类芽孢杆菌及其在鸡粪好氧堆肥方面的应用的制作方法

1.本发明涉及微生物应用领域，具体涉及一种类芽孢杆菌及其在鸡粪好氧堆肥方面的应用。


背景技术：

2.堆肥是畜禽粪便无害化处理主要采用的方法之一，在有氧条件下畜禽粪便堆肥腐熟快于厌氧条件。好氧堆肥通过微生物代谢分解粪便中有机物质、灭活粪便中病原菌和寄生虫等有害物质达到无害化处理的目的，具有对粪污无害化处理比较彻底、粪便养分资源化利用、经济效益好等优点，已成为我国畜禽粪便资源化利用的主流技术。但目前好氧堆肥仍存在升温缓慢、周期较长、养分损失严重和臭气挥发严重等问题，其中氨气的挥发导致堆体氮素大量损失，堆肥效率和品质有待进一步提高。由于粪便中有机物分解转化是由微生物驱动的，堆肥也是由细菌、真菌和放线菌微生物群体相互协同完成的发酵过程，所以堆肥也受微生物影响和调控。外源添加微生物菌剂可以通过提高初期堆料中的有益微生物的总数，加快堆肥腐熟，缩短堆肥反应的周期，减少氮素损失等进一步强化堆肥过程。但目前微生物菌剂在堆肥方面的应用研究还处于起步阶段，缺乏功效强的产品。
3.而有关类芽孢杆菌paenibacillus主要为植物固氮和生防方面的研究，没有应用于鸡粪堆肥发酵中的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种类芽孢杆菌及其在鸡粪好氧堆肥方面的应用，本发明筛选得到的类芽孢杆菌，并用该类芽孢杆菌研制复合微生物菌剂，该应用于鸡粪堆肥，提高鸡粪堆肥效率和品质，减少氨气挥发和氮素损失。
5.为实现上述目的，本发明所设计一种类芽孢杆菌，所述类芽孢杆菌为饲料类芽孢杆菌(paenibacillus pabuli)5-1或台中类芽孢杆菌(paenibacillus taichungensis)6-6，所述饲料类芽孢杆菌 (paenibacillus pabuli)5-1的保藏编号为cctcc no：m 2021574，所述台中类芽孢杆菌(paenibacillus taichungensis)6-6的保藏编号为cctcc no：m2021575。
6.本发明还提供了一种组合菌，所述组合菌包括权利要求1所述饲料类芽孢杆菌(paenibacillus pabuli)5-1和台中类芽孢杆菌 (paenibacillus taichungensis)6-6。
7.本发明还提供了一种上述类芽孢杆菌或上述组合菌在鸡粪好氧堆肥处理中的应用。
8.本发明还提供了一种用于鸡粪好氧堆肥处理的菌剂，所述菌剂为单一菌剂或者复合菌剂，其中，
9.所述单一菌剂为饲料类芽孢杆菌(paenibacillus pabuli)5-1菌液或台中类芽孢杆菌(paenibacillus taichungensis)6-6菌液；
10.所述复合菌剂为饲料类芽孢杆菌(paenibacillus pabuli)5-1液、台中类芽孢杆
菌(paenibacillus taichungensis)6-6液、红球菌atcc 21521(购自上海复祥生物公司)的菌液和酿酒酵母y2(专利 zl201910455462.5中所公开用的酿酒酵母菌)的菌液的任意多种的组合。
11.进一步地，所述菌剂中，总活菌数量为106～10
20
个/ml。
12.再进一步地，所述菌剂为复合菌剂，所述复合菌剂为饲料类芽孢杆菌(paenibacillus pabuli)5-1菌液、台中类芽孢杆菌 (paenibacillus taichungensis)6-6菌液、红球菌atcc 21521菌液和酿酒酵母y2菌液的组合。
13.再进一步地，所述复合菌剂中，饲料类芽孢杆菌(paenibacilluspabuli)5-1、台中类芽孢杆菌(paenibacillus taichungensis)6-6、红球菌atcc 21521和酿酒酵母y2的活菌数量比：2:2:2:1。
14.本发明还提供了一种上述用于制备鸡粪好氧堆肥的菌剂的制备方法，包括以下步骤：
15.1)饲料类芽孢杆菌(paenibacillus pabuli)5-1或台中类芽孢杆菌(paenibacillus taichungensis)6-6分别接种到新鲜的液态培养基中进行培养，得到细菌悬液；
16.2)将制得的细菌悬液离心获取细菌沉淀，用磷酸盐缓冲液pbs 重悬细菌沉淀，得到微生态制剂，即为单一菌剂；其中，单一菌剂中总活菌数量为106～10
20
个。
17.本发明提供了一种用于制备鸡粪好氧堆肥的菌剂的制备方法，包括以下步骤：
18.1)饲料类芽孢杆菌(paenibacillus pabuli)5-1、台中类芽孢杆菌(paenibacillus taichungensis)6-6、红球菌atcc 21521和酿酒酵母y2分别接种到新鲜的液态培养基中进行培养，得到细菌悬液；
19.2)将制得的细菌悬液离心获取细菌沉淀，用磷酸盐缓冲液pbs 重悬细菌沉淀，按活菌悬液的活菌数量比混合均匀，得到微生态制剂，即为复合菌剂；其中，每毫升微生态制剂中总活菌数量为106～ 10
20
个。
20.本发明还提供了一种上述菌剂在鸡粪好氧堆肥处理中的应用。
21.本发明的有益效果：
22.本发明筛选类芽孢杆菌分别为饲料类芽孢杆菌(paenibacilluspabuli)5-1或台中类芽孢杆菌(paenibacillus taichungensis)6-6；两株类芽孢杆菌产纤维素酶、淀粉酶能力高，除nh3能力强，用该菌制作的复合菌剂可用于畜禽粪便堆肥，可提高堆体温度和种子发芽指数、加速堆肥腐熟、促进堆肥铵态氮向硝态氮转化、显著降低堆体氮损失和总养分流失、提高堆肥有机质含量和产品质量。
附图说明
23.图1为饲料类芽孢杆菌5-1和台中类芽孢杆菌6-6菌落形态图，
24.图中，a为饲料类芽孢杆菌5-1菌落形态图，b为台中类芽孢杆菌6-6菌落形态图；
25.图2为饲料类芽孢杆菌5-1及其相关菌株的基于16s rdna测序基因序列的系统发育树；
26.图3为台中类芽孢杆菌6-6及其相关菌株的基于16s rdna测序基因序列的系统发育树；
27.图4为饲料类芽孢杆菌5-1和台中类芽孢杆菌6-6降解淀粉透明圈；
28.图5为饲料类芽孢杆菌5-1和台中类芽孢杆菌6-6降解纤维素透明圈；
29.图6为添加不同菌株组在鸡粪中铵态氮及硝态氮含量变化图；
30.图6中，a为各组中铵态氮变化，b为各组中硝态氮变化；
31.图7为鸡粪自然堆肥和接种微生物复合菌剂在堆肥过程中温度变化曲线图；
32.图8为鸡粪自然堆肥和接种微生物复合菌剂在堆肥过程中发芽种子生长情况图；
33.图9为鸡粪自然堆肥和接种微生物复合菌剂在堆肥过程中发芽指数变化曲线图；
34.图10为鸡粪自然堆肥和接种微生物复合菌剂在堆肥过程中脲酶酶活变化图。
具体实施方式
35.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
36.实施例1类芽孢杆菌的分离和鉴定
37.1.菌株的分离
38.使用阿须贝氏培养基从自然堆肥样品中分离、筛选、鉴定得到两株类芽孢杆菌。
39.2.菌体的形态特征和生理生化特性
40.上述菌株5-1单菌落特征(见图1a)：直径2.2mm，菌落形态圆形，菌落表面凸透镜状凸起，质地湿润，边缘光滑圆润，菌落颜色白色、不透明，革兰氏染色阳性。
41.上述菌株5-1生理理化特性：适宜生长温度25℃～55℃，最适生长温度35℃，可以产淀粉酶和纤维素酶，可以利用葡萄糖、甘露醇作为碳源。
42.上述菌株6-6的主要特征如下为(见图1b)：菌落直径1.9mm，菌落形态点状，菌落表面凸透镜状凸起，质地湿润，边缘光滑圆润，菌落颜色乳白色、不透明，革兰氏染色阳性。
43.上述菌株6-6生理理化特性：适宜生长温度25℃～55℃，最适生长温度45℃，可以产淀粉酶和纤维素酶，可以利用葡萄糖、甘露醇作为碳源，菌株生理生化鉴定结果(见表1)。
44.表1菌株生理生化鉴定
[0045][0046]
3.16s rdna序列分析
[0047]
扩增获得的菌株序列在ncbi上用blast与genbank数据库序列进行比对，比对结果及相似性比较：
[0048]
分离的菌株5-1的16s rdna序列与已知序列的同源性达到 99％采用最大简约法经过1000次自展分析得到系统发育树(见图 2)。分离的菌株6-6的16s rdna序列与已知序列的同源性达到99％采用最大简约法经过1000次自展分析得到系统发育树(见图3)。测序分析结果结合形态特征、染色镜检以及生理生化结果，最终确定所分离两菌株均为类芽孢杆菌。
[0049]
上述两个菌株按照常规甘油管保藏方法保藏，于2021年5月 21日送至中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：paenibacillus pabuli 5-1，保藏编号分别为cctcc no： m 2021574；
[0050]
paenibacillus taichungensis 6-6，cctcc no：m2021575。
[0051]
实施例2饲料类芽孢杆菌(paenibacillus pabuli)5-1和台中类芽孢杆菌(paenibacillus taichungensis)6-6降解能力分析
[0052]
将饲料类芽孢杆菌(paenibacillus pabuli)5-1(简写为菌株5-1) 和台中类芽孢杆菌(paenibacillus taichungensis)6-6(简写为菌株 6-6)分别点种到淀粉酶培养基和羧甲基纤维素钠培养基，每个菌株作3个重复，37℃培养24～48h。
[0053]
测量菌落和透明圈的直径，取其平均值，比值与酶活大小呈一定正比关系，从而比较菌株产酶活能力，计算出透明圈直径和菌落直径之比，
[0054]
如表2、图4、图5所示：将菌株5-1和菌株6-6在淀粉酶平板和纤维素酶平板上均有水解圈产生，表明菌株5-1和菌株6-6均能产生淀粉酶和纤维素酶。这些降解酶能够促进淀粉和纤维素的降解，缩短鸡粪堆肥发酵时间。菌株5-1和菌株6-6产淀粉酶酶活及纤维素酶酶活能力高，可以作为堆肥高效降解能力复合菌剂中的菌株。
[0055]
表2菌株产酶酶活
[0056][0057]
实施例3探究菌株适宜生长温度
[0058]
在堆肥过程中会经历升温期、高温期和降温期不同温度，故将各菌株分别在25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、70℃环境下进行培养，探究各菌株可生长温度及最适生长温度。
[0059]
结果表明：菌株5-1适宜生长温度25℃～55℃，最适生长温度 35℃。菌株6-6适宜生长温度25℃-55℃，最适生长温度45℃。
[0060]
表3各菌株可生长温度范围及最适宜生长温度
[0061][0062]
实施例4探究菌株除氨能力
[0063]
因鸡粪中含有大量铵根离子，故在堆肥过程中使用的微生物需要能适应含高铵根离子环境。将菌株接种至含10％nh
4
培养基中，观察菌株是否能在高铵根离子环境下生长，
[0064]
结果如表4所示：菌株5-1、菌株6-6和红球菌atcc 21521(简称菌株atcc 21521，其购自上海复祥生物公司)能生长。
[0065]
表4高nh4 环境菌株生长状况
21521、菌株y2 具有除氨能力(其中酿酒酵母y2为发明专利zl201910455462.5 中所公开的酿酒酵母菌，具有较强的除氨能力)。
[0083]
由于该菌剂组成中添加了酵母菌，故采用统计od
600
比较菌液含菌量。如表6，根据平均极差r结果发现影响复合菌剂中活菌数的主次顺序为c(红球菌atcc 21521)》b(台中类芽孢杆菌6-6)》a (饲料类芽孢杆菌5-1)》d(酿酒酵母y2)，最终确定复合菌剂最优组成为5-1:6-6:atcc 21521:y2＝2:2:2:1。
[0084]
表6复合菌剂正交试验
[0085][0086]
注：a为饲料类芽孢杆菌5-1；b为台中类芽孢杆菌6-6；c为红球菌atcc 21521； d为酿酒酵母y2。
[0087]
实施例8复合菌剂在鸡粪好氧堆肥中的应用效果
[0088]
将鸡粪与锯末按6：1比例充分混合，调节堆肥c/n比为25： 1左右，含水率为50％-60％。按堆体体积的1％进行喷洒添加复合菌剂ab(其为上述复合菌剂最优组成，以下简称ab)，在高280 mm、长540mm、宽400mm，容积60l，厚度3mm的eps泡沫箱中进行堆肥发酵，堆肥周期为14d，另设置不接种菌剂的对照 ck组。通过堆肥温度变化、碳氮比、种子发芽指数判定堆肥的腐熟度。
[0089]
(1)复合菌剂对堆体温度的影响
[0090]
温度是从表观上直接呈现堆肥进程的指标，整个堆肥过程主要分为四个阶段：升
温期、高温期、降温期和腐熟期。堆肥前期堆体中易分解的有机物在微生物作用下快速分解，使得堆体温度快速上升。
[0091]
如图7所示：在为期14d鸡粪好氧堆肥中，各组初始温度均在 15.0℃左右，环境温度保持在15-20℃之间，随着堆肥时间延长可以明显看到温度变化趋势，在第1d时各组温度均高于55℃进入高温期阶段。添加复合菌剂组明显提高了堆体温度，复合菌剂ab 组在第1d温度达到60.5℃，且试验组高温期及降温期温度均高于对照组，而不添加菌剂ck组温度第1d达到60℃，堆肥第二天 ab组温度显著高于对照ck组。一般认为反应器好氧堆肥温度达到50.0℃以上并在高温期保持3d左右就能基本达到无害化处理标准。高温期持续到第3d后进入降温期，高温期温度较高，持续时间较短，在第8d后各组温度趋于稳定与环境温度相近，整个堆肥过程在第14d结束。
[0092]
以上说明添加复合菌剂ab明显促进了有机物的降解，提高堆体温度，有利于加快堆肥腐熟进程。
[0093]
(2)复合菌剂显著提高种子发芽指数，加速堆肥腐熟
[0094]
种子发芽指数是判断堆肥腐熟度的生物学指标，能直观反映堆肥产品腐熟程度。本试验使用白菜种子在避光、室温(武汉冬季12 月份，室内温度20℃左右)环境下培养，各组种子生长情况如图8，可以明显看到堆肥样品对植物毒性逐渐降低趋势，堆肥0d种子基本不发芽，添加菌剂组从第4d开始根长生长变化明显，ck组从第7d开始根长生长变化明显。结合表7、图9所示，各试验组 gi值呈上升趋势。
[0095]
与对照组相比，添加复合菌剂ab可以改善发芽指数变化，在堆肥第4d时添加菌剂组gi》50.00％达到基本腐熟，且第7d gi值为75.29％符合国家标准ny/t 3442-2019对堆肥产物要求 gi≥70.00％，而ck组未达到腐熟(gi值为47.89％)。接种复合菌剂ab可以改善发芽指数的变化，降低堆肥对植物毒害性，加速堆肥腐熟进程，改善堆肥产品品质。
[0096]
表7各组种子发芽指数
[0097][0098]
(3)复合菌剂对堆体脲酶酶活的影响：
[0099]
试验结果(见图10)表明添加菌剂组在整个堆肥过程中脲酶酶活极显著低于空白组(p《0.001)，且呈现降低趋势，最低时达3.554 mg(nh
3-n)
·
g-1
·
24h-1
，更有利于抑制氨的挥发。上述结果表明添加复合菌剂ab可降低脲酶酶活，推测可能具有抑制氨挥发的潜能。
[0100]
(4)添加复合菌剂显著降低堆体氮损失(铵态氮、硝态氮、总氮变化)
[0101]
水溶性铵态氮、硝态氮的变化是粪便堆肥中氮素变化的重要参数指标。各试验组
中铵态氮含量总体呈现出先上升后下降的趋势，硝态氮含量整体呈现上升趋势，这是由于含氮有机物氨化后生成大量铵态氮，进而一部分铵态氮在高温环境下生成氨挥发，一部分铵态氮进一步转化为硝态氮。在堆肥结束时，ck组、复合菌剂ab 组铵态氮含量分别为4.389g/kg、3.032g/kg，ck组、复合菌剂ab 组硝态氮含量分别为0.277g/kg、0.482g/kg，相比于对照组，添加菌剂组的铵态氮含量降低、硝态氮含量增加，这说明接种菌剂组均一定程度上促进了铵态氮向硝态氮转化，使得最终硝态氮含量均高于ck组。
[0102]
总氮含量变化可判断堆肥过程中氮素损失程度。堆肥开始时氮的损失可能是由于堆肥温度升高导致氨挥发掉。如表8，可以看到堆肥结束时ck组、复合菌剂ab组氮损失率分别为45.47％、 37.61％。复合菌剂ab组的氮损失率低，这可能是因为堆体中氮素转化为氨挥发少，从而起到保氮作用，接种复合菌剂ab组降低了最终堆肥产品的氮损失。
[0103]
结合之前的低脲酶酶活结果，表明添加复合菌剂ab可降低脲酶酶活可抑制氨挥发，从而降低堆肥过程中的氮损失(图6)。
[0104]
表8各组最终氮含量相对于堆肥初期氮含量后的氮损失率
[0105][0106]
(5)添加复合菌剂提高有机质含量，显著降低养分流失
[0107]
根据国标(ny525-2020)测定第14d堆肥结束时各组样品的有机质、腐殖质含量以及碳氮比和总养分质量分数，比较堆肥产品质量，结果如表9，可以看到接种复合菌剂ab组有机质、腐殖质含量和总养分均高于ck组。ck组、复合菌剂组有机质含量质量分数分别为82.974％、86.544％，腐殖质含量分别为64.17％、66.93％，复合菌剂ab组相对于空白组有机质含量质量分数差异显著 (p《0.05)。通过测定tn、p2o5、k2o，计算总和得到堆肥产品总养分，各组均＞4％符合国家标准，堆肥产物总养分复合菌剂ab组可达到5.315％，显著高于ck组(p《0.05)，这说明接种复合菌剂ab 可一定程度上减少堆体中总养分流失。上述结果表明复合菌剂ab 可提高堆肥产品的质量，保留总养分。
[0108]
表9堆肥产物理化性质
[0109][0110]
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。