一种幽门螺旋杆菌感染和分型检测的引物、探针和试剂盒的制作方法

1.本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种幽门螺旋杆菌感染和分型检测的引物、探针和试剂盒。


背景技术：

2.幽门螺杆菌(helicobacter pylori，hp)是一种螺旋形、微厌氧的革兰氏阴性杆菌，该细菌生存能力极强，能够在胃中强酸性环境中生存。流行病学研究显示，幽门螺杆菌(hp)感染率非常高，全球大约50％的人被感染。发病率的高低与社会经济水平，人口密集程度，公共卫生条件以及水源供应等因素有关。研究显示，hp感染多发生于儿童时期，儿童感染菌株的基因型不受环境迁移而改变，常与父母感染的hp基因型一致。此外，hp感染也是成年人中最广泛的慢性细菌感染，且感染率随年龄增加而上升。中国人群hp感染率调查表明：21个省52个地区，累计检测人数25209，hp感染率从34.52％～80.55％，多数地区人群感染率在50％左右，平均感染率为58.07％，胃癌高发区人群hp感染率总体水平高于低发区人群，感染年龄早于发达国家20年左右，20岁～40岁感染率为45.4％～63.6％，70岁以上高达78.9％。
3.研究表明，hp可以诱发慢性萎缩性炎症，进而胃泌素分泌增加，环氧化酶-2(cox-2)和前列腺素(pge)表达量上升，引起胃粘膜细胞形态和功能改变，导致慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌及胃粘膜相关淋巴瘤(malt)等胃肠道疾病的发生，也使患胃癌的风险增加。hp已被国际癌症组织确认为胃溃疡、慢性胃炎和胃癌等胃部疾病最主要的致病因子，引起腹胀、腹痛、嗳气、反酸、恶心、口臭等症状，hp感染明显增加了发生十二指肠和胃溃疡的危险性，70％～80％的胃溃疡和90％以上的十二指肠溃疡是由幽门螺杆菌引起的。hp感染还使患胃癌的危险增加了2.7～12倍，有5％的b型萎缩性胃炎病人可发展为胃癌。随着研究的深入，人们发现hp感染在非消化道疾病，如缺铁性贫血、特发性血小板减少性紫癜、肝胆管疾病、心血管病、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病等的发生发展中也同样发挥重要作用。1994年，世界卫生组织和国际癌症研究署把幽门螺杆菌确定为一类致癌物。hp感染是目前预防胃癌最重要的可控的危险因素，根除hp应成为胃癌的一级预防措施。因此，对hp感染的检测和治疗显得尤为重要。
4.hp是人胃内唯一能够产生大量尿毒酶的细菌，故可通过检测产生尿毒酶的基因urea基因来诊断hp感染。进一步地，hp感染根据其分泌的毒素可以分为两类：ⅰ型和ⅱ型。hp毒素主要包括空泡毒素(vaca)和细胞毒素(caga)。vaca可引起作用的靶细胞发生空泡化、细胞凋亡、细胞骨架重排、甚至细胞死亡等形态学改变，是hp重要的毒力因子；caga常与空泡毒素同时存在，可能与它的转录、折叠运转及功能有关，caga是导致宿主出现严重的炎症反应的关键。ⅰ型：产细胞毒素的hp菌株，有较强的毒性。这类菌株感染能使胃上皮细胞出现空泡、变形和损害，引起溃疡和诱发癌变，其检出率约占总hp感染的50-60％。ⅰ型感染者中的胃癌和溃疡患病率显著高于ⅱ型hp感染者，ⅰ型感染人群有必要进行根除治疗，需要用药。ⅱ型：不产生细胞毒素的hp菌株，毒力低，感染后一般只引起慢性浅表性胃炎而无临床
症状。ⅱ型不含caga 基因，两种毒力蛋白均不表达，即cag a(-)和vac a(-)。对于ⅱ型hp，因为其毒性很低，可根据不同情况自主选择是否需要用药。对于无临床症状的患者可以不使用药物治疗，随访观察、饮食调理等均可。
5.综上所述，通过检测urea基因可判断是否有hp感染，通过检测caga基因可对hp基因进行分型，可进一步确定患者是否需要进行抗菌治疗，为临床开展选择性根除治疗提供重要的实验诊断依据。hp分型也让一大部分感染者免除不必要的治疗，避免抗生素过度使用，减少细菌耐药性的产生。因此，同时检测hp感染与分型具有重大的临床意义。
6.目前幽门螺旋杆菌感染检测方法颇多，主要有免疫学、细菌学、病理学、血清学、同位素示踪、分子生物学等；而这些方法又包括有创和无创，有创是指通过胃镜取得胃黏膜标本进行组织检查，主要有细菌的分离培养和直接涂片、快速尿素酶试验、实时荧光定量pcr法等。非侵入性方法主要指不通过胃镜取活检标本诊断hp的方法，包括同位素示踪法、免疫学方法(抗原、抗体检测)等。检测方法虽然多种，但简便、快速还能检测分型的却微乎其微。幽门螺旋杆菌分型方法主要分为血清学抗体检测和荧光定量pcr检测两大类。血清抗体检测的缺点在于无法区分正在感染与既往感染者，hp既往感染者的血清中仍然能被检测到。而通过实时荧光定量pcr法检测，检测结果更为准确可靠。
7.实时荧光定量pcr法检测的灵敏度、特异性与引物、探针组序列的设计密切相关，不同来源的样本dna在不同的引物探针组扩增检测时，检出率存在明显差异。而现有报道的荧光定量pcr法对幽门螺旋杆菌的感染和分型的检测，大多还是依赖胃粘膜组织提取的dna模板进行(例如专利申请cn 111455073 a)，对完全无创的粪便、唾液来源的样本检出率偏低，而胃粘膜组织的取得需要有创操作，患者接受度低。
8.因此，进一步研发通过荧光定量pcr法特异性从粪便、胃黏膜组织或胃液中检测幽门螺旋杆菌感染和分型相关的基因urea、caga的方法，实现对幽门螺旋杆菌感染和分型的准确检测，具有重要的意义和价值。


技术实现要素：

9.为解决现有的幽门螺旋杆菌的感染和分型的检测试剂难以实现完全无创，且检测灵敏度、特异性不高的问题，本发明提供了一种引物组，它包括：
10.用于urea基因检测的引物对：序列如seq id no.1所示的正向引物3和序列如seq id no.2所示的反向引物4；
11.用于caga基因检测的引物对：序列如seq id no.3所示的正向引物5和序列如seq id no.4所示的反向引物6。
12.本发明还提供了一种与上述引物组配合使用的探针组，它包括：
13.用于urea基因检测的引物探针：序列如seq id no.5所示的探针2；
14.用于caga基因检测的引物探针：序列如seq id no.6所示的探针3。
15.本发明还提供了上述的引物组和/或探针组在幽门螺旋杆菌感染和分型检测的试剂中的用途。
16.本发明提供了一种用于幽门螺旋杆菌感染和分型检测的试剂盒，它包括上述引物组和探针组。
17.进一步地，它还包括内参基因的检测引物对和引物探针；
18.优选地，所述内参基因为actb基因；
19.所述用于actb基因检测的引物对为：序列如seq id no.7所示的正向引物1和序列如seq id no.8所示的反向引物2；
20.所述用于actb基因检测的引物探针为：序列如seq id no.9所示的探针1。
21.进一步地，它还包括pcr buffer、dntps、mgcl2、taq酶和ung酶。
22.更进一步地，上述引物探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；
23.所述荧光报告基团包括：alex-350、fam、vic、tet、cal fluor gold 540、joe、hex、cal flour orange 560、tamra、cal fluor red 590、rox、cal fluor 20 red 610、texas red、cal flour red 635、quasar 670、cy3、cy5、cy5.5或quasar 705；
24.所述荧光淬灭基团包括tamra、bhq1、bhq2或mgb。
25.更进一步地，它还包括阳性对照和阴性对照；优选地，所述阳性对照为urea、caga质粒dna片段和内参actb基因的混合物；或者hp全基因组dna阳性对照；所述阴性对照为te缓冲液或无核酸酶水。
26.本发明还提供了一种幽门螺旋杆菌感染和分型检测的方法，包括如下步骤：
27.(1)提取样本基因组dna作为模板；所述样本为粪便、胃黏膜组织或胃液；
28.(2)使用权利要求8或9所述的试剂盒，在实时荧光定量pcr仪上对步骤(1)得到的dna模板进行扩增，同时实时荧光信号采集和分析；
29.(3)根据步骤(2)的荧光信号采集和分析结果判断样本幽门螺旋杆菌感染情况和分型。
30.本发明的有益效果：
31.本发明试剂盒选取恰当的靶基因(urea、caga)适宜的区域并设计了高特异性的引物和探针，进而制得了基于实时荧光定量pcr的对幽门螺旋杆菌感染和分型进行检测的试剂盒，可以方便快捷地在分子水平上实现对幽门螺旋杆菌的检测分型，检测效率高、针对性强、结果准确可靠；一个pcr反应即可判断有无hp感染，同时可进行基因分型，检测灵活快速且经济节约，可以为是否进一步治疗提供辅助依据；而且，本发明可直接采用粪便、唾液提取的dna检测，在实现完全无创的同时能保证高准确度，减少病人痛苦，提高患者接受度，具有非常好的推广应用前景。
32.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
33.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
34.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
35.图1为caga各引物探针组检测结果图(红色线为引物探针组1(caga-f1/caga-r1/caga-p1)；紫色线为引物探针组2(caga-f2/caga-r2/caga-p2)；蓝色线为引物探针组3
(caga-f3/caga-r3/caga-p3))。
36.图2为urea各引物探针组检测结果图(红色线为引物探针组1(urea-f1/urea-r1/urea-p1)；紫色线为引物探针组2(urea-f2/urea-r2/urea-p2)；蓝色线为引物探针组3(urea-f3/urea-r3/urea-p3))。
37.图3为内参基因actb引物探针组(actb-f/actb-r/actb-p)检测结果图。
38.图4为caga基因样本检测结果图。
39.图5为urea基因样本检测结果图。
40.图6为actb基因样本检测结果图。
具体实施方式
41.除另有说明外，本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
42.1、基因组dna的提取
43.胃黏膜组织样本采用qiaamp dna mini kit胃黏膜组织全基因组dna提取试剂盒(qiagen公司，德国)提取癌胃黏膜组织的基因组dna。粪便样本采用qiaamp dna stool mini kit粪便基因组dna提取试剂盒。通过nanodrop2000微量分光光度计(thermo fisher scientific，美国)检测基因组dna的浓度和质量，供后续基因特定区域检测pcr检测。具体提取步骤根据提取试剂盒操作说明书进行。待测样本的基因组dna作为pcr检测的模板。
44.2、对照品选择
45.所述阳性对照为基因工程合成质粒，具体为urea、caga质粒dna片段和内参actb基因的混合物(或者为hp全基因组dna阳性对照)；所述阴性对照为te缓冲液或无核酸酶水。
46.实施例1、本发明引物和探针的设计与合成
47.针对人基因组中基因urea、caga特定位点以及内参基因actb(序列参见ncbi数据库公开的人类全基因组序列)，使用primer premier 3.0及beacondesigner软件，设计特异性引物及探针。引物和探针由生工生物工程(上海)有限公司合成。
48.本发明针对幽门螺旋杆菌感染和分型相关的urea、caga靶基因片段核酸序列同时设计并验证了多对引物和探针组合序列，经多次反复优化实验(见实验例1)，优选了以下(表1)一组检测基因urea、caga片段引物探针序列为最优序列。
49.表1检测基因特定区域检测特异性引物探针序列
[0050][0051]
urea探针2的5’端链接cy5荧光基团，3’端链接荧光淬灭基团bhq2；caga探针3的5’端链接fam荧光基团，3’端链接荧光淬灭基团bhq1；actb探针1的5’端链接rox荧光基团，3’端链接荧光淬灭基团bhq2。
[0052]
实施例2、本发明幽门螺旋杆菌感染和分型检测的试剂组成
[0053]
包含urea正向引物(引物3)、urea反向引物(引物4)、urea检测探针(探针2)；caga正向引物(引物5)、caga反向引物(引物6)、caga检测探针(探针3)；内参基因actb正向引物(引物1)、actb反向引物(引物2)、actb检测探针(探针1)、pcr buffer、dntps、mgcl2。
[0054]
用量比例如表2：
[0055]
表2 pcr反应试剂组成
[0056][0057]
实施例3、本发明幽门螺旋杆菌感染和分型检测的试剂盒
[0058]
用量比例如表3所示。
[0059]
表3试剂盒的组成
[0060][0061]
实施例4、本发明幽门螺杆菌检测和分型的方法
[0062]
(1)提取样本基因组dna作为模板；所述样本为粪便、胃黏膜组织或胃液；
[0063]
(2)从试剂盒中取出pcr反应试剂，平衡至室温，22.2μl
×
(n 1)，pcr反应液和0.3μl
×
(n 1)酶混合液，酶混合液为(taq酶：ung酶按照20:1比例混合而成)，充分混匀20s，瞬时离心；(n＝检测样本数量)，瞬时离心。
[0064]
(3)按每管22.5μl分装于pcr管中。
[0065]
(4)用微量移液器向每个pcr管中再加入2.5μl模版dna溶液(待测样本dna或阴性/阳性对照品)，每个反应终体积为25μl。立即盖严管盖，充分混匀，瞬时离心，将pcr管移至实时荧光定量pcr扩增仪上。
[0066]
(5)在实时荧光定量pcr仪上，设置一个扩增程序，连续完成pcr扩增以及扩增过程中实时荧光信号采集、分析。反应程序设定如表4所示：
[0067]
表4 pcr反应程序
[0068][0069]
(6)结果的判定：
[0070]
在样本的检测过程中，基线的确定为：取3～15个循环的荧光信号；阈值设定：使阈值线超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且ct值为undet。根据扩增曲线和所报告的ct值(每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)判读样本检测结果。
[0071]
若fam、cy5通道对应检测通道均有扩增曲线，且扩增ct值≤36，检测结果为i型；
[0072]
若fam通道无扩增曲线，cy5通道有扩增曲线且扩增ct值≤36，检测结果为ii型；
[0073]
若只有对照的内参基因rox通道有扩增曲线，fam和cy5通道均为无扩增，检测结果为阴性。
[0074]
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
[0075]
实验例1、本发明引物探针组的筛选
[0076]
发明人前期针对幽门螺旋杆菌感染和分型相关的urea、caga靶基因片段核酸序列设计了多对引物和探针组合序列，通过反复筛选，得到了3组相对更优的探针引物组，序列见表5，并使用这三组探针引物组在同等条件下进行实时荧光定量pcr测试进一步比较测试效果。
[0077]
表5筛选的引物探针组序列
[0078][0079]
urea-p1/p2/p3的5’端链接cy5荧光基团，3’端链接荧光淬灭基团bhq2；caga-p1/p2/p3的5’端链接fam荧光基团，3’端链接荧光淬灭基团bhq1；actb-p1/p2/p3的5’端链接rox荧光基团，3’端链接荧光淬灭基团bhq2。
[0080]
实验结果如图1-图3所示。图3为内参actb基因扩增结果和阈值确定图。从图1可以看出，在相同样本为扩增模板的前提下，caga-f1、caga-r1、caga-p1引物组扩增ct值为16.4，而另外两组扩增ct值为20.6。扩增效率caga-f1、caga-r1、caga-p1好于其它两组引物探针。图2可以看出，urea-f1、urea-r1、urea-p1引物探针组扩增ct值为16.9，urea-f2、urea-r2、urea-p2引物探针组扩增ct值为20.7,urea-f3、urea-r3、urea-p3引物探针组扩增ct值为22.3，从扩增ct值urea-f1、urea-r1、urea-p1引物探针组效果最佳，检测灵敏度最好。因此，内参基因actb引物探针组为actb-f、actb-r和actb-p时，最优的urea基因引物探针组为组1(实施例1，urea-f1、urea-r1、urea-p1)；最优的caga基因引物探针组为组1(实施例1，caga-f1、caga-r1、caga-p1)。
[0081]
实验例2、本发明对幽门螺旋杆菌感染和分型的检测准确性
[0082]
1、实验方法
[0083]
本发明研究对象的样本收集：收集来自厦门第五医院hpⅰ型和ⅱ型感染者胃黏膜、胃液、唾液以及粪便样本，本发明选取粪便样本提取的dna检测结果进行分析。其中hpⅰ型感染者88例、hpⅱ型感染者6例、hp阴性样本93例作为研究对象。所有病例诊断依据患者的临
床资料、
13
c同位素示踪结果和胃镜检查等确定。收集的样本，保存于含有dna保存液的收集管，置于-20度冰箱中。分别取适量样本提取基因组dna。
[0084]
2、实验结果
[0085]
88例i型样本fam、cy5通道对应检测通道均有扩增曲线，且扩增ct值≤36，检测结果为i型，6例ii型样本cy5通道有扩增曲线，且扩增ct值≤36，fam通道无扩增曲线，检测结果为ii型，93例阴性样本只有对照的内参基因rox通道有扩增曲线，fam和cy5通道均为无扩增，检测结果为阴性(各样本的详细检测结果的ct值见表6)。可以看出，在i型幽门螺旋杆菌感染样本中，urea基因和caga基因有扩增，在ii型幽门螺旋杆菌感染样本中，urea基因有扩增而caga基因无扩增，而在幽门螺旋杆菌阴性样本中urea基因和caga基因均无扩增。
[0086]
随机选取以上样本中的28例样本进行了本产品检测与
13
c检测结果进行对比，其中
13
c检测结果为23例阴性，5例阳性；本产品检测结果为23例阴性，5例i型幽门螺旋杆菌感染，二者结果符合率为100％。
[0087]
随机选取以上样本中其它的32例样本进行了本产品检测与sanger测序进行对比，其中sanger测序结果为17份阴性，9例i型幽门螺旋杆菌感染，6例ii型幽门螺旋杆菌感染；本产品检测结果为17份阴性，9例i型幽门螺旋杆菌感染，6例ii型幽门螺旋杆菌感染，二者结果符合率为100％。
[0088]
经过sanger测序结果和
13
c检测对比实验得出其结果一致，表明本试剂盒的检测结果具有极高的特异性和可靠性。
[0089]
由此证明本发明试剂盒能快速、准确的检测幽门螺旋杆菌感染并且能区分感染的型别。本发明试剂盒不仅是快速、高效的，而且其结果的判读非常明确、直观，结果可靠，特异性强且灵敏度高。选取部分样本检测结果图作为示例，如图4-图6。
[0090]
表6各样本荧光定量pcr检测结果的ct值
[0091]
[0092]
[0093]
[0094]
[0095]
[0096][0097]
综上，本发明提供了一种针对靶基因urea、caga的高特异性的引物和探针，进而制得了基于实时荧光定量pcr的对幽门螺旋杆菌感染和分型进行检测的试剂盒，可以方便快捷地在分子水平上实现对幽门螺旋杆菌的检测分型，检测效率高、针对性强、结果准确可靠；并且可直接采用粪便、唾液提取的dna检测，在实现完全无创的同时能保证高准确度，减少病人痛苦，提高患者接受度，具有非常好的推广应用前景。