)添加到500μl细胞悬液中，以标记可能无活力的细胞。同种型对照组用作对照。配备有十个荧光通道的macsquant analyzer 10流式细胞仪(miltenyi biotec)用于执行细胞计数并生成图表。
105.磁激活细胞分选法(macs)
106.几乎所有在塑料板上生长的人间充质细胞都表达cd105。macs程序正选择ssea3 细胞。将悬浮在2ml中的约6
×
106个细胞加载到磁性分选器(ms)柱(miltenyi biotec，130042201)中。首先添加ssea3抗体，然后添加抗大鼠kappa微珠(miltenyi biotec，130047401)。收集用于在macsquant 10流式细胞仪上分析的洗脱级分。ms柱不应装载超过6
×
106个悬浮在2ml中的染色的细胞。ms柱用1ml脱气缓冲液洗涤3次。在洗脱步骤中，将2ml缓冲液移液入ms柱中。3分钟后，推紧柱塞以获得磁性标记的细胞。本研究中使用的抗体列于表i。
107.倍增时间
108.为了确定细胞倍增时间(td)，将细胞以5
×
103细胞/cm2的密度铺板，并使用以下算法(http：//www.doubling-time.com)计算td：
109.td＝t
×
ln2/(lnn
t-lnn0)
110.其中n0是接种的细胞数，n
t
是收获的细胞数，t是培养时间(以小时为单位)。表iv中示出了前三个传代的部分的td。在每个样品中分别计算muse细胞和非muse细胞的td。
111.统计分析
112.spss(ibm，r23.0.0.0)、axiovision rel.4.8.0(sp2)和lsm image browser(zeiss service pack 2)用于评估使用单向方差分析(anova)的组间差异。使用最小显著差异(lsd)检验对组间比较进行事后分析。除非另有说明，否则结果表示为平均值
±
标准偏差(sd)。＜0.05的概率(p值)认为是显著的。axiovision rel.4.8.0sp2和zeiss lsm image browser(4.2.0.121版，zeiss，wetzlar，德国)用于获取图片。
113.实施例2
114.huc wj和cl都产生了大量的msc。表ii示出了第0代msc和ssea3 的数量。每克组织的msc和ssea3 细胞的浓度平均为3.7
±
0.55
×
104wj-msc、1.89
±
1.67
×
103wj-ssea3 、3.00
±
0.80
×
104cl-msc和2.24
±
2.00
×
103cl-ssea3 细胞。较重的脐带具有更多的wj msc(r2＝0.64，p＝0.01＜0.05，图4)。99wj组在第0代具有异常高的42.37％ssea 细胞。然而，
脐带重量与cl-msc/wj-ssea3 /cl-ssea3 不相关。wj-msc的数量与cl-msc或wj-ssea3 不相关。cl-msc和cl-ssea3 之间也不相关。
115.wj和cl细胞单独培养，并比较多次传代的ssea3 百分比(见图5)。在p0组中，来自wj和cl两者的总细胞的98％以上都为cd105阳性，并且在p1和p2中甚至更高。在p0时，wj和cl中ssea3 细胞的百分比分别为4.97％
±
4.30％和5.26％
±
5.14％。然而，在cl组的p0和p1之间以及wj组的p0和p2之间，ssea3 百分比急剧下降。
116.wj-msc和cl-msc具有相似的形态(图6)。它们呈纺锤形或三角形，胞体中央有一个大的椭圆形细胞核和一个或几个核仁。在图6b中，将组织接种在所示圆圈中，并且msc从那里生长。如通过免疫荧光所测定的，所有细胞均为cd105阳性。ssea3 细胞通常具有细长的突起(process)，并试图与周围的细胞建立连接。扁平细胞体呈不规则形状，但可大至30μm
×
100μm，具有大的椭圆形细胞核，其直径可达20μm。分裂的细胞具有更小、更圆的细胞体，但保持其典型的膜ssea3 染色。在图7中，wj和cl两者来源的msc都是cd105 、cd90 、cd73 、cd44 、cd166 和cd29 ，但是cd45-和d14-。
117.培养冷冻的96wj p2细胞，这导致ssea3 细胞百分比从3.91％增加到28.27％。另一种冷冻的96wj p2细胞的培养物产生20.62％的ssea3 细胞百分比，证实了这一现象。冷冻过程(恶劣的环境)可能诱导更高的muse细胞百分比。对从96wjp2到96wjp10的每个传代，进行macs。
118.使用macs从100万个msc中分选1.23
±
0.38
×
105个细胞(表iii)。在分选的细胞群中，91.44％
±
3.22％是ssea3 细胞，证明了这种方法的有效性。对于96wjp3，分选率为94.19％和95.24％，其他的分选率的平均值为28.31
±
6.11％，表明总ssea3 细胞的约28.31％是从msc群分选出来的。流式细胞术的进一步分析表明，分选的细胞群比未分选的细胞群表达更强的ssea3。从96wjp8，msc细胞群中ssea3 细胞的百分比下降到28.10％。之前的传代被提出用在macs中。进一步的分析显示，分选的细胞为ssea3 、cd105 、cd90 、cd29 、cd44 、cd73 和cd166 ，但是是cd14-、cd45-(图8)。
119.还监测了10次传代期间macs分选的96wjp2细胞中ssea3 细胞的百分比(参见图9)。macs之后，93.8％的细胞是ssea3 。在macs后的第一代中，ssea3 细胞的百分比下降至14.8％，但ssea3 细胞的数量反弹，并且从p2到p5培养物维持了62.48％-75.96％的ssea3 细胞。从p6到p9所述百分比下降至42.03％-54.73％。即使在p10，培养物也具有37.35％的ssea3 细胞。p10后，我们再分选细胞并获得89.40％的ssea3 细胞培养物。macs-culture-remacs可以产生数百万个muse细胞。
120.实施例3
121.具有12.5-mm的t11脊髓失重挫伤(weight drop contusion)的两只成年sprague-dawley大鼠在脊髓损伤(sci)后2周，将huc ssea3 和cd105 细胞移植到脊髓中。将细胞注射到损伤部位上方和下方的脊髓背根进入区。移植后细胞存活4周。大鼠未被免疫抑制。移植的细胞用针对人细胞核的抗体(stem 101 )染色，但对巢蛋白、gfap、neun、nf155和iba1呈阴性。当移植到脑和脊髓中时，人muse细胞可以存活很长时间并且不会被免疫排斥(uchida h等人stem cells.2016；34(1)：160-173；uchida h等人stroke.2017；48(2)：428-435)。
122.实施例4
123.如本公开中所证明的，分别从wj和cl分离的细胞用胶原酶培养，并量化三次传代中ssea3 细胞的百分比。来自wj和cl的第一代分别具有5.0
±
4.3％和5.3％
±
5.1％的ssea3 细胞。然而，在cl组的p1和p2之间以及wj组的p0和p2之间，ssea3 细胞的百分比显著下降(p＜0.05)。磁激活细胞分选法(macs)显著富集了ssea3 细胞至91.44
±
3.22％。培养分选的细胞群后，在p2到p5之间的ssea3 百分比范围为62.48％至75.96％。在p6到p9之间的ssea3 细胞百分比下降到42％-55％。即使在p10中，培养物仍然含有37％的ssea3 细胞。p10后，细胞被再分选并产生89％的ssea3 培养物。
124.用macs富集ssea3 细胞，然后在培养中扩增，然后用macs再次富集ssea3 的过程，可以在相对纯的培养物中分离数百万个ssea3 细胞。在培养时，分选的ssea3 细胞分化为胚状球体，并在移植到挫伤的sprague-dawley(sd)大鼠脊髓中后存活4周。ssea3 细胞从挫伤部位周围的四个注射点迁移到损伤区域，并且没有产生任何肿瘤。脐带是胎儿muse细胞的优秀来源，并且所公开的方法可以实用且有效地分离和扩增相对纯的ssea3 muse细胞群，这些细胞群可与人白细胞抗原(hla)匹配，用于人体试验的移植。
125.结果显示在wj和cl两组织中具有许多ssea3 和cd105 双阳性培养细胞。ssea3是一种多能细胞表面标志物。ssea3 和cd105 细胞可能是muse细胞。然而，ssea3 细胞的百分比在2-3次传代后迅速下降，表明非muse(即ssea3-)细胞比ssea3 细胞群分裂得更快。大约65％的msc(cd105 )为ki-67阳性(见图10)，表明了最近的增殖。
126.非muse细胞的td是稳定的，且单向anova显示在clp1和clp2之间、wjp1和wjp2之间、clp1和wjp1之间以及clp2和wjp2之间没有显著差异。大多数ssea3 细胞保持在g0状态，没有刺激它们的因素。表iv中的负数表示细胞根本没有分裂。在macs分选的ssea3 细胞群(图11)中，td时间平均为30.9
±
9.2小时，几乎与人成纤维细胞相同。td时间随着传代次数的增加而增加，而ssea3 细胞的百分比则下降。从图11可见，第一次macs后，p2～p7似乎是为后续移植实验进行再次分选的最好代次。在本研究中，使用ms柱的macs有效地从wj和cl组织分离了ssea3 细胞。分选前，＜5％的细胞是ssea3 。macs分选后，91.44
±
3.22％的细胞为ssea3 。使用标记检查试剂来确保ssea3抗体已成功与抗大鼠kappa微珠结合(图12)。分离出仅表现强ssea3表达(～28.31％)的muse细胞。提供了用于分选程序的两个特定指南：(1)不要在柱上装载超过600万个细胞，其细胞悬液的体积为2ml，而不是建议的0.5ml。否则，细胞可能会粘在柱子上；和(2)在洗脱步骤中，移取2ml缓冲液而不是1ml并等待3分钟，然后再使用柱塞。
127.单独的ssea3 细胞显示出典型的膜染色，而之前的研究仅显示具有ssea3染色的细胞簇。与大多数大小为2-120微米范围内的人细胞相比，ssea3 细胞体为25-90μm，类似于20-80微米的巨噬细胞，并且细胞核为约20μm。一些muse细胞具有非常大的细胞体，长度可达110μm。muse细胞有许多向周围细胞延伸的突起，而非muse细胞则没有。分裂的ssea3 细胞具有10μm的更小的圆形细胞体，而细胞核为～7μm。
128.在聚hema包被的培养皿中培养的macs分选的ssea3 细胞在铺板后第2天显示出小的ssea3 细胞簇。七日后，形成了许多大的细胞簇。将这些簇分离并在非聚hema包被的孔中培养8小时。细胞簇附着在板上并针对ssea3染色。两项研究提出将triton添加到封闭液中以对muse细胞进行免疫组织学染色，但数据显示在0.3％triton处理的细胞样本中没有ssea3信号(tian，t.等人cellular reprogramming，2017.19(2)：p.116-122)。triton是一
种可渗透脂质膜的去污剂，并证实ssea3在细胞表面表达。
129.分选的muse细胞在神经前体细胞培养基中培养：2％b-27补充剂(50
×
，thermo fisher scientific 17504-044)、glutmax(gibco 35050-061，终浓度：2mm)、bfgf(peprotech 100-18b，最终：30ng/ml)、egf(peprotech af-100-15，最终：30ng/ml)、1％青霉素-链霉素(thermo fisher scientific 15140122)和neurobasal培养基(gibco 21103049)。需要7天时间诱导分化为形成特定球体的神经前体细胞。巢蛋白、neun、gfap和nf-155均为阳性，说明诱导成功，并且神经前体细胞具有多能性。
130.由于大鼠是ssea3抗体的宿主物种，因此无法在大鼠中确定移植细胞的ssea3表达。然而，这项先导实验表明，移植的人muse细胞在移植后前四个星期内显然没有被免疫排斥，因为移植的细胞表达人细胞质和细胞核的抗原。其他研究表明，人muse细胞在移植后存活下来并且在小鼠体内不会被免疫排斥。例如，在小鼠脑内出血模型中，移植的人muse在第69天显示neun(～57％)和map-2(～41.6％)阳性(shimamura，n.等人experimental brain research，2017.235(2)：p565-572.)。然而，一旦muse细胞分化成其他细胞类型，它们在没有免疫抑制的情况下可能无法存活。
131.muse细胞具有免疫调节作用(gimeno等人，stem cell trans.medicine，2017.6(1)：第161-173页)。在大鼠心肌梗死模型的msc研究(huang等人，circulation.2010.122(23)：第2419-2429页.)中观察到了类似的现象，在所述模型中，mhc谱发生了变化，并且与分化为心肌细胞相关的同种msc的免疫调节功能丧失。muse细胞的子代细胞的较长存活期可能需要免疫抑制剂。迁移似乎由s1p-s1pr2引导，s1p-s1pr2介导muse细胞归巢到受损心脏中，以便在急性心肌梗塞后进行持久的组织修复和功能恢复(yamada等人，circ.res.2018，122(8)：第1069-1083页)。
132.从huc生长的ssea3 和cd105 细胞在移植到受伤的大鼠脊髓后在没有免疫抑制的情况下存活和迁移的这一发现，与shimamura的发现一致，即人muse细胞在中风后移植到大鼠的脑中时可以长期存活。huc ssea3/cd105细胞通过抗人细胞核蛋白的抗体stem(takara，日本)鉴定。该抗体不识别小鼠、大鼠或非人灵长类动物细胞。ssea3 /cd105 细胞在没有免疫抑制的情况下在受伤大鼠脊髓中的存活率与表达hla-g的人muse细胞的免疫耐受性一致。
133.本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征均可以被用于相同、等同或类似目的的替代特征替换。因此，除非另有明确说明，所公开的各个特征仅是一系列上位的等同或相似特征的实例。由以上描述，本领域技术人员可以很容易地确定本发明的必需特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变化和修改以适应各种用途和条件。因此，其他实施方案也在所附权利要求的范围内。
134.135.[0136][0137]
表iv：前三代的wj和cl细胞倍增时间(小时)
[0138]