靶向PPARγ的甘草次酸类衍生物及其制备方法和用途与流程

靶向ppar
γ
的甘草次酸类衍生物及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明涉及含甘草次酸骨架的pparγ激动剂，具体涉及靶向pparγ的甘草次酸类衍生物及其制备方法和用途。


背景技术：

2.甘草次酸(glycyrrhetinic acid，ga)是一种从传统中草药甘草的根茎提取出来的五环三萜类化合物，主要以18-β-甘草次酸为主。通过不断的研究发现甘草次酸及其衍生物具有抗炎、抗溃疡、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏、降血脂、促进胰岛素吸收等多方面的作用。但是甘草次酸本身对肿瘤的抑制作用非常微弱。
3.授权公告号为cn108558986b的申请专利公开了含哌嗪结构的甘草次酸类衍生物及其制备方法与用途，其通过将哌嗪环引入甘草次酸的c3位，可以增强甘草次酸的各类生物活性。同时其发明甘草次酸衍生物的苯基哌嗪取代基能够有效地和pparγ的h12螺旋形成的活性口袋约束腔结合，起到类似于“船锚”的作用，把分子锚定在pparγ上；甘草次酸的主体骨架则位于约束腔的开口附近，可以形成强有力的氢键来增强小分子与pparγ结合的稳定性；甘草次酸30位羧基被甲酯取代后能够延伸到pparγ的h12螺旋约束腔的后侧，进一步增强与pparγ的亲和性，起到良好的抗肿瘤作用。
4.公开号为cn110551169a的申请专利公开了甘草次酸类衍生物及其制备方法和用途，通过乙酯结构将甘草次酸的c3位与5
’‑
羟基黄酮结构的5
’‑
羟基相连接，可以增强甘草次酸的各类生物活性。其发明的含黄酮结构的甘草次酸衍生物对癌细胞具有明显的抑制作用，并适合工业化生产。
5.近年来从天然植物中寻找具有抗肿瘤作用的生物活性物质来预防和治疗癌症已成为国内外研究的热点。甘草次酸及其衍生物可以靶向过氧化物酶体增殖物激活受体γ(pparγ)，这一发现打开了对抗与不良预后相关癌症的新途径，即显示出对促细胞凋亡刺激的各种水平的抗性癌症。然而针对pparγ靶标对甘草次酸及其衍生物进行的结构改造，虽然都表现出了一定的活性，但是仍有不足之处。作用机制不明确，衍生物的毒性也没有得到进一步的改善。特别重要的是由于数量及结构的有限性，缺乏系统的构效关系研究。究其主要原因是pparγ结构复杂，没有从pparγ结构出发确定肿瘤标志物的部位特异性，从而无法精确设计分子。因此，以pparγ结构明确部位为靶点，阐明pparγ与小分子抑制剂的结合模式，提高特异性的彼此识别，设计合成高效的甘草次酸衍生物是我们研究的关键性探索方向。


技术实现要素：

6.本发明的目的是将甘草次酸类化合物的分子结构与计算模拟及活性结果数据相结合，借助计算软件，设计新型靶向pparγ的激动剂，对癌细胞具有明显的抑制作用；本发明同时提供了含肉桂酸结构的甘草次酸衍生物的制备方法，并且提供的方法科学合理、简单易行，反应步骤少，产率高，适合工业化生产。
7.pparγ激动剂不仅仅在ⅱ型糖尿病等传统代谢疾病方面具有显著疗效，在肿瘤细胞抑制和癌症疾病方面的治疗中也具有重要作用。当配体激活pparγ蛋白后，可以抑制肝、胰腺、胆道、口腔、肺、宫颈、乳腺、卵巢、食道、胃和结肠、直肠等部位肿瘤细胞的生长。
8.本发明的技术方案如下：
9.本发明所述的含肉桂酸结构的甘草次酸衍生物，其设计思路是：从protein data bank(rscb pdb)网站获得pparγ晶体结构，选取代表性pparγ激动剂，利用discovery studio 4.5软件进行分类和校正，建立训练集数据库。并将这些小分子激动剂用schrodinger'canvas分解片段，分析计算3d药效团指纹、表面极化面积比、扭转能和电子势能等各种参数，筛选出活性骨架。进而将活性骨架与pparγ蛋白晶体复合物中的活性位点进行模拟对接，最后构建3d-qsar模型进行分子模拟计算打分，结合生物电子等排体理论、类同合成法及天然生物甘草次酸等先导设计方法，最终筛选出潜在的基于pparγ的激动剂，即一种靶向pparγ的甘草次酸类衍生物，其结构式如式i所示：
[0010][0011]
其中，r是h原子或者r为h原子被单取代、双取代、三取代、四取代或五取代，且r选自卤素、甲基、甲氧基、硝基、卤素取代的甲基和卤素取代的甲氧基。其中卤素取代的甲基和卤素取代的甲氧基包括1、2、3卤素取代，其中卤素为氯、溴、氟或碘。
[0012]
优选的，r为单取代、双取代或三取代。
[0013]
具体的，所述结构式中r为2-甲基、3-甲基、4-甲基、2-硝基、3-硝基、4-硝基、2-氟、3-氟、4-氟、2-氯、3-氯、4-氯、2-溴、3-溴、4-溴、2,3-二甲氧基、2,4-二甲氧基、2,5-二甲氧基、2,6-二甲氧基、3,4-二甲氧基、3,5-二甲氧基、3,6-二甲氧基、2,3-二氯、2,4-二氯、2,5-二氯、2,6-二氯、3,4-二氯、3,5-二氯、3,6-二氯、2,3-二溴、2,4-二溴、2,5-二溴、2,6-二溴、3,4-二溴、3,5-二溴、3,6-二溴、2,3-二氟、2,4-二氟、2,5-二氟、2,6-二氟、3,4-二氟、3,5-二氟、3,6-二氟、2,3-二甲基、2,4-二甲基、2,5-二甲基、2,6-二甲基、3,4-二甲基、3,5-二甲基、3,6-二甲基、2,3-二硝基、2,4-二硝基、2,5-二硝基、2,6-二硝基、3,4-二硝基、3,5-二硝基、3,6-二硝基、2,3,4-三氯、2,3,4-三氟、2,3,4-三溴、2,3,4-三甲基、2,3,4-三硝基、2,3,4-三甲氧基、2-三氟甲基、4-三氟甲基或3-三氟甲基。
[0014]
优选的，所述结构式中r为2-甲基、3-甲基、4-甲基、2-硝基、3-硝基、4-硝基、2-氟、3-氟、4-氟、2-氯、3-氯、4-氯、2-溴、3-溴、4-溴、2,3,4-三甲氧基、2,6-二氯、4-三氟甲基或3-三氟甲基。
[0015]
本发明甘草次酸衍生物是pparγ的激动剂，如图1所示，甘草次酸11位上的o(图1中虚线圆圈圈出)与pparγ蛋白上的重要氨基酸tyr473形成一个氢键，3位新引入的羰基o(图1中虚线方框圈出部分右侧的羰基o)与his449形成了一个关键氢键(图1为平面图，实际立体图中his449与3位新引入的羰基o位置靠近)。更重要的是3位长链末端含不同取代基的
肉桂酸骨架与涉及pparγ激动活性的关键氨基酸残基lys457形成共价键，从而不可逆地抑制酶活性，由此可以克服耐药性问题。
[0016]
本发明还提供了一种药物，含有上述的甘草次酸类衍生物。
[0017]
本发明含有肉桂酸结构的甘草次酸衍生物对癌细胞具有明显的抑制作用，因此本发明的含有肉桂酸结构的甘草次酸衍生物可以用于制备抗癌(如肝癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌)药物。药物还含有药学上可添加的辅料，制成相适应的剂型。
[0018]
本发明还提供了上述的甘草次酸类衍生物在制备用于治疗pparγ蛋白表达被抑制或活性降低所引起的疾病的药物中的应用。
[0019]
具体的，所述疾病为ⅱ型糖尿病，或者肝、胰腺、胆道、口腔、肺、宫颈、乳腺、卵巢、食道、胃、结肠或直肠部位的肿瘤。
[0020]
本发明又提供了上述甘草次酸类衍生物的制备方法，包括如下步骤：
[0021]
(1)将甘草次酸溶于溶剂中，加入浓硫酸或浓盐酸进行反应，制得产物a；
[0022]
(2)将产物a分溶于溶剂中，加入溴乙酰溴进行反应，制得产物b；
[0023]
(3)产物b和不同取代基的肉桂酸溶于有机溶剂中，加入催化剂进行反应，制得所述的甘草次酸衍生物；
[0024]
其中，步骤(1)中，溶剂为醇类溶剂；步骤(2)中，溶剂为二氯甲烷；步骤(3)中，有机溶剂为乙腈或乙醇，不同取代基的肉桂酸中，取代基为所述r基团。
[0025]
优选的，所述产物a与与溴乙酰溴的摩尔比为1:1-2。
[0026]
优选的，步骤(3)中，所述催化剂为碳酸钾或三乙胺。
[0027]
优选的，所述产物b与不同取代基的肉桂酸的摩尔比为1:1-1.5。
[0028]
有益效果：
[0029]
本发明含有肉桂酸结构的甘草次酸衍生物对癌细胞具有明显的抑制作用，且所用原料便宜，简单易得，反应步骤少，适合工业化生产，是一类具有巨大潜力的药品。
附图说明
[0030]
图1为甘草次酸衍生物作用位点图。
[0031]
图2为化合物1的结构式；其中，a代表产物a的结构式；b代表产物b的结构式；c代表化合物1的结构式。
[0032]
图3为化合物2的结构式。
[0033]
图4为化合物3的结构式。
[0034]
图5为化合物4的结构式。
[0035]
图6为化合物5的结构式。
[0036]
图7为化合物6的结构式。
[0037]
图8为化合物7的结构式。
[0038]
图9为化合物8的结构式。
[0039]
图10为化合物9的结构式。
[0040]
图11为化合物10的结构式。
[0041]
图12为化合物11的结构式。
[0042]
图13为化合物12的结构式。
[0043]
图14为化合物13的结构式。
[0044]
图15为化合物14的结构式。
[0045]
图16为化合物15的结构式。
[0046]
图17为化合物16的结构式。
[0047]
图18为化合物17的结构式。
[0048]
图19为化合物18的结构式。
[0049]
图20为化合物19的结构式。
[0050]
图21为化合物20的结构式。
具体实施方式
[0051]
本发明的含肉桂酸结构的甘草次酸衍生物，其设计思路是：从protein data bank(rscb pdb)网站获得pparγ晶体结构，选取代表性pparγ激动剂，利用discovery studio 4.5软件进行分类和校正，建立训练集数据库。并将这些小分子激动剂用schrodinger'canvas分解片段，分析计算3d药效团指纹、表面极化面积比、扭转能和电子势能等各种参数，筛选出活性骨架。进而将活性骨架与pparγ蛋白晶体复合物中的活性位点进行模拟对接，最后构建3d-qsar模型进行分子模拟计算打分，结合生物电子等排体理论、类同合成法及天然生物甘草次酸等先导设计方法，最终筛选出潜在的基于pparγ的激动剂，其作用位点如图1所示。
[0052]
实施例1
[0053]
化合物1的制备。
[0054]
(1)将3g甘草次酸溶于100ml甲醇中，然后添加1ml浓硫酸，回流反应8小时(反应温度为75℃)后将反应液减压蒸干，使用乙酸乙酯与水萃取(两者体积比为2:1)，收集有机层，无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干，得到粗产物用乙醇重结晶得到纯的产物a。产物a为白色粉末，结构式如图2-a所示；1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ5.67(s,1h)，3.70(s,3h)，3.23(m,1h)，2.80(dt,j＝13.6,4.5hz,1h)，2.37(s,1h)，1.37(s,3h)，1.15(s,3h)，1.14(s,3h)，1.13(s,3h)，1.01(s,3h)，0.81(s,6h)。
[0055]
(2)将产物a(加入量为1mmol)溶于二氯甲烷(加入量为20ml)中，然后加入溴乙酰溴(加入量为1.2mmol)，冰浴反应1.5个小时，反应完成后将反应液减压蒸干，用乙酸乙酯与nahco3饱和水溶液(两者体积比为2:1)萃取，收集有机层，无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干，得到粗产物用丙酮重结晶得到纯的产物b。产物b为白色粉末，其熔点为227.9-229.9℃，结构式如图2-b所示；1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ5.70(s,1h)，5.60(s,1h)，4.61-4.58(m,2h)，3.71(s,6h)，2.86(d,j＝32.68hz,1h)，2.38(s,1h)，2.30(s,1h)，2.03-2.00(m,3h)，1.95(d,j＝4.2hz,4h)，1.68(s,1h)，1.63-1.59(m,4h)，1.39(s,4h)，1.36(s,2h)，1.25(d,j＝1.56hz,4h)，0.94(s,10h)，0.83(d,j＝6.44hz,4h)，0.73(s,2h)。
[0056]
(3)将1mmol产物b和1mmol的对甲基肉桂酸溶于乙腈中，然后加入1.5mmol的碳酸钾，回流反应6个小时(反应温度为82℃)，反应完成后过滤除去碳酸钾，然后将反应液减压蒸干，得到的粗产物用丙酮重结晶得到化合物1，其化学结构式如图2-c所示，产品熔点为157.4-160.1℃。1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.79(s,1h)，7.75(s,1h)，7.47(s,1h)，7.45(s,2h)，7.23(s,2h)，7.21(s,1h)，6.51(s,1h)，6.47(s,1h)，5.68(s,1h)，4.76(d,j＝1.84hz,
2h)，3.71(d,j＝3.12hz,6h)，2.40(s,4h)，1.63(s,1h)，1.38(s,3h)，1.16(d,j＝1.24hz,8h)，1.13(s,4h)，0.92(s,6h)，0.87(d,j＝6.8hz,6h)，0.81(s,6h)，0.72(s,1h)。
[0057]
实施例2
[0058]
化合物2的制备。
[0059]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以间甲基肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物2，其结构式如图3所示。其熔点为208.5-213.1℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.78(s,1h)，7.74(s,1h)，7.35(d,j＝6.04hz,3h)，7.23(s,1h)，6.55(s,1h)，6.50(s,1h)，5.67(s,1h)，4.74(d,j＝2.52hz,3h)，4.65(t,j＝6.88hz,1h)，3.69(d,j＝3.2hz,4h)，2.85(d,j＝3.68hz,1h)，2.82(t,j＝6.76hz,1h)，2.38(s,1h)，1.37(s,1h)，1.16(d,j＝1.68hz,8h)，1.13(s,1h)，0.91(s,1h)，0.87(s,1h)，0.80(d,j＝4.88hz,6h)，0.71(s,1h)。
[0060]
实施例3
[0061]
化合物3的制备。
[0062]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以对氯肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物3，其结构式如图4所示。其熔点为155.3-157.9℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.75(s,1h)，7.72(s,1h)，7.49(s,1h)，7.47(s,1h)，7.39(s,1h)，7.37(s,1h)，6.53(s,1h)，6.49(s,1h)，5.68(s,1h)，4.75(d,j＝0.88hz,3h)，3.70(d,j＝3.32hz,4h)，2.37(s,1h)，1.38(s,1h)，1.23(d,j＝3.28hz,3h)，1.16(d,j＝2.08hz,8h)，1.13(s,4h)，0.92(s,6h)，0.87(t,j＝9.68hz,6h)，0.81(t，j＝11.56hz,6h)，0.72(s,1h)。
[0063]
实施例4
[0064]
化合物4的制备。
[0065]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以对氟肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物4，其结构式如图5所示。其熔点为159.3-163.9℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.75(d,j＝16.04hz,1h)，7.56-7.53(m,2h)，7.12-7.08(m,2h)，6.46(d,j＝16.04hz,1h)，5.68(s,1h)，4.75(d,j＝0.96hz,2h)，4.67(d,j＝2.72hz,1h)，3.70(d,j＝3.24hz,4h)，2.37(s,1h)，1.72-1.59(m,7h)，1.44(s,1h)，1.37(s,4h)，1.31(s,1h)，1.23(d,j＝3.2hz,2h)，1.15(dd,j＝2.08,3.16hz,10h)，0.92-0.80(m,14h)，0.72(s,1h)。
[0066]
实施例5
[0067]
化合物5的制备。
[0068]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以邻氯肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物5，其化学式如图6所示。其熔点为167.5-169.5℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.65(dd,j＝1.76,1.76hz,1h)，7.30(dd,j＝1.92,7.32hz,2h)，6.53(d,j＝16hz,1h)，5.67(s,1h)，4.77(s,2h)，3.70(s,4h)，2.84(d,j＝13.68hz,1h)，2.37(s,1h)，2.11-1.91(m,5h)，1.73-1.58(m,6h)，1.35(dd,j＝8.84,1.92hz,4h)，1.15(t,j＝14.52hz,11h)，0.92-0.81(m,13h)，0.72(s,1h)。
[0069]
实施例6
[0070]
化合物6的制备。
[0071]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以邻甲基肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物6，其结构式如图7所示。熔点：184.2-188.3℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.58(d,j＝7.76hz,1h)，7.22(d,j＝7.6hz,2h)，6.46(d,j＝15.88hz,1h)，5.68(s,1h)，4.75(d,j＝2.32hz,
2h)，3.70(d,j＝3.28hz,4h)，2.84(d,j＝13.68hz,1h)，2.45(s,4h)，2.37(s,1h)，2.07-1.95(m,4h)，1.71-1.59(m,6h)，1.37(d,j＝8.88hz,5h)，1.18-1.13(m,11h)，0.92-0.81(m,14h)，0.72(s,1h)。
[0072]
实施例7
[0073]
化合物7的制备。
[0074]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以3,4,5-三甲氧基肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物8，其化学式如图7所示。其熔点为190.2-192.1℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.70(d,j＝15.88hz,1h)，6.78(s,2h)，645(d,j＝15.92hz,1h)，5.67(s,1h)，4.75(d,j＝2.04hz,2h)，3.89(t,j＝4.76hz,12h)，3.69(s,4h)，2.36(s,1h)，2.18(s,2h)，2.04-1.99(m,2h)，1.71-1.68(m,6h)，1.37(s,4h)，1.15(dd,j＝2.8,3.0hz,10h)，0.91-0.81(m,13h)，0.72(s,1h)。
[0075]
实施例8
[0076]
化合物8的制备。
[0077]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以对溴肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物8，其结构式如图9所示。其熔点为193.0-196.3℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.72(d,j＝16.04hz,1h)，7.54(d,j＝8.44hz,2h)，7.41(d,j＝8.52hz,2h)，6.53(d,j＝16hz,1h)，5.68(s,1h)，4.75(s,2h)，3.70(d,j＝3.16hz,4h)，2.84(d,j＝13.72hz,1h)，2.37(s,1h)，2.19(s,1h)，2.04-1.99(m,2h)，1.71-1.58(m,6h)，1.37(d,j＝8.84hz,4h)，1.15(dd,j＝1.56,3.04hz,10h)，0.91-0.81(m,13h)，0.73(s,1h)，0.08(d,j＝3.48hz,2h)。
[0078]
实施例9
[0079]
化合物9的制备。
[0080]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以邻氟肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物9，其结构式如图10所示。其熔点为185.1-187.0℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.95(s,1h)，7.91(s,1h)，7.58(t,j＝8.00hz,1h)，7.41-7.39(m,1h)，7.71(d,j＝8.36hz,2h)，6.67(s,1h)，6.64(s,1h)，6.64(s,1h)，5.69(s,1h)，4.77(s,3h)，4.67-4.64(m,2h)，3.70(s,6h)，2.85(d,j＝13.72hz,1h)，2.38(s,2h)，1.61(s,2h)，1.41-1.36(m,4h)，1.14(s,4h)，0.93(s,4h)，0.89(s,4h)，0.82(s,4h)，0.82(d,j＝7.64hz,4h)。
[0081]
实施例10
[0082]
化合物10的制备。
[0083]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以间氟肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物10，其结构式如图11所示。其熔点为186.6-191.2℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.77(s,1h)，7.73(s,1h)，7.39-7.37(m,1h)，7.33(d,j＝5.4hz,2h)，7.12(d,j＝1.6hz,1h)，6.56(s,1h)，6.52(s,1h)，5.69(s,1h)，4.76(s,3h)，4.67-4.62(m,2h)，3.71(s,6h)，2.85(d,j＝13.72hz,1h)，2.38(s,1h)，1.63(s,3h)，1.38-1.33(m,4h)，1.17(d,j＝2.8hz,10h)，1.14(s,4h)，0.93(s,4h)，0.89(s,4h)，0.82(d,j＝7.28hz,4h)。
[0084]
实施例11
[0085]
化合物11的制备。
[0086]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以2,6-二氯肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物11，其结构式如图12所示。其熔点为218.3-221.3℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.93(s,
1h)，7.88(s,1h)，7.40(s,1h)，7.38(s,1h)，7.22(t,d＝16.12hz,2h)，6.74(s,1h)，6.69(s,1h)，5.69(s,1h)，4.83-4.74(m,3h)，4.66-4.64(m,2h)，3.72(s,6h)，2.85(d,j＝13.72hz,1h)，2.39(s,1h)，1.63-1.61(m,2h)，1.39(s,4h)，1.18(d,j＝3.6hz,10h)，1.14(s,4h)，0.93(s,4h)，0.89(s,4h)，0.82(d,j＝6.76hz,2h)。
[0087]
实施例12
[0088]
化合物12的制备。
[0089]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以对硝基肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物12，其结构式如图13所示。其熔点为218.4-222.8℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ8.29(d,j＝8.76hz,2h)，7.84(s,1h)，7.81(s,1h)，7.71(d,j＝8.76hz,2h)，6.69(s,1h)，6.65(s,1h)，5.70(s,2h)，4,79(s,3h)，4.69-4.65(m,2h)，3.71(s,6h)，2.85(d,j＝13.76hz,1h)，2.38(s,1h)，1.63-1,56(m,2h)，1.38(s,4h)，1.17(d,j＝3.64hz,10h)，1.14(s,4h)，0.93(s,4h)，0.89(s,4h)，0.82(d＝8.32hz,4h)。
[0090]
实施例13
[0091]
化合物13的制备。
[0092]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以邻硝基肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物13，其结构式如图14所示。1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ8.29(s,1h)，8.23(s,1h)，8.09(d,j＝7.88hz,2h)，7.69-7.67(m,2h)，6.49(s,1h)，6.45(s,1h)，5.69(s,1h)，4.79(s,3h)，4.68-4.64(m,2h)，3.71(s,6h)，2.85(d,j＝13.72hz,1h)，2.38(s,2h)，1.63(s,2h)，1.39(s,4h)，1.17(d,j＝4.48hz,10h)，1.14(s,4h)，0.93(s,4h)，0.89(s,4h)，0.83(d,j＝7.76hz,4h)。
[0093]
实施例14
[0094]
化合物14的制备。
[0095]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以4-三氟甲基肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物14，其结构式如图15所示。其熔点为192.4-194.6℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.83(s,1h)，7.79(s,1h)，7.68(d,j＝9.20hz,5h)，6.65(s,1h)，6.60(s,1h)，5.69(s,1h)，4.78(s,3h)，4.69-4.65(m,2h)，3.72(s,4h)，2.38(d,j＝13.76hz,1h)，1.59(s,1h)，1.38(s,3h)，1.18(d,j＝3.2hz,10h)，1.14(s,4h)，0.94(s,4h)，0.89(s,4h)，0.82(d,j＝7.96hz,4h)。
[0096]
实施例15
[0097]
化合物15的制备。
[0098]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以间溴肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物15，其结构式如图16所示。其熔点为186.1-188.5℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.73(s,1h)，7.70(d,j＝1.68hz,1h)，7.54(d,j＝0.88hz,1h)，7.48(d,j＝7.80hz,1h)，6.55(s,1h)，6.52(s,1h)，5.68(s,1h)，4.76(s,3h)，4.68-4.64(m,2h)，3.70(s,6h)，2.85(d,j＝13.68hz,1h)，2.38(s,2h)，2.06(s,1h)，1.64(s,2h)，1.38(s,4h)，1.17(d,j＝2.56hz,10h)，1.14(s,4h)，0.92(s,4h)，0.88(s,4h)，0.82(d,j＝7.08hz,4h)。
[0099]
实施例16
[0100]
化合物16的制备。
[0101]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以对甲氧基肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物16，其结构式如图17所示。其熔点为132.0-134.4℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.78(s,1h)，7.74(s,1h)，7.52(d,j＝8.76hz,2h)，6.93(d,j＝5.36hz,2h)，6.43(s,1h)，6.40(s,
1h)，5.69(s,1h)，5.59(s,1h)，4.75(s,3h)，4.67-4.63(m,2h)，3.87(s,4h)，3.71(s,6h)，2.74(d,j＝13.56hz,1h)，2.38(s,1h)，2.29(s,1h)，1.68(s,2h)，1.37(s,4h)，1.24(d,j＝3.60hz,10h)，1.16(s,4h)，0.93(s,4h)，0.88(s,4h)，0.83(d,j＝4.64hz,4h)，0.73(s,1h)。
[0102]
实施例17
[0103]
化合物17的制备。
[0104]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以间氯肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物17，其化学式如图18所示。其熔点为197.5-201.7℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.75(s,1h)，7.70(s,1h)，7.54(s,2h)，7.42(s,1h)，7.38(s,1h)，6.58(s,1h)，6.52(s,1h)，5.69(s,1h)，4.76(s,3h)，4.68-4.64(m,2h)，4.15(s,1h)，3.72(s,6h)，3.51(s,1h)，2.85(d,j＝13.68hz,1h)，2.38(s,2h)，2.06(s,2h)，1.62-1.59(m,2h)，1.38(s,4h)，1.17(d,j＝2.72hz,10h)，1.14(s,4h)，0.93(s,4h)，0.88(s,4h)，0.82(d,j＝7.36hz,4h)。
[0105]
实施例18
[0106]
化合物18的制备。
[0107]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物18，其化学结构式如图19所示。其熔点为195.1-196.8℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.82(s,1h)，7.78(s,1h)，7357-7.55(m,2h)，7.42(t,j＝6.40hz,3h)，6.57(s,1h)，6.53(s,1h)，5.68(s,2h)，4.76(s,3h)，4.68-4.64(m,2h)，3.70(s,6h)，2.84(d,j＝13.72hz,1h)，2.38(s,1h)，2.06(s,2h)，1.62(s,2h)，1.38(s,4h)，1.17(d,j＝2.40hz,10h)，1.14(s,4h)，0.93(s,4h)，0.88(s,4h)，0.82(d,j＝7.76hz,4h)，0.72(s,1h)。
[0108]
实施例19
[0109]
化合物19的制备。
[0110]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以间硝基肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物19，其结构式如图20所示。其熔点为262.6-266.5℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ8.41(d,j＝18.68hz,2h)，8.27(s,1h)，7.87(d,j＝7.96hz,2h)，6.69(s,1h)，6.65(s,1h)，5.69(s,1h)，4.78(s,3h)，4.68-4.65(m,2h)，4.14(s,1h)，3.70(s,6h)，2.85(d,j＝13.74hz,1h)，2.38(s,1h)，2.06(s,1h)，1.63(s,2h)，1.37(s,4h)，1.17(d,j＝3.32hz,10h)，1.14(s,4h)，0.92(s,4h)，0.88(s,4h)，0.81(d,j＝3.92hz,4h)。
[0111]
实施例20
[0112]
化合物20的制备。
[0113]
制备方法同实施例1，在步骤(3)中，以3-三氟甲基肉桂酸代替对甲基肉桂酸，得化合物20，其结构式如图21所示。其熔点为197.8-199.6℃，1h nmr(400mhz,cdcl3)：δ7.83(s,1h)，7.80(d,j＝3.60hz,2h)，7.74(d,j＝7.84hz,2h)，7.67(d,j＝7.80hz,2h)，7.56(t,j＝15.52hz,2h)，6.64(s,1h)，6.60(s,1h)，5.69(s,1h)，4.78(s,3h)，4.67-4.65(m,2h)，3.71(s,6h)，3.50(s,1h)，2.85(d,j＝13.72hz,1h)，2.38(s,1h)，2.06(s,1h)，1.67(s,2h)，1.38(s,4h)，1.17(d,j＝3.20hz,10h)，1.14(s,4h)，0.93(s,4h)，0.88(s,4h)，0.82(d,j＝4.08hz,4h)，0.73(s,1h)。
[0114]
实施例21
[0115]
实施例1-20含肉桂酸结构的甘草次酸衍生物抗癌活性的检测研究。
[0116]
(1)实验材料
[0117]
细胞株
[0118]
人肝癌细胞株hepg2；人乳腺癌细胞株mcf-7；人宫颈癌细胞株hela；人肺癌细胞株a549。
[0119]
(2)试剂
[0120]
dmem培养基(gibco)，新生牛血清(杭州四季青生物工程材料)，胰蛋白酶(sigma)，10000单位的双抗(gibco usa)，pbs缓冲液(上海源培生物科技股份有限公司)。其它常用化学试剂均为国产分析纯。
[0121]
(3)实验方法
[0122]
1)培养基的配制
[0123]
90ml dmem培养基(gibcio usa)培养基加灭活新生牛血清(杭州四季青生物工程材料)10ml以及1ml10000单位的双抗(gibco usa)即为完全培养液，做好标记，于4℃保存备用。胰蛋白酶用pbs缓冲液配成0.25％溶液，过滤除菌后4℃保存备用。
[0124]
2)药液的配制
[0125]
准确称取被测样品1.0mg。加到灭菌的1.5ml离心管中，加入dmso 1ml，配成1mg/ml原液，-40℃冷冻保存。临用前融化后用适量pbs冲液稀释成相应浓度应用。
[0126]
3)细胞培养及传代
[0127]
细胞菌贴壁培养于含10ml完全培养液细胞培养瓶中，于37℃、5％co2、饱和湿度下培养。细胞长满瓶底后用灭菌的pbs缓冲液洗两次，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞1min，倒掉胰蛋白酶，待轻摇细胞能完全脱落后，加完全培养液30ml后，用移液管吹散细胞，分装于3个新的细胞培养瓶中，继续培养。
[0128]
4)抗癌活性测试
[0129]
取刚刚长成完整单层的细胞一瓶，胰蛋白酶消化后收集细胞，用移液管吹打均匀，取两滴细胞悬液锥虫蓝(trypan blue)染色，与显微镜下计数活细胞数目至1
×
104个细胞/ml。向96孔培养板中每孔加入90μl细胞悬液，将培养板置于co2培养箱中培养24h，取出培养板后于每孔中加10μl含不同浓度被测样品的溶液，使得药物终浓度分别为50，25，12.5，6.25，3.125μm，每个浓度设3个平行孔，另设6孔细胞作正常对照孔和阳性对照孔。加完药后培养板于微孔板振荡器上振荡混匀，置于co2培养箱中继续培养24h。取出培养板，每孔加入10μl 5mg/ml的mtt液，振荡混匀，继续培养4h。加入每孔150μl dmso后震荡15min。酶标仪测定各孔光吸收(od值)，测定波长490nm。根据各孔od值计算药物对四株肿瘤细胞增殖的抑制率，即ic
50
值，实验结果见表1。
[0130]
表1
[0131][0132][0133]
表1显示，实施例1-20所制的甘草次酸衍生物对四株细胞增殖的抑制均具有显著作用，具有广阔的抗癌应用前景。