准确评估克隆免疫球蛋白(IG)/T细胞受体(TR)基因重組的手段和方法与流程

准确评估克隆免疫球蛋白(ig)/t细胞受体(tr)基因重組的手段和方法
1.技术领域及

背景技术：
及

技术实现要素：

2.本发明是有关于免疫学、免疫遗传学和临床诊断领域。特别是有关于一种在临床、诊断及/或研究环境中评估克隆免疫球蛋白(ig)/t细胞受体(tr)基因重组的手段和方法。
3.适应性免疫系统细胞(b细胞、t细胞)的特异性抗原识别是通过受体(免疫球蛋白、ig和t细胞受体、tr)调节的，这些受体分别在骨髓和胸腺的免疫发育过程中形成。通过ig/tr基因位点的重组，创建了独特的ig/tr受体的多样化(多克隆)资料库。在某些自身免疫性疾病中，所述数据基因库是不准确的(寡克隆)，而在淋巴恶性肿瘤中，受体基本相同(单克隆)
1-7
。因此，ig/tr重组形成独特的遗传生物标记物(分子标记)，用于研究免疫细胞的临床、诊断和研究应用8–
11
。传统上，免疫遗传分析方法主要涉及片段分析和桑格测序。次世代定序(next-generation sequencing，ngs)的引入使对ig/tr重组的更深入分析成为可能，对主要免疫遗传学应用产生影响：克隆性评估、微量残存疾病(mrd)检测、图谱分析
12-29
。克隆ig/tr基因重组的鉴定和评估是一种广泛用于淋巴恶性肿瘤诊断和追踪的工具
30-35
。ig/tr基因重组的ngs在临床实验室中越来越受欢迎，因为它避免了患者特异性实时定量(rq)-pcr检测的费力设计，并提供了在单次测序运行中对多种重组和重组类型进行测序的能力。因此，在急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，all)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，cll)和其他淋巴恶性肿瘤的诊断和追踪中，已经描述了几种高通量分析ig/tr重组的方法
16,17,23,24,36,37
。
4.ig/tr ngs的潜在应用包括在诊断样品中鉴定克隆ig/tr标记物，以便随后对微量残存疾病(minimal residual disease，mrd)进行分析，以及在不同的淋巴恶性肿瘤(主要是all、cll、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤)中进行实际的mrd分析。此外，它还可用于淋巴增生性疾病诊断过程中的克隆诊断。
5.已经发现ngs分析，特别是基于扩增子的分析，带来了重大挑战。例如，多个引子需要在相同的反应条件下黏合，而样品制备、资料库构建、测序和生物信息学可能引入许多技术变量，可能导致不准确的结果
38
。不幸的是，在科学控制的多中心环境中仍然缺乏标准化和验证。特别是在临床环境中，非常需要标准化实验室协议和ngs检测每个组成部分的质量控制(qc)的策略。
6.参考标准对于湿实验室和计算机ngs过程的评估至关重要，以确保在将ngs技术应用于临床实践之前测试结果的分析有效性
29,39,40
。参考dna材料应该是稳定的重组来源，可以测序并用于测量定性和定量特性。然而，本发明人认识到，先前发布的标准具有有限的范围和实用性，因为它们(1)不涵盖所有相关的ig/tr基因位点，(2)不报告测序运行的质量或样品和引子的性能，及/或(3)是合成结构，可能不能反映天然基因组dna的复杂性
23,41,42
。
7.因此，本发明人的目标是提供改进类型的质量控制，可以很容易地集成到现有的免疫分析ig/tr序列数据系统中，特别是arrest/interrogate
43
，这是一个基于网络的交互式计算平台，可以处理和注释大量免疫遗传数据，计算包括质量控制在内的若干相关统计数据，并以多个相互关联的可视化形式呈现结果。更具体地说，本发明人试图提供一种可直
接添加到样品中以进行并行资料库制备和测序的组合物，作为管内定性和定量标准，其受与随附样品相同的下游技术变量的影响。此外，本发明人的目的是提供一种成分，通过跟踪引子使用情况并与储存的参考图谱进行比较，从而在测序过程中统一评估所有类型ig/tr基因重组的性能偏差或异常扩增位移。
8.为此，euroclonality-ngs工作组的本发明人联手开发、标准化和验证用于ig/tr的ngs应用的体外测定和生物信息学。这导致提供了两种新型的质量控制；基于具有明确定义的ig/tr基因重组的人b细胞株和t细胞株的中心管内质量/定量控制(central in-tube quality/quantification control，cit-qc)，以及基于淋巴样物质的标准化混合物的中心多目标质量控制(central polytarget quality control，cpt-qc)代表完整的ig/tr基因库的标本。
9.因此，在第一目的，本发明提供了一种组合物(在本文中也称为“中心管内质量/定量控制”(cit-qc))，其包含从一组九个培养细胞株中分离的基因组dna的混合物，所述组包括b细胞株all/mik(b细胞前体all)、raji(burkitt淋巴瘤)、reh(b细胞前体all)、tmm(cml-bc/ebv b-lcl)、tom-1(b细胞前体all)、wsu-nhl(b细胞淋巴瘤)和三个t细胞株：jb6(alcl)、karpas299(alcl)和molt-13(t-all)，或其中所述组的一个或多个细胞株被包含相同免疫球蛋白(ig)/t细胞受体(tr)的一个或多个其他细胞株替换基因重组，即相同的ig/tr重组图谱。
10.在第二个方面，本发明提供了一种组合物(在本文中也称为“中心多目标量控制”(cpt-qc))，其由从健康人胸腺、健康人扁桃体和健康人外周血单核细胞中分离的基本上等摩尔量的基因组dna组成。
11.根据本发明的组合物在本领域中是未知的或未提出的。美国专利公开号us2018/208984a1涉及一种使用一组引子的次世代定序检测ig/tr重组的方法。一组包含已知等位基因的质粒，包括t细胞株jb6、karpas299和molt-13的tcr序列，用作对照组。然而，us2018/208984中使用cdna的对照组样品阻碍包含不完整的tr和ig重组，因为它们不会转录成mrna分子。这种不完全的tr和ig重组是本发明的明确目标，因为它们是克隆性检测和mrd评估的互补目标。例如，与本发明对照的组合物不同，us2018/208984不允许对重组的trb d-j、trd v-d、trd d-d、trd d-j、igk-kde和igh d-j进行鉴定和量化。
12.贝库蒂等人，(bmc生物信息学，第18卷，第1期，2017年，第1-12页)涉及一种使用ngs检测ig/tr重组的方法。从血沉棕黄层(包括外周血单核细胞)中分离的dna用作对照组。贝库蒂等人对使用来自其他组织来源的dna并无论述，更不用说其建议在多靶点质量控制组合物中包括扁桃体和胸腺基因组dna，以包括在pbmc中未发现的基本重组。
13.如本文提供的cit-qc组合物具有许多独特且有利的特性。第一，选择的一组只有9个细胞株具有总共46个重组，它代表尽可能少的细胞株，同时通过至少三个不同的重组覆盖每个目标，因此允许检测不仅具有图谱株相关而且具有跨细胞谱系株重组的所有细胞。其次，使用桑格定序及/或基于扩增子的ngs可以明确检测到重组。第三，igh基因重组的可变区是未突变的，因此避免了引子黏合的问题。表1显示了46种重组的完整列表。
14.通过使用基因组dna，本发明的组合物明确避免了质粒的使用，已知质粒对污染pcr测定构成严重威胁。此外，选择基因组dna以最佳方式代表所述分析所针对的患者样品，并且所述样品也包含基因组dna。
15.使用本领域已知的已建立的提取方案可容易地从细胞株中分离基因组dna。在一个实施例中，使用苯酚-氯仿萃取方案获得dna，随后在三乙二胺四乙酸(te)缓冲液中进行乙醇沉淀和洗脱。所述组合物适宜于干燥(例如冻干)形式，以便在使用前用液体重新配制。
16.17.在一个优选的目的，组合物包含从所选择的培养细胞株的组中分离的大约等量的基因组dna的混合物。例如，配制cit-qc组合物以提供具有至少40个细胞拷贝的dna的测试样品，优选每个细胞株的至少50个拷贝。尽管在对照
ˇ
样品中没有可表示的最大细胞拷贝数，但非常大量的基因组dna可能会在很大程度上消耗分析中的测序能力。在一个实施方案中，cit-qc组合物包含所选培养细胞株的组的约相等数量的细胞株dna拷贝，并且(配制成)重组成包含每个反应的每个细胞株的20-50个细胞拷贝的基因组dna的溶液。
18.用于本文提供的cit-qc组合物中的b细胞株和t细胞株可以从任何合适的(商业)来源获得。例如，raji细胞株为dsmz acc 319，reh细胞株为dsmz acc 22，tmm细胞株为dsmz acc 95，tom-1细胞株为dsmz acc 578，wsu-nhl细胞株为dsmz acc 58，karpas299细胞株为dsmz acc 31及/或molt-13细胞株为dsmz acc 436。当然也可以用包含(或提供)相同重组的具有良好生长特性的另一种细胞株代替表1中所示的一种或多种细胞株。因此，还包含一种组合物，其包含从一组培养细胞株分离的基因组dna的混合物，这些细胞株共同覆盖了表1所示的46种重组类型的图谱。
19.具体而言，本发明提供一种组合物，其包含从一组九种培养细胞株中分离的基因组dna的混合物，所述组包括b细胞株all/mik(b细胞前体all)、raji(伯基特淋巴瘤)、reh(b细胞前体all)、tmm(cml-bc/ebv b-lcl)、tom-1(b细胞前体all)、wsu-nhl(b细胞淋巴瘤)以及t细胞株jb6(alcl)、karpas299(alcl)和molt-13(t-all)，或其中所述组的一个或多个细胞株被一个或多个其他(即不同于所述九种细胞株)细胞株替换，所述细胞株包含相同的免疫球蛋白(ig)/t细胞受体(tr)基因重组。这种“等效”细胞类型至少包括表1所示的相同基因重组，或相同类型的ig/tr重组，即不同的cdr3。在一个优选的方面，所述组合物包含从b细胞株all/mik、reh和tom-1分离的基因组dna，每一个都包含跨细胞谱系tr重组。
20.在优选实施例中，所述组合物由从b细胞株all/mik、raji、reh、tmm、tom-1、wsu-nhl和t细胞株jb6、karpas299和molt-13分离的基因组dna的一混合物组成，优选大约等量。
21.在另一方面，本发明提供了一种cpt-qc组合物，其由基本上等摩尔量的从健康人胸腺、健康人扁桃体和健康人外周血单核细胞(pb-mnc)中分离的基因组dna组成。换句话说，它由1/3胸腺、1/3扁桃体和1/3pb-mnc dna的等摩尔混合物组成。如本文所用术语“健康”是指从已知或推测未患有潜在恶性免疫疾病或病症的人类受试者获得的组织。在一方面，胸腺是从幼儿身上获得的，因为身体无法到达心脏进行手术。优选地，对于每个组织，从许多不同的人类个体获得基因组dna。例如，对于每个组织，使用3到10个人类受试者的dna。由于所述组合物代表“标准化淋巴样样品”，因此其适合用作单独样品，与测试样品一起处理，因此其优选配制为提供与测试的常规样品基本相同数量的dna。通常范围优选为50至200纳克。在特定目的中，将组合物干燥(例如，冻干)。
22.如本文所使用的表示方式“大约等量”或“基本等量”反映了每个细胞株/淋巴组织样品在基因组dna混合物中被同等表示的目的。
23.本发明还提供一种诊断试剂盒，其包括(第一)容器及/或(第二)容器，所述(第一)容器包含本发明的“中心管内质量/定量控制”(cit-qc)组合物，所述(第二)容器包含如本文所公开的“中心多目标质量控制”(cpt-qc)组合物。在一个实施例中，试剂盒至少包含如本文所公开的cit-qc组合物。在另一实施例中，试剂盒至少包含本发明的cpt-qc组合物。cpt-qc组合物可以与一种或多种其他有用的质量控制组合物一起包装。例如，进一步的对
照组合物可包含从一组培养细胞株分离的基因组dna的混合物，这些细胞株共同覆盖表1所示的46种重组类型的图谱，使得在评估克隆ig/tr基因重组时，两种质量控制可用于监测分析性能。
24.优选地，试剂盒包含如本文所公开的cit-qc和cpt-qc组合物。试剂盒还可有利地包括用于检测ig/tr基因重组的一种或多种试剂，例如用于ig/tr基因重组的基于扩增子的ng的一组引子。在特定实施例中，除了本文提供的一种或两种qc组合物外，诊断试剂盒还包括一种或多种引子组，用于检测选自由igh-vj、igh-dj、igk-vj-kde、trb-vj、trb-dj、trd和trg组成的群组中的一种或多种ig/tr基因重组。特别优选的引子，例如与qc组合物组合使用的引子，是针对基于ngs的检测进行优化的引子，如图5或表3所示的引子。
25.本发明还提供了一组用于ig/tr基因重组的基于扩增子的次世代定序(ngs)的引子，包括从图5所示的引子中选择的两个或多个引子。优选地，所述组包括至少两个引子，用于检测选自由igh-vj、igh-dj、igk-vj-kde、trb-vj、trb-dj、trd和trg所组成的群组中的一种或多种、优选两种或多种、更优选三种或多种ig/tr基因重组。在一个具体方面，引子组包含用于检测igh-vj、igh-dj、igk-vj-kde、trb-vj、trb-dj、trd和trg基因重组中的每一个的引子。图5的引子序列可提供通用引子序列(例如m13正向序列m13前置引子(-20)：gtaaaacgacggccagt；和/或t7通用引子：taatacgactcactagg；)或本领域已知的不与目标序列杂交的其他通用引子序列，及/或其他衔接子或条形码序列。
26.在特定方面，本发明的引子包含正向或反向m13序列。在一个实施例中，图5的引子序列在其5
′
端具有通用m13尾部，优选具有序列gtaaaacgacggccagt。在另一实施例中，图5的引子序列具有t7启动子序列。在特定方面，本发明提供一组引子，其包括从表3所示的引子中选择的两个或多个引子。
27.本发明的新型qc组合物的提供对质量控制和定量策略具有重要意义。如下文所示，cpt-qc组合物是一种有价值的工具，用于监测结果的再现性，并识别湿实验室方案中的引子干扰和其他偏差，因为它们引入了可检测到的测序图谱变化。在每次测序运行中添加cpt-qc允许在测序后检查引子和检测性能。可以检测到复合ig/tr引子组中单个引子浓度的意外偏差，可以追踪单个引子的性能故障，并且可以通过分析cpt-qc数据来估计ig/tr分析的后果。
28.此外，还显示了cit-qc的优势和多种用途。与质粒或合成参考模板相比，cit-qc细胞株特别适合用作对照组，因为它们是大量基因组dna的来源，并且可以在市场上买到。cit-qc重组代表了所有八个引子组中2/3的可扩增重组类型，因此提供了一个机会来突出一些问题，最明显的是扩增过度/扩增不足，但也存在生物信息错误识别。此外，cit-qc重组可以取代血沉棕黄层dna以实现pcr稳定性，而不会影响患者的免疫组库(因为cit-qc重组是通过生物信息学识别的，默认情况下从结果中排除)。
29.cit-qc可实现从片段到细胞的转换，这对临床使用至关重要。用于mrd标记识别分析的诊断材料可以显示不反映样品克隆组成的特定克隆型的丰度。例如，如果诊断样品被一种淋巴恶性肿瘤高度浸润，而这种淋巴恶性肿瘤不存在可定位的重组，那么(少数)残留的淋巴细胞将产生可检测的全部重组；在这种情况下，伴随的生理性b或t细胞克隆可能被错误分配为具有白血病标记物的克隆。
30.除了在标记物鉴定中的应用，以及再生障碍性追踪样品中b细胞和t细胞缺失的范
例，cit-qc对于治疗前后样品中的mrd定量具有最大的相关性，特别是如果应用了b细胞或t细胞细胞定向疗法，最大限度地减少了多克隆基因重组的背景。如果通过白血病特异性片段与所有注释性片段的比率计算相对肿瘤负担，而不进行任何归一化，则商数仅反映携带特定类型重组的细胞之间的标记物频率(例如，存在的b细胞总池中的ig重组)因此可能会严重高估实际肿瘤负荷
44
。
31.此外，qc协议可以很容易地嵌入到arrest/interrogate中，它向用户通知报告和消息，并允许他们例如将qc失败的样品重新纳入分析中。这背后的逻辑是，标记“失败”是未满足预定义qc标准的警报，但并不一定表示数据已完全损坏。但是，应始终谨慎使用标记的数据，这取决于应用程序或问题。
32.因此，本发明还涉及根据本发明的组合物或如上所述的试剂盒在检测ig/tr基因重组的分析中的用途。本领域技术人员将认识到并理解各种应用。仅作为示例，该分析是临床诊断分析，优选用于检测克隆性、识别mrd标记和/或mrd监测和/或分析淋巴恶性肿瘤中的(克隆)免疫组库的分析。
33.另一个实施例涉及使用ngs检测至少一个生物样品中ig/tr基因重组的体外方法，包括样品制备、pcr及/或数据库构建、测序和生物信息学分析的常规步骤，但其特征在于使用至少一种qc组合物。例如，至少一种生物样品掺入了cit-qc组合物，例如以提供每个细胞株至少40个细胞拷贝的dna的量。如管内定性和定量控制，可将片段转换为细胞相关物，这对临床应用至关重要。
34.可选地或另外，cpt-qc组合物作为与至少一个生物“试验”样品平行的单独样品运行，其用作外部对照，以在测序后检查引子和分析性能。
35.通常，至少一种生物样品是临床相关样品。在一方面，它是用于检测克隆性的样品，以支持或排除恶性淋巴增生的诊断。在另一方面，它是用于mrd标记物识别或mrd监测分析或(克隆)免疫组库分析的样品。
36.本文提供的方法可以使用本领域已知的标准手段和方案进行。在一个实施例中，所述方法的至少一部分是使用微流体技术进行的。例如，样品制备、pcr、数据库构建及/或测序的步骤在包含一个或多个预存试剂的微流体装置中执行。特别优选用于本发明的方法的是离心微流体盘系统(在本领域中也称为“离心微流体生物芯片”或“离心微流体生物盘”)，这是一种芯片实验室技术，可用于将分离、混合、反应和检测纳米级分子等过程集成在一个平台上，包括光盘或dvd。离心微流体结构中有各种典型的单元，包括阀门、体积计量、混合和流量切换。这些类型的单元可以组成可以以多种方式使用的结构。在分子与试剂反应之前，应为反应做好准备。最典型的是离心力分离。例如，在血液的情况下，可以通过旋转生物盘一段时间来实现血浆中血细胞的沉淀。分离后，所有分子诊断分析都需要一个细胞/病毒裂解步骤，以便释放基因组和蛋白质组材料进行下游处理。典型的裂解方法包括化学法和物理法。化学裂解法是最简单的方法，它使用化学洗涤剂或酶来分解膜。物理裂解可以通过在磁盘上使用珠打系统来实现。裂解是由于珠子和细胞之间的碰撞和剪切以及沿裂解室壁的摩擦剪切而发生的。
37.一方面，所述盘包括用于自动化和集成的dna提取、pcr及/或数据库生成的预存试剂例如，参见tang等人的评论
45
。
38.用于本发明方法的示例性的盘包括具有以hahn schickard名义在专利申请中公
开的一个或多个特定特征的盘，例如wo2013/124258、wo2014/198703、wo2015/189280、wo2015/051950和wo2017/191032。
39.在本发明的方法中，生物信息学分析的步骤有利地包括使用基于网络的交互式应用程序。例如，生物信息学分析包括使用专门构建的生物信息学应用程序(如逮捕/讯问或等效程序)对原始数据进行预处理、引子序列分析、免疫遗传注释、结果后处理、cit-qc的分析和使用(包括用于标记量化)、cpt-qc的分析和使用(包括与预分析的存储参考数据集进行比较)，结果的报告/访问/可视化。
40.因此，本发明证明了两种参考/qc标准的适用性，它们允许对ig/tr ngs数据进行标准化分析(例如，使用本文公开的ngs引子组)，在标记识别中具有高再现性、准确性和精密度。借助arrest/interrogate，提供了伴随体外分析的完整计算机解决方案，从而能够分析ig/tr序列，包括淋巴恶性肿瘤中有效标记物识别所需的所有质量标准和量化概念。
附图说明
41.图1：研究设计：cit-qc和cpt-qc的开发和应用工作流程，以及基于96孔板的测试数据集示意图。
42.图2：用于标记识别质量控制和量化的sop示意图概述：数据库制备、pcr和ngs、使用arrest/interrogate的生物信息学。
43.图3：测试数据集中cit-qc和标记之间的关系图。a.cit-qc和标记(x轴)片段丰度百分比之间的关系。a.对于cit-qc，％分母是带有连接点的片段；对于标记，％分母是我们所说的带有连接点的“可用”片段，不包括cit-qc片段；这导致总和》100％。b.标准化为细胞百分比之前和之后的标记丰度。*标准化可能导致值》100％。
44.图4：用于all中mrd标记物鉴定的ig/tr ngs检测的多中心验证工作流程示意图。ig和tr基因重组使用多重pcr分析以两步法进行扩增。每个参与的实验室对10例all患者进行了基于ngs的ig/tr mrd标记物鉴定。本发明的中心多目标质量控制(cpt-qc)组合物用于监测引子性能，并将本发明的中心管内质量/定量控制(cit-qc)添加到每个样品中作为数据库特定的质量控制和校准物。移液以96孔的形式进行。数据分析采用arrest/interrogate的方式进行。
45.图5：重组和引子组的示意图，以及显示每个研究位点连接核苷酸长度的直方图。
46.图5a-1)显示igh-vj和igh-dj重组示意图。vh家族引子、dh家族引子和共有jh引子的相对位置是根据它们在所涉及rss的5'核苷酸最上游(-)或最下游( )给出的。
47.图5a-2)显示bcp-all患者、cpt-qc、bc、胸腺和扁桃体中完全igh重组(igh-vj管)的连接核苷酸长度的直方图。条形根据v-j基因组合着色。
48.图5a-3)直方图显示了bcp-all患者、cpt-qc、bc、胸腺和扁桃体中不完全igh重组(igh-dj管)的连接核苷酸长度。条形根据d-j基因组合着色。
49.图5b-1)为igk-vj重组和两种类型的kde重组(v-kde和内含子rss-kde)示意图。vk、jk、kde和内含子rss(intr)引子的相对位置是根据它们在相关rss的最5'核苷酸上游(-)或下游( )给出的。
50.图5b-2)直方图显示了b-all患者、cpt-qc、bc、胸腺和扁桃体中igk-vj和igk-v-kde重组(igk-vj-kde管)的连接核苷酸长度。条形根据v-j-kde基因组合着色。
51.图5b-3)直方图显示bcp-all患者、cpt-qc、bc、胸腺和扁桃体中内含子-kde重组(内含子-kde管)的连接核苷酸长度。
52.图5c-1)为trb-vj重组和dj重组示意图。trb v家族引子、trb d引子和trb j引子的相对位置根据所涉及rss的最上游(-)或下游( )的5'核苷酸给出。
53.图5c-2)显示t-all患者、cpt-qc、bc、胸腺和扁桃体中完整trb重组(trb-vj管)连接核苷酸长度的直方图。条形图根据v-j基因组合着色。
54.图5c-3)显示t-all患者、cpt-qc、bc、胸腺和扁桃体中不完全trb重组(trb-dj管)连接核苷酸长度的直方图。条形图根据d-j基因组合着色。
55.图5d-1)为trg v
–
j重组示意图以及trg v和trg j引子的相对位置。trg v引子和trg j引子的相对位置根据所涉及rss的最上游(-)或下游( )的5'核苷酸给出。
56.图5d-2)显示t-all患者、cpt-qc、bc、胸腺和扁桃体中trg重组(trg管)连接核苷酸长度的直方图。条形图根据v-j基因组合着色。
57.图5e-1)为vd-jd、dd-jd、dd-dd和vd-dd、vd-ja29重组示意图，显示vd、jd、dd和ja29引子的位置，所有引子组合在一根试管中。vd、dd和jd引子的相对位置根据所涉及rss的最上游(-)或最下游( )的50个核苷酸来指示。
58.图5e-2)显示t-all患者、cpt-qc、bc、胸腺和扁桃体中trd重组(trd管)连接核苷酸长度的直方图。条形图根据v-d-j基因组合着色。
59.图6：所有患者mrd标记物鉴定分析的多中心验证结果示意图。左侧列：通过桑格定序确定的索引序列。右侧列：由ngs标识的索引序列。列中颜色最深的部分反映了由两种方法识别的克隆序列，颜色最浅的部分是仅由各自方法识别的序列。中间色切片是通过两种方法鉴定的克隆序列，但通过归一化后丰度《5％的ngs鉴定。
具体实施方式
60.实施例1：中心管内质量/定量控制(cit-qc)的设计和生产
61.来源和方法
62.总共有59个人类的b(n＝30)和t(n＝29)淋巴细胞株从美国类型培养物收集(atcc；www.lgcpromochem-atcc.com，美国弗吉尼亚州马纳萨斯)和德国微生物和细胞培养物收集有限公司(dsmz；www.dsmz.de，德国布伦瑞克)获得，或从内部细胞株库中获得。使用苯酚-氯仿提取方案从培养的细胞株中分离dna，然后乙醇沉淀并在三乙二胺四乙酸(te)缓冲液中洗脱。或者，根据制造商的方案，使用genelute哺乳动物基因组dna小量制备试剂盒(美国密苏里州圣刘易斯市西格玛
·
奥尔德里奇)分离dna。
63.鉴定细胞株特异性克隆ig/tr基因重组
64.使用上述euroclonality-ngs测定法对59个细胞株中的每一个筛选克隆ig/tr基因重组，使用来自每个细胞株的100纳克dna(使用qubit 3.0，thermo fisher scientific定量)，不添加血沉棕黄层(bc)。双端测序(2x250碱基对)在illumina miseq(美国加利福尼亚州圣地亚哥illumina)上进行，每个资料库的最终浓度为7pm，每个样品至少2000片段。为避免低复杂性库问题，每次测序运行都添加了10％phix控制。
65.验证细胞株特异性克隆ig/tr基因重组
66.使用其他方法验证ngs扩增子鉴定的细胞株重组：
67.1.在euroclonality ngs工作组内建立的基于捕获的方案，覆盖ig/tr基因位点的编码v、d和j基因
37
：简言之，使用kapa hyperplus试剂盒(美国加利福尼亚州普莱森顿罗氏测序解决方案公司)对细胞株dna进行片段化和处理；利用定制的seqcap ez choice探针(罗氏测序解决方案，美国加利福尼亚州普莱森顿)对资料库进行杂交，所述探针是基于wren等人37开发的；对illumina nextseq进行2x150碱基对的配对末端测序。
68.2.根据biomed-2方案进行多重扩增和桑格定序：在qiaxcel advanced system中检查pcr产物的片段大小和克隆性
11,46
。克隆pcr产物进行异源双链分析，并在abi 3130或abi 3500平台(美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司)上测序。
69.比较用不同方法获得的所有细胞株的ig/tr重组图谱。
70.通过ddpcr验证来自人体b细胞株和t细胞株的细胞株特异性基因重组
71.对于三种方法之间结果不一致的情况，设计了ig/tr等位基因特异性pcr检测，用于数字滴pcr(ddpcr)(qx200tm滴状数字tm pcr系统，bio-rad)以验证各自的重组。使用两种不同的gdna量(50纳克、100纳克)通过ddpcr对ig/tr基因重组进行绝对定量。每个实验包括多克隆血沉棕黄层bc对照和无模板对照。
72.用于克隆ig/tr重组的等位基因特异性引子和用于定量的探针由sigma aldrich合成。所有引子通过脱盐清洗，而含有5'-fam/3'-tamra报告染料的水解探针通过hplc清洗。所有寡核苷酸在总链浓度ct＝100μm时重新悬浮在te缓冲液中，并在使用前储存在-20℃下。
73.使用10微升的2x ddpcr supermix(bio-rad laboratories,hercules,ca)制备20微升体积的ddpcr反应，测试之前使用qubit dsdna高灵敏度分析试剂盒(thermo fisher scientific,waltham,ma)、前置引子(fp)和反置引子(rp)以及fam标记的探针(100nmol/l)定量的两种不同数量的细胞株gdna(50纳克/500纳克)，最终浓度均为300nmol/l，。液滴由qx200液滴产生器(bio-rad)使用20微升反应混合物和70微升用于探针的液滴生成油(bio-rad)生成，液滴位于dg8盒(bio-rad)中的合适的孔上。将约45微升的液滴-油混合物(12000至20000滴)转移到96孔板(bio-rad)中，并按照以下扩增方案加载到dna引擎dyad-peltier热循环仪上：95℃下10分钟，然后40个循环：在94℃下变性30秒；在60℃下黏合1分钟；在60℃下延长1分钟。pcr产物装入qx200液滴读取器，并由quantasoft 1.2版(bio-rad实验室)进行分析。
74.细胞株混合物制备
75.最初，通过qubit双链dna高灵敏度分析试剂盒(thermo fisher scientific，waltham，ma)对所选b细胞株和t细胞株的dna进行定量。使用50纳克至200纳克dna/细胞株，通过基于ddpcr的白蛋白管家基因定量再次检查定量值，以精确确定每微升dna的细胞数。用于白蛋白定量的引子和探针由sigma aldrich合成。根据上述方案，对每个细胞株进行重复的ddpcr。pcr完成后，根据每20微升反应体积的细胞株拷贝数在液滴读取器中分析样品。根据ddpcr的值，将细胞株dna在te缓冲液中稀释至400复制数/微升。使用两种不同体积的稀释细胞株溶液(0.5微升dna[200复制数]和2微升dna[800复制数])作为输入量。使用合适的定量值，进一步稀释细胞株dna并彼此混合，从而使每个细胞株的40个复制数存在于2微升的dna混合物中。将此混合物作为cit-qc添加到每个样品中，并在测序前进行同步数据库制备。
[0076]
cit-qc的实施
[0077]
在生物信息学上，使用基于免疫遗传注释的方法识别cit-qc片段，所述方法速度极快，同时允许序列变化，避免计算密集型和潜在不准确的对准的方法。在arrest/interrogate中，所用术语“spike-ins”也用于指cit-qc。
[0078]
关于qc，需要识别每个cit-qc重组至少一片段，以及至少与使用的细胞总数相同的cit-qc片段总数，否则样品标记为“qc失败”(关于如何在arrest/interrogate中使用此标记，请参见下文)。在任何情况下，通过将cit-qc细胞除以总片段来计算的量化因子都会被存储和应用，因此仍然允许用户分析样品。
[0079]
量化基于应用量化因子将克隆型的片段计数转换为细胞计数，然后计算相对于总输入细胞的相对丰度。
[0080]
实施例2：中心多目标质量控制(cpt-qc)的设计和生产
[0081]
来源和方法
[0082]
制备由从健康人胸腺、健康人扁桃体和健康人外周血单核细胞中分离的基因组dna组成的cpt-qc组合物(dna量以1:1:1的比例混合)。为此，在解剖和切碎组织或ficoll密度血液分离后获得的细胞悬浮液上进行(半)自动基因组dna提取。对于euroclonality ngs分析，这涉及每次运行一个cpt-qc样品，在八个试管中扩增。
[0083]
cpt-qc的实施
[0084]
引子在运行的八个cpt-qc试管中的每一个的片段中进行生物信息学鉴定，并使用比例检验将它们的丰度与存储的cpt-qc参考结果进行比较。
[0085]
存储的参考结果是来自cpt-qc样品分析的arrest/interrogate的输出。这些结果应通过在每个实验室中随时间重复运行来确认，以适应技术变化。存储结果不是原始数据，以确保生物信息学分析不会被用户无意中破坏；这意味着结果会随着arrest/interrogate的每个主要版本而更新，以确保与新运行的兼容性。
[0086]
特定引子或特定引子组的丰度问题用于将相应的cpt-qc样品以及相同引子组的所有用户样品标记为“qc失败”。
[0087]
复制运行
[0088]
由于重现性对于此类qc很重要，因此执行了cpt-qc的重复运行。采用比例检验比较5'引子的相对丰度。
[0089]
引子扰动运行
[0090]
为了评估cpt-qc检测引子性能问题的可用性，创建引子浓度的人工扰动以模拟缺少移液引子或移液错误的引子浓度。
[0091]
首先在cpt-qc样品中分析了5
′
引子的使用，并从每个引子组中选择了两个不同丰度的引子，从而跳过了只有两个引子的内含子-kde引子组；igh-vj-fr1-m-1,igh-v-fr1-o-1；igh-d-b-1,igh-d-e-1；igk-v-g-1,igk-v-i-1；trb-v-ad-1,trb-v-g-1；trb-d-a-1,trb-d-b-1；trg-v-f-1,trg-v-e-1；trd-d-a-1,trd-v-b-1。这些引子通过将它们从引子库中完全排除并通过减少到10％并增加到200％来改变它们的浓度而使其受到干扰。使用比例检验比较了这些扰动组和cpt-qc之间5'引子的相对丰度。
[0092]
创建测试数据集
[0093]
创建了一个数据集来评估和展示上述概念和功能，其中包含以下示例：
[0094]
1.四个诊断性骨髓b-/t-all样品，白血病细胞含量高(常规细胞形态学评估白血病浸润为60-80％)。
[0095]
2.四个b/t细胞靶向治疗后的b/t细胞再生障碍患者样品。b细胞再生障碍的两个样品是利妥昔单抗(抗cd20)治疗后的cll样品，t细胞再生障碍的两个样品是阿仑单抗(抗cd52)治疗后的t-pll(前淋巴细胞白血病)样品。在所有这些样品中，流式细胞术证实了谱系特异性再生障碍。
[0096]
3.cpt-qc适用于所有ig/tr引子组，但trb-vj引子组结果与上述验证实验的扰动结果交换。为了展示通用qc功能，人为选择了来自其中一个诊断样品的小于1000个随机片段。
[0097]
方法
[0098]
诊断样品和cpt-qc使用所有引子组运行，而再生障碍性追踪样品仅使用相应的引子组运行，即b细胞再生障碍性样品的ig组和t细胞再生障碍性样品的tr组(如图1所示；测试数据集)。此外，在不添加血沉棕黄层(bc)的情况下运行后续样品，以测试添加cit-qc成分是否足以稳定样品进行测序，而不会影响其免疫遗传特征。为此，遵循了图2中可视化的流程。
[0099]
使用cpt-qc评估引子性能
[0100]
对5'引子相对丰度比例的测试，应用于cpt-qc、bc及其复制品，以及引子干扰的数据库，表明未受干扰引子组和受干扰引子组之间的p值存在明显差异。换句话说，受干扰引子丰度差异的p值明显较低。表2给出了结果的简化视图，重点是受干扰引子的丰度以及每个引子组至少一个其他未受干扰引子，以显示其正常行为或讨论其异常行为。所有引子组中5'引子的丰度百分比。顶部引子组受到干扰；底部组是一组未受干扰的引子：按字母顺序选择一组引子，再加上两个例子，其中引子行为与讨论有关(见正文)。结果显示：在cpt-qc复制品中(第三列)；对于排除引子的样品(“0％”，第四列)，减少到10％(第五列)，增加到200％(第六列)。导致比例检验的百分比变化(单独表示并以 /-表示)。
[0101]
在p值阈值为1e-200时，cpt-qc中没有任何引子被标记，这突出了检测的可重复性，而所有受干扰的引子都在受干扰的场景中被标记。事实上，与扰动比较中的多个零值相比，正常样品中引子trd-v-a-1的最低p值为7.86e-142(表2)(除了少数例外，主要是200％扰动)。在其他细胞中也可以看到丰度的显着变化，最可能的解释是这些引子受到其他引子扰动的间接影响。也就是说，当一个最初丰度的引子被排除在外时，一个引子“接管”，例如igh-v-fr1-d-1，当igh-vj-fr1-m-1受到任何一种方式的干扰时，尤其是因为这些引子放大了部分重叠的基因列表。
[0102]
arrest/interrogate中qc方面的评估
[0103]
arrest/interrogate中提供了有关基于cpt-qc和cit-qc的计算机质量控制信息，默认情况下排除“qc失败”样品以警告和防止用户意外使用。但是，用户会收到通知，并且可以选择将它们重新包含在分析中。还对样品执行一般质量控制，特别是检查原始片段数是否低以及识别连接的片段百分比是否低。此类样品也被标记为“qc失败”。
ngs仅反映重组的相对代表性，因此建立校准器非常重要，这将使输入dna细胞的测序片段正常化。这对于专门覆盖仅存在于少数淋巴细胞中的重组的管(尤其是trd和内含子-kde管)尤为重要。trd基因在正常b细胞中不会重组，并且在大多数trαβ细胞中被删除。因此，在trd-ngs分析中，寡克隆tcrγδt细胞可能会产生显性克隆型，特别是当正常tcrγδt细胞库在儿童时期显着倾斜时。在这里，基于cit-qc的丰度校正对于避免将来自次要tcrγδ细胞群的(次要)克隆trd重组错误分配为白血病重组至关重要，然后将作为进一步mrd分析的标记。
[0107]
测试数据集的分析显示了cit-qc在标记识别和量化中的效用。如果没有cit-qc，如果仅基于片段数，诊断样品和再生障碍样品似乎都是寡克隆的(图3)。然而，在所有再生障碍样品和少数诊断样品中，仅从数量非常有限的cit-qc细胞(120-440，取决于每个引子组cit-qc重组的数量)中非常高的数量的片段是间接的，然而，这些样品中存在特定ig/tr位点重组的患者相关输入细胞数量有限的明确迹象。从另一个角度看，cit-qc的总片段百分比远大于这些样品中重组的百分比，这也表明cit-qc细胞的数量大于患者相关输入细胞的数量。事实上，在使用cit-qc量化后，细胞丰度远低于暗示克隆性的阈值。
[0108]
另一方面，正如预期的那样，在诊断样品中，cit-qc序列占少数。因此，这意味着使用cit-qc可以更准确地确定某种重组的丰度并将其重新计算为细胞丰度。
[0109]
此外，五个经验丰富的euromrd all参考实验室对50个诊断性all样品进行了ig/tr ngs，并将结果与通过常规ig/tr桑格定序产生的结果进行了比较。cpt-qc组合物用于监测引子性能，并将cit-qc组合物添加到每个样品中作为数据库特定的质量控制和校准品。ngs鉴定了259个克隆序列(平均5.2个/样品，范围0-14)，而桑格定序测序了248个(平均5.0个/样品，范围0-14)。桑格和ngs之间的总体一致性为78％，包括阴性数据库。
[0110]
实施例4：用于all中mrd标记物识别的ig/tr ngs检测的开发和多中心验证
[0111]
本实施例描述了ig/tr检测(包括生物信息学)的开发和设计，及其对急性淋巴细胞白血病(all)中mrd标记物识别的验证。五个euromrd all mrd参考实验室对50个诊断性all样品进行了ig/tr ngs，并将结果与通过常规ig/tr标记筛选和桑格定序产生的结果进行了比较。cpt-qc组合物用于监测引子性能，并将cit-qc组合物添加到每个样品中作为资料库特定的质量控制和校准品。验证研究的整体工作流程如图4所示。
[0112]
材料和方法
[0113]
分析设计的一般概念
[0114]
目的是开发一种通用的基于扩增子的ngs方法，用于dna水平的ig/tr序列分析，适用于所有淋巴恶性肿瘤，设计了多个ig/tr位点的检测：ig重(igh)、ig kappa(igk)、tr beta(trb)、tr gamma(trg)和tr delta(trd)，包括适用的完全和不完全重组。ig lambda(igl)由于与其他ig位点的互补性有限且多样性降低而被排除在外。tr alpha(tra)由于其高度复杂性而被排除在外，阻碍了dna水平上合理的多重pcr方法。
[0115]
igh基因位点分两步重新排列(图5a)。在初始将单个igh-d基因与igh-j基因偶联后，igh-v基因与不完全的igh-dj重组结合，导致完全的igh-vj重组。为了扩增完整的igh重组，设计了位于fr1、fr2和fr3区域的引子，但这里只描述了用于all标记识别的fr1检测。igh-dj重组在单独的多重pcr反应中扩增。igk轻链基因位点由功能性igkv和igkj基因以及所谓的kappa缺失组件(kde)组成，所述组件可以重组为igkv基因或igkj-igkc内含子中的
重组信号序列(rss)，导致igk等位基因的功能失活(图5b)。igkv前置引子被设计为在一个多重反应中与igkj和kde反置引子结合使用，而第二个pcr是为正向内含子rss和反向kde引子开发的。trb基因位点也有一个两步过程，最初形成不完全的trb-dj重组，然后是完全的trb-vj重组。不完全和完全trb重组设计用于在两个单独的多重pcr反应中检测(图5c)。由于trg基因位点重组是一步vj重组，涉及有限数量的trgv和trgj基因，因此可以开发单一的多重检测(图5d)。最后，在trd基因位点中，完全的vj重组在dd、vd和dj重组之前。此外，某些trav基因可以重组到trdj和traj，而trdv-traj重组通常涉及traj29，也可以发生。所有这些重组都设计为在一次多重pcr分析中扩增(图5e)。生物信息学平台arrest/interrogate
43
已经在euroclonality-ngs工作组内从头开始开发，以协助其多方面的活动，进一步适用于本研究，如下所述。
[0116]
引子设计和引子性能的技术验证
[0117]
引子被设计为基因特异性的，但在等位基因变异的情况下，简并引子被设计为促进多重化。出于同样的原因，在引子的中间或5’端的单一错配被接受。表3显示了包含图5的核苷酸序列和附加转接子序列(正向或反向)的引子序列。本领域技术人员将意识到所述实施例仅是说明性的并且所述实施例的具体方法的许多变化是可能的。例如，不需要使用m13序列作为实施例中使用的引子的一部分。这可以被任何其他已知的dna序列取代。
[0118]
表3：ig/tr ngs中第一步和第二步pcr的引子序列
[0119]
[0120]
[0121][0122]
pcr方法也在单中心环境下进行了测试。
[0128]
all mrd标记物鉴定检测的多中心验证
[0129]
与标准技术相比，五家经验丰富的euroclonality-ngs实验室测试了all中用于ig/tr标记物识别的优化检测的稳健性和适用性。
[0130]
所有实验室(布里斯托尔/伦敦、巴黎、蒙扎、布拉格和基尔)都是euromrd联盟和参考实验室的成员，用于all mrd分析。每个参与实验室都对10名b或t系all患者进行了基于ngs的ig/tr mrd标记物鉴定。所有实验室都严格遵循中央标准操作程序。该研究使用illumina miseq(2
×
250碱基对v2试剂盒)进行。根据标准指南，ngs分析与克隆产品的常规pcr和桑格定序完全平行进行。对于两种方法之间存在无法解释的差异结果的部分案例，等位基因特异性pcr检测(用于数字液滴pcr或实时定量pcr)旨在澄清各自的克隆重组是否代表白血病体积。euromrd指南用于设计和解释等位基因特异性pcr检测
33,34
。
[0131]
结果
[0132]
引子设计和引子性能的技术验证
[0133]
根据测试和验证阶段的结果，最终的ig/tr引子混合物由8个管组成，其中包含92个前置引子和30个反置引子，其中15个反置引子用于成对的不同管)。引子位置和序列如图5和表3所示。
[0134]
质量控制组合物的实施
[0135]
稳健扩增、数据库制备和测序的质量控制对于这些复杂的分析至关重要。不同的引子需要在相同的反应条件下工作，而样品特征和测序可能会引入额外的变异性。引子性能必须纵向监测，为了准确估计克隆丰度，重要的是校正每个输入分子的测序片段。
[0136]
为了解决这些问题，包括了两种类型的质量控制组合物：(i)将实施例1的cit-qc作为数据库对照和校准品加入每个管中，以及(ii)平行运行实施例2的cpt-qc监测一般引子性能和测序。
[0137]
实验室流程
[0138]
引子以通用和t7连接子序列为尾，分为八管(igh-vj、igh-dj、igk-vj-kde、内含子kde、trb-vj、trb-dj、trg、trd)。pcr方案总结在表4中。通过两步pcr制备测序资料库，每个资料库使用100纳克诊断dna和10纳克多克隆dna，最终反应体积为50微升。对于cit-qc，将9种不同细胞系各40个细胞当量的基因组dna添加到所有样品中。mgcl2的最终浓度为1.5mm，但需要对某些管进行优化。因此，第一次pcr的预混液是管特异性的，但所有管的温度分布都是一致的。
[0139]
在第一轮pcr后，进行凝胶电泳以检查所有目标是否成功扩增。对于trb，特定pcr产物的凝胶提取在第二次pcr之前进行。
[0140]
除trb外，所有第一轮pcr产物均按1∶50稀释pcr产物，除非扩增子非常弱。trb、pcr产物和带有弱扩增子的pcr产物未经稀释使用。第二次pcr的主混合液和所有管的温度曲线都相同(表4)。第二次pcr的引子包含测序衔接子和测序索引(条形码序列)。每个库都使用了独特的正向和反向索引组合。在第二次pcr中扩增了3微升未稀释的trb pcr产物和1微升的1∶50稀释的igh、igk、trg和trd的pcr产物。
[0141]
表4：标准化pcr方案。(a)第一次和第二次pcr的反应条件。(b)pcr循环条件。
[0142]a[0143]
第一次pcr
[0144][0145]
反应体积：50μl
[0146]
第二次pcr
[0147][0148]
反应体积：50μl
[0149]b[0150]b[0151][0152]
在第二次pcr后，将来自一次运行的所有样品的产物以等摩尔比汇集到8个管式子池中，并通过凝胶萃取进行纯化(关于扩增子长度，见表5)。最后，子池被等分地汇集到一个最终池中。在illumina miseq测序仪上进行测序，使用2
×
250碱基对v2化学试剂，扩增子资料库终浓度为7pm，并添加10％phix对照以避免低复杂性数据库问题。
[0153]
表5：第二次pcr后pcr产物的平均大小(包含illumina测序转接子和条形码序列)。
[0154][0155]
生物信息学流程
[0156]
arrest/interrogate是本研究中使用的主要生物信息学平台，以及用于本工作特定方面的vidjil47和imgt48资源。在不接受任何不匹配的情况下执行解复用。片段用euroclonality ngs引子序列(修剪非扩增子序列，并用于基于cpt-qc的质量控制)注释，配对末端连接，去复制，免疫遗传学注释
48
，并分为重组类型(完整和不完整，以及其他特殊类型，如内含子kde重组)或“连接类”。从用于相对丰度的总片段计数中排除没有重组的片段。
[0157]
上述cit-qc序列是通过其免疫遗传注释在数据中鉴定的。他们的计数既用作“管内”对照，也用作每个引子组的标准化：总cit-qc细胞除以cit-qc总片段，所得因子用于将重组片段转换为细胞，这些细胞除以总输入细胞(在本例中为15,000)。如果cit-qc标准化后的丰度超过5％，则将鉴定的ig/tr序列定义为索引序列。
[0158]
arrest/interrogate可以跟踪连接的dnj 3来源，在v替换或正在进行的v到dj重组的情况下，序列在igh或trb克隆进化过程中保持稳定。来源由d的最后≤3nt(或ndn，如果没有可识别的d)、任何和所有n2个核苷酸以及连接点的j个核苷酸组成。所述来源可作为所有样品的单独免疫遗传特征，因此能够链接其他特征，例如克隆型。
[0159]
all mrd标记物鉴定检测的多中心验证
[0160]
接下来，针对多中心验证研究分析了50个all诊断样品(29个bcp-all和21个t-all)。五个参与实验室都收到了预配置的96孔板，其中包含每个目标不同的多重ngs引子组合(图4)。
[0161]
简言之，每个实验室生成了96个库(总共480个库)，并以47m读取的总输出进行测序。使用imgt种系测序
48
对arrest/interrogate
43
进行集中分析
–
使用vidjil
47
和imgt/v-quest
48
进行进一步分析和验证。总的来说，共鉴定出311个克隆性ig/tr重组(克隆型)，ngs的平均值为5.9(0-14)/样品(基于cit-qc的标准化后，ngs采用5％的阈值)，而桑格的平均值为5.0(0-14)/样品，而217个(45％)库通过这两种方法均未显示出高于阈值的克隆型。共有196/311(63％)个克隆型在ngs和桑格之间完全一致(图6)。ngs仅识别了63个索引序列，而52个ig/tr桑格序列未被arrest/interrogate指定为ngs索引序列。26个ngs pos/桑格阴性病例在各自的低通量方法中也显示出克隆pcr产物，但由于多克隆背景、混合序列或弱pcr产物，随后的桑格定序失败。在另外6个桑格neg/ngs pos案例中，低通量方法中缺少相应的引子。对于剩余的31个差异，无法找到桑格定序失败的技术解释
(在16/19q/ddpcr评估的病例中，通过aso-pcr确认了重组，在3/16亚克隆水平上确认了重组)。
[0162]
相反，当应用5％的ngs阈值时，桑格定序仅检测到52个克隆性ig/tr重组：对于5个序列(1个trg、2个trb-vj和2个igh-dj)，ngs引子集中不存在相关引子，在12个病例中未发现差异的解释。然而，在大多数不一致的病例(35/52)中，桑格鉴定的序列(7个trd、8个trb-vj、6个trg、4个trb-dj、2个igk-vj-kde、5个igh-vj、3个igh-dj)也可被ngs检测到，但丰度低于5％。在36/39例经q/ddpcr评估的病例中，14/36例在亚克隆水平上通过aso-pcr确认了重组，包括所有低ngs阳性序列。桑格定序和ngs之间的总体一致性(包括阴性数据库)为78％。
[0163]
在12/29b谱系all样品中，使用arrest/interrogate鉴定了显性克隆igh序列的进化。进化的克隆型与优势克隆型共享dnj来源，但重组的vnd部分不同。
[0164]
还通过对qc样品(cit-qc和cpt-qc)的标准化评估来分析测定性能。这表明实验室内和实验室间的一致性非常高，五个实验室之间没有统计学上的显着差异。
[0165]
用于mrd标记识别的中心sop的适当修改
[0166]
在多中心验证过程中，sop的适当修改在特定实验室作为平行动作进行测试。
[0167]
一步与两步pcr：euroclonality-ngs工作组决定使用两步pcr来实现测序转接子的切换并限制所需引子批次的总数，即使需要大量条形码序列也是如此。由于第一轮pcr产物没有条形码序列，这种方法阻碍了污染现象的识别。
[0168]
因此，在一个中心(巴黎)测试了一步pcr，作为实验室的替代方案，所述实验室能够维持较高数量的不同引子批次。一步法降低了污染风险，因此不仅有利于标记物识别，而且有利于mrd评估。标准操作程序显示在补充信息中。
[0169]
珠提取：在单一目标评估和验证阶段，与珠提取相比，特定trb扩增子的凝胶提取结果显示出更具体的资料库。然而，并非所有实验室都使用凝胶萃取，因此，在研究的后期阶段，还测试了所有数据库的珠纯化。纯化过程的优化导致了与资料库纯化类型无关的特异性阅读的可比性比率。
[0170]
不再向反应混合物中加入多克隆dna：将多克隆dna添加到每个反应中，以防止在缺乏特定重组的样品中形成过多的引子二聚体。然而，添加多克隆dna会改变样品多克隆背景的组成，并妨碍对免疫组库的分析。因此，我们对4个b样品和4个t细胞再生障碍样品进行了测试，结果表明添加cit-qc足以防止非特异性pcr产物的过度形成。
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