染色体重排的方法与流程

染色体重排的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年6月19日提交的美国临时专利申请号62/863,829的优先权，其全部内容在此参考并入。
发明领域
3.本发明一般地涉及基因组编辑。更具体地，本发明涉及产生具有染色体重排(如染色体易位或倒位)的细胞的方法。


背景技术：

4.基因组编辑或基因组工程允许人类操作以插入、缺失、修改或替代活生物体基因组中的dna。通常，基因组编辑方法使用工程化核酸酶，如锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)和crispr/cas系统，以在基因组中的所需位置形成位点特异性双链断裂。然后通过非同源末端连接(nhej)或同源重组(hr)修复诱导的双链断裂，从而在基因组中的所需位置进行dna插入、缺失、修饰或替代。
5.染色体重排是一种涉及天然染色体结构变化的突变类型，包括缺失、复制、易位和倒位。使用当前的基因组编辑技术产生具有所需染色体重排的细胞一直是一个挑战。需要开发新方法来产生所需的染色体重排。


技术实现要素：

6.在一个方面中，本公开内容提供了一种用于生产基因组修饰的细胞的方法。在一个实施方式中，所述方法包括向细胞中引入：(1)靶向第一染色体中的第一位点的第一位点特异性核酸酶，所述第一位点将所述第一染色体分成所述第一染色体的第一区段和第二区段，(2)靶向第二染色体中的第二位点的第二位点特异性核酸酶，所述第二位点将所述第二染色体分成所述第二染色体的第一区段和第二区段，和(3)依次包含以下的供体dna：5’同源臂，选择区，和3’同源臂，其中所述5’同源臂与在所述第一位点侧翼的所述第一染色体的所述第一区段中的区域同源，并且其中所述3’同源臂与在所述第二位点侧翼的所述第二染色体的所述第二区段中的区域同源。所述方法还包括产生中间细胞，所述中间细胞包含依次包含以下的中间融合染色体：所述第一染色体的所述第一区段，所述选择区，和所述第二染色体的所述第二区段。所述方法还包括向所述中间细胞中引入分别靶向第三位点和第四位点的第三和第四位点特异性核酸酶或位点特异性重组酶，其中所述第三位点和所述第四位点位于所述选择区侧翼，从而产生包含融合染色体的细胞，所述融合染色体包含与所述第二染色体的所述第二区段的至少一部分连接的所述第一染色体的所述第一区段的至少一部分。
7.在另一个实施方式中，所述方法包括：向细胞中引入：(1)靶向染色体中的第一位点的第一位点特异性核酸酶，(2)靶向所述染色体中的第二位点的第二位点特异性核酸酶，其中所述第一位点和所述第二位点将所述染色体依次分成第一区段、第二区段和第三区
段，(3)依次包含以下的供体dna：5’同源臂，选择区，和3’同源臂，其中所述5’同源臂与在所述第一位点侧翼的所述第一区段中的区域同源，并且其中所述3’同源臂反向地与在所述第二位点侧翼的所述第二区段中的区域同源。所述方法还包括产生中间细胞，所述中间细胞包含依次包含以下的中间融合染色体：所述第一区段，所述选择区，和所述第二区段，当与在所述染色体中的其方向相比时，所述第二区段颠倒了其方向。所述方法还包括向所述中间细胞中引入靶向第三位点和第四位点的第三和第四位点特异性核酸酶或位点特异性重组酶，其中所述第三位点和所述第四位点位于所述选择区侧翼，从而产生包含融合染色体的细胞，所述融合染色体包含与所述第二区段的至少一部分连接的所述第一区段的至少一部分，其中所述第二区段在所述染色体中的方向与其原来的方向相比是颠倒的。
8.在某些实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。
9.在某些实施方式中，所述第一位点特异性核酸酶、所述第二位点特异性核酸酶、所述第三位点特异性核酸酶和所述第四位点特异性核酸酶中的任一种是锌指核酸酶(zfn)、基于转录激活因子样效应物的核酸酶(talen)、crispr/cas蛋白或大范围核酸酶。
10.在某些实施方式中，所述选择区包含正选择标志物，如嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟素s抗性基因或荧光基因。
11.在某些实施方式中，所述选择区还包含负选择标志物，如胸腺嘧啶激酶基因。
12.在某些实施方式中，所述位点特异性重组酶是cre重组酶、flp重组酶或整合酶。
13.在另一个方面中，本公开内容提供了一种根据本文所述的方法生产的基因组修饰的细胞。
附图说明
14.以下附图构成本说明书的一部分并且被包括以进一步展示本公开内容的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合在本文中呈现的具体实施方式的详细描述，可以更好地理解本公开内容。
15.图1显示了用于产生具有染色体易位的基因组修饰细胞的示例性方法。
16.图2显示了用于产生具有染色体缺失的基因组修饰细胞的示例性方法。
17.图3显示了用于产生具有染色体倒位的基因组修饰细胞的示例性方法。
18.图4显示了供体dna的示例性实施方式。
19.图5显示了检测基因组修饰细胞中eml4-alk融合蛋白表达的蛋白质印迹(western blot)结果。
具体实施方式
20.在更详细地描述本公开内容之前，应当理解的是，本公开内容不限于所描述的特定实施方式，并且因此当然可以变化。还应当理解的是，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而无意于限制本发明，因为本公开内容的范围将仅由所附权利要求所限定。
21.除非另外定义，否则本技术使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本技术所述的那些类似或等同的任何方法和材料也可以用于实施或检测本公开内容，但是目前描述的是优选的方法和材料。
22.本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本技术，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指出通过引用并入并且通过引用并入本技术以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是针对其在申请日之前公开的内容，并且不应将其解释为承认由于在先的公开使得本公开内容无权先于此类出版物。此外，所提供的公开日期可能与实际公开日期是不同的，所述实际公开日期可能需要单独确认。
23.本领域技术人员在阅读本公开内容之后将是显而易见的是，本技术所描述和示出的每个单独的实施方式具有离散的组件和特征，在不脱离本公开内容的范围或主旨的前提下，其可以容易地与任意其他若干实施方式的特征分离或组合在一起。任何列举的方法可以按照事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。
24.定义
25.如在本技术中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数形式。
26.在本公开内容中值得注意的是，诸如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”等的术语是包容性的或开放式的，并且不排除附加的、未列举的要素或方法步骤。诸如“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”和“基本上由
……
组成(consists essentially of)”的术语允许包含不会对要求保护的发明的基本和新颖特征产生实质性影响的附加成分或步骤。术语“由
……
组成(consists of)”和“由
……
组成(consisting of)”是封闭式的。
27.如在本技术中所使用的，“细胞”可以是原核细胞或真核细胞。原核细胞包括例如细菌。真核细胞包括例如真菌、植物细胞和动物细胞。动物细胞(例如，哺乳动物细胞或人细胞)的类型包括例如来自循环/免疫系统或器官的细胞(例如，b细胞、t细胞(细胞毒性t细胞、自然杀伤t细胞、调节性t细胞、t辅助细胞)、自然杀伤细胞、粒细胞(例如，嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和多叶核嗜中性粒细胞)、单核细胞或巨噬细胞、红细胞(例如，网织红细胞)、肥大细胞、血小板或巨核细胞和树突状细胞)；来自内分泌系统或器官的细胞(例如，甲状腺细胞(例如，甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺细胞(例如，甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞)，肾上腺细胞(例如，嗜铬细胞)和松果体细胞(pineal cell)(例如，松果体细胞(pinealocyte))；来自神经系统或器官的细胞(例如，成胶质细胞(例如，星形胶质细胞和少突胶质细胞)、小胶质细胞、巨细胞神经分泌细胞、星状细胞，伯特歇尔(boettcher)细胞和垂体细胞(例如，促性腺激素细胞、促肾上腺皮质激素细胞、促甲状腺素细胞、促性腺激素细胞和催乳激素细胞))；来自呼吸系统或器官的细胞(例如，肺细胞(i型肺细胞和ii型肺细胞)、克拉拉(clara)细胞、杯状细胞、肺泡巨噬细胞)；来自循环系统或器官的细胞(例如，心肌细胞和周细胞)；来自消化系统或器官的细胞(例如，胃主细胞、壁细胞、杯状细胞、潘氏(paneth)细胞、g细胞、d细胞、ecl细胞、i细胞、k细胞、s细胞、肠内分泌细胞、肠嗜铬细胞、apud细胞、肝脏细胞(例如，肝细胞和枯否(kupffer)细胞))；来自表皮系统或器官的细胞(例如，骨细胞(例如，成骨细胞、骨细胞和破骨细胞)、牙齿细胞(例如，成牙骨质细胞和成釉细胞)、软骨细胞(例如，成软骨细胞和软骨细胞)、皮肤/毛发细胞(例如，毛细胞、角质形成细胞和黑素细胞(痣细胞))、肌肉细胞(例如，肌细胞)、脂肪细胞、成纤维细胞和肌腱细胞)；来自泌尿系统或器官的细胞(例如，足细胞、肾小球旁细胞、肾小球内系膜细
胞、肾小球外系膜细胞、肾近端小管刷状缘细胞和致密斑细胞)，以及来自生殖系统或器官的细胞(例如，精子、睾丸支持细胞、睾丸间质细胞、卵子和卵母细胞)。细胞可以是正常的、健康细胞；或者患病的或不健康的细胞(例如，癌细胞)。细胞还包括哺乳动物受精卵或干细胞，其包括胚胎干细胞、胎儿干细胞、诱导多能干细胞和成体干细胞。干细胞是能够经历细胞分裂周期，同时保持未分化状态并分化成特化细胞类型的细胞。干细胞可以是全能干细胞、多能干细胞(pluripotent stem cell)、多潜能干细胞(multipotent stem cell)、寡能干细胞和单能干细胞，其中任何一种都可以从体细胞诱导。干细胞还可以包括癌症干细胞。哺乳动物细胞可以是啮齿动物细胞，例如小鼠、大鼠、仓鼠细胞。哺乳动物细胞可以是兔形目细胞，例如兔细胞。哺乳动物细胞也可以是灵长类动物细胞，例如人细胞。
28.在本技术中使用的术语“染色体”是指具有生物体的部分或全部遗传物质或基因组的dna分子。在哺乳动物中，典型的染色体有几亿个dna碱基对。
29.如本文所用，“染色体重排”指涉及天然染色体结构变化的突变或染色体异常。通常，染色体重排事件的突变涉及一大段dna序列的变化，至少有数百千碱基对(kb)。如本文所用，染色体重排的基因组工程方法所涉及的一条染色体或一段染色体，是指至少具有数百kb dna的染色体的连续部分。染色体重排可能涉及几种不同类别的事件，例如缺失、复制、倒位和易位。在自然界中，染色体重排通常发生在一条或两条染色体在两个不同位置断裂，随后断裂的末端重新连接以产生新的基因染色体排列时，这与染色体断裂前的基因顺序不同。
30.术语“互补性”或“互补的”用于指代碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸碱基根据碱基配对规则匹配(例如，10个中的5、6、7、8、9、10个是50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)，或者核酸之间可以存在“完全”或“总体”互补性。核酸链之间的互补程度对其彼此杂交的效率和强度有显着影响。
31.术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且指任意长度核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任意三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运rna、核糖体rna、核酶、cdna、shrna、单链的短链或长链rna、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、控制区、任何序列的分离的rna、核酸探针和引物。核酸分子可以是线形的或环状的。
32.如在本技术中所使用的，“核酸酶”是能够切割核酸的核苷酸亚基之间的磷酸二酯键的酶。“位点特异性核酸酶”是指其功能取决于特定核苷酸序列的核酸酶。通常，位点特异性核酸酶识别并结合特定的核苷酸序列并切割核苷酸序列内的磷酸二酯键。在某些实施方式中，使用位点特异性核酸酶通过位点特异性切割产生双链断裂。位点特异性核酸酶的实例包括但不限于锌指核酸酶(zfn)，转录激活因子样效应物核酸酶(talen)、大范围核酸酶和crispr(成簇规则间隔短回文重复序列)相关的(cas)核酸酶。
33.位点特异性核酸酶通常含有dna结合结构域和dna切割结构域。例如，zfn含有通常包含3-6个独立的锌指重复序列的dna结合结构域和由用于dna切割的foki限制性酶组成的核酸酶结构域。zfn的dna结合结构域可以识别9至18个碱基对。在含有tale结构域和dna切割结构域的talen的实例中，tale结构域含有除了第12和第13个氨基酸之外重复的高度保守的33-34个氨基酸序列，第12和第13个氨基酸的变化显示与特异性核苷酸识别有强相关
性。又例如，典型的cas核酸酶cas9由n末端识别结构域和c-末端的两个内切核酸酶结构域(ruvc结构域和hnh结构域)组成。
34.在通常情况下，“蛋白”是多肽(即，通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸串)。蛋白可以包括除氨基酸以外的部分(例如，可以是糖蛋白)和/或可以以其他方式加工或修饰。本领域技术人员将意识到“蛋白”可以是由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或可以是其功能部分。本领域技术人员还将意识到有时蛋白可以包含一条以上多肽链，例如其通过一个或多个二硫键连接或以其他方式缔合。
35.如在本技术中所使用的，术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”指促进特定靶位点之间的dna重排的高度特化的酶家族(esposito d和scocca jj,nucleic acids research(1997)25:3605-3614；nunes-duby se等，nucleic acids research(1998)26:391-406；stark wm等，trends in genetics(1992)8:432-439)。实际上，所有位点特异性重组酶都可以归类为两个结构和机制不同的组之一：酪氨酸(例如，cre、flp和λ整合酶)或丝氨酸(例如，phic31整合酶、bxb1整合酶、γ-δ解离酶、tn3解离酶和gin转化酶)重组酶。这两个重组酶家族均识别由两个反向重复结合元件组成的靶位点，这些结合元件位于发生dna断裂和重新连接的间隔序列的侧翼。重组过程需要两个重组酶单体同时结合到每个靶位点：两个dna结合的二聚体(四聚体)，然后连接以形成突触复合物，导致交叉和链交换。
36.如本文所用，“选择标志物”是指其在细胞中的表达允许细胞在特定培养条件下被富集或耗竭的基因。选择标志物可以是外源基因或非天然表达的细胞基因，或者在靶细胞群中天然表达但水平不适当的此类基因。如果基因的表达允许细胞在特定条件下被富集，则选择标志物就是“正选择标志物”。通常，正选择标志物是编码抗生素抗性的基因，并且选择表达选择标志物的那些细胞包括将抗生素引入培养物中。在使用中，抗生素的应用选择性地杀死或消融不表达标志物的细胞，留下就表达抗生素抗性的细胞而言被纯化或富集的细胞群。正选择标志物的实例包括氨基糖苷磷酸转移酶(新霉素抗性基因)、嘌呤霉素-n-乙酰转移酶(嘌呤霉素抗性基因)、潮霉素抗性基因和杀稻瘟素s脱氨酶(杀稻瘟素s抗性基因)。正选择标志物的其他实例包括可用于通过细胞分选进行选择的基因，例如，荧光蛋白和细胞表面标志物。相反，如果基因的表达允许细胞在特定培养条件下被耗尽，则选择标志物是“负选择标志物”。负选择标志物的实例包括胸苷激酶基因。在使用中，应用更昔洛韦通过胸苷激酶的表达杀伤细胞。负选择标志物的其他实例包括dt毒素、细胞死亡基因，如trail、半胱天冬酶和bcl2家族基因。
37.术语“顺序”用于描述两个多核苷酸序列时是指两个序列不重叠，而第一个序列可以位于第二个序列的上游(5')或下游(3')。
38.当在染色体或染色体重排的上下文中使用时，术语“位点”是指染色体中的特定核酸序列。
39.如在本技术中所使用的，术语“对象”或“个体”或“动物”或“患者”指需要诊断、预后、改善、预防和/或治疗疾病或病症(如病毒感染或肿瘤)的人或非人动物，包括哺乳动物或灵长类。哺乳动物对象包括人、家畜、农场动物以及动物园、运动或宠物动物，如犬、猫、豚鼠、家兔、大鼠、小鼠、马、猪、奶牛、熊等。
40.术语“靶点”或“靶向”，当在位点特异性核酸酶或位点特异性重组酶的上下文中使用时，指位点特异性核酸酶或位点特异性重组酶识别基因组或染色体中特定位置处的特定
核酸序列。在某些实施方式中，位点特异性核酸酶是zfn或talen。在这种情况下，zfn或talen靶向特定位点指zfn或talen识别该位点的特定核酸序列。在某些实施方式中，位点特异性核酸酶是crispr/cas蛋白。在这种情况下，引导序列(即，grna)被设计为在位点与特定核酸序列(即，靶序列)具有互补性，在该位点，靶序列与引导rna之间的杂交促进了crispr复合物的形成。
41.位点特异性核酸酶和位点特异性重组酶
42.本公开内容的方法涉及使用基因组编辑酶产生具有重排染色体的基因组修饰细胞。在某些实施方式中，基因组编辑酶包括但不限于位点特异性核酸酶(例如，cas9、zfn、talen和大范围核酸酶)和位点特异性重组酶(例如，cre、flp、λ整合酶、phic31整合酶、bxb1整合酶、γ-δ解离酶、tn3解离酶和gin转化酶)。
43.crispr(成簇规则间隔短回文重复序列)/cas系统最初是作为在原核细胞中的转录物和其他元件被发现的，其参与crispr相关的(“cas”)基因表达或指导其活性，其包括编码cas核酸酶的序列(切割核酸序列并产生双链断裂(dsb))、向导序列、反式激活crispr(tracr)序列、tracr-mate序列或来自crispr基因座的其他序列和转录物。在真核细胞中，crispr/cas系统包括crispr相关的核酸酶和小向导rna。靶dna序列(原型间隔区)包含“原型间隔区相邻基序”(pam)，这是一个被所使用的特定cas蛋白识别的短dna序列。在某些实施方式中，crispr系统包括i型、ii型和iii型crispr/cas系统，其分别包含蛋白cas3、cas9和cas10。
44.rna引导的核酸内切酶cas9是被广泛使用的ii型crispr系统的一个组分，其可在多种模型系统中产生基因特异性敲除。在本公开内容的一个实施方式中，crispr/cas核酸酶是“序列特异性核酸酶”。cas9异位表达和单一向导rna(grna)的引入足以导致在目标特异性基因组区域形成双链断裂(dsb)，从而通过非同源末端连接(nhej)途径导致插入缺失。插入缺失通常会导致移码突变，除非被插入/缺失的核苷酸数量是3的倍数。
45.与cas核酸内切酶一起，crispr实验需要引入包含大约15到30个碱基序列的向导rna，其特异性针对靶核酸(例如，dna)。设计用于靶向目标基因组区域的grna(例如，编码蛋白功能性结构域的特定外显子)将在编码蛋白的每个基因中产生突变。所得到的经修饰的基因组区域可以包含一个或多个变体，其每一个在突变中是不同的。例如，突变将导致具有所需修饰的修饰的基因组区域，和/或具有不需要的修饰的修饰的基因组区域。该方法已被广泛用于在各种模型系统中产生基因特异性敲除。在某些实施方式中，grna的长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。grna可以作为rna或通过转染具有与启动子可操作连接的grna编码序列的载体(例如，质粒)递送到真核细胞或原核细胞中。
46.在某些实施方式中，cas核酸酶和grna来源于相同物种。在某些实施方式中，例如，cas核酸酶来源于金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、松鼠葡萄球菌(staphylococcus sciuri)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、屎肠球菌(enterococcus faecium)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)、大肠杆菌(escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(streptococcus pyrogenes)、保加利亚乳杆菌(lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)、霍乱
弧菌(vibrio cholera)、木糖氧化无色杆菌(achromobacter xylosoxidans)、洋葱伯克霍尔德菌(burkholderia cepacia)、异型枸橼酸杆菌(citrobacter diversus)、弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)、滕黄微球菌(micrococcus leuteus)、奇异变形杆菌(proteus mirabilis)、普通变形杆菌(proteus vulgaris)、路邓葡萄球菌
47.(staphylococcus lugdunegis)、伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)、a群链球菌(streptococcus group a)、b群链球菌(streptococcus group b)、粘质沙雷菌(s.marcescens)、阴沟肠杆菌(enterobacter cloacae)、炭疽杆菌(bacillus anthracis)、百日咳杆菌(bordetella pertussis)、梭菌属(clostridium sp.)、肉毒杆菌(clostridium botulinum)、破伤风梭菌(clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheria)、莫拉(布兰汉氏)卡他莫拉菌(moraxalla(brauhamella)catarrhalis)、志贺杆菌(shigella spp.)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenza)、嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophili)、假单胞菌(pseudomonas perolens)、莓实假单胞菌(pseuomonas fragi)、脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)、梭杆菌属(fusobacterium sp.)、韦荣球菌属(veillonella sp.)、鼠疫耶尔森菌(yersinia pestis)和假结核耶尔森菌(yersinia pseudotuberculosis)。
48.可以使用任何本领域公知的软件设计grna，如target finder、e-crispr、casfinder和crispr optimal target finder。
49.在某些实施方式中，本技术所述的组合物包含编码cas核酸酶或grna的核酸，其中所述核酸包含在载体中。在一些实施方式中，所述组合物包含cas核酸酶蛋白和编码grna的dna。在一些实施方式中，所述组合物包含编码cas核酸酶的第一核酸和编码grna的第二核酸，其中第一核酸和第二核酸包含在一个载体中。在一些实施方式中，第一核酸和第二核酸包含在两个单独的载体中。在一些实施方式中，至少一个载体是病毒载体。在某些实施方式中，载体是aav载体。
50.锌指核酸酶(zfn)是一种人工限制性酶，其是通过将锌指dna结合结构域与dna切割结构域融合而产生的。可以对锌指结构域进行工程化以靶向特定的所需dna序列，其指导锌指核酸酶切割靶dna序列。通常，锌指dna结合结构域含有3至6个单独的锌指重复序列，可以识别9至18个碱基对。每个锌指重复通常包含约30个氨基酸，并且包含由锌离子稳定的ββα折叠。串联排列的相邻锌指重复序列通过接头序列连接在一起。已经开发了多种策略来设计锌指结构域以结合所需序列，包括“模块化组装”和采用噬菌体展示或细胞选择系统的选择策略(pabo co等，“design and selection of novel cys2his2 zinc finger proteins”annu.rev.biochem.(2001)70:313
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40)。生成新的锌指dna结合结构域的最直接方法是组合已知特异性的较小锌指重复序列。最常见的模块化组装过程包括组合三个独立的锌指重复序列，每个重复序列可以识别3个碱基对的dna序列，以生成一个可以识别9个碱基对靶位点的3-指阵列。其他程序可以利用1-指或2-指模块来产生具有6个或更多个单独锌指重复的锌指阵列。或者，已将选择方法用于产生能够靶向所需序列的锌指dna结合结构域。最初的选择工作利用噬菌体展示从大量部分随机化的锌指结构域中选择结合给定dna靶点的蛋白。最近的工作已利用酵母单杂交系统、细菌单杂交系统和双杂交系统以及哺乳动物细胞。一种选择新型锌指阵列的有前途的新方法利用细菌双杂交系统将预先选择的单个锌指重复序列库组合，每个重复序列都被选择以结合给定的三联体，然后利用第二轮选
择来获得能够结合所需9-bp序列的3-指重复序列(maeder ml等，“rapid
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open-source’engineering of customized zinc-finger nucleases for highly efficient gene modification”.mol.cell(2008)3:294
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301)。通常将来自ii型限制性核酸内切酶foki的非特异性切割结构域用作zfn中的切割结构域。该切割结构域必须二聚化才能切割dna，因此需要一对zfn来靶向非回文dna位点。标准zfn将切割结构域融合至每个锌指结构域的c末端。为了让两个切割结构域二聚化并切割dna，两个单独的zfn必须结合其c端相距一定距离的相反的dna链。锌指结构域和切割结构域之间最常用的接头序列要求每个结合位点的5’边缘间隔5到7bp。
51.转录激活因子样效应物核酸酶(talen)是一种人工限制性内切酶，其通过将转录激活因子样效应物(tale)dna结合结构域融合至dna切割结构域(例如，核酸酶结构域)制备，可以对其工程化以切割特定序列。tale是黄单胞菌属(xanthomonas)细菌当感染植物时通过其iii型分泌系统分泌的蛋白。tale dna结合结构域包含重复的高度保守的33-34个氨基酸序列，其中第12位和第13位氨基酸存在差异，其是高度可变的并且显示出与特定核苷酸识别的强相关性。氨基酸序列与dna识别之间的关系允许通过选择包含适当可变氨基酸的重复区段的组合来工程化特定的dna结合结构域。可以将来自foki核酸内切酶末端的非特异性dna切割结构域用于构建talen。foki结构域作为二聚体发挥作用，需要两个具有独特dna结合结构域的构建体，用于靶基因组中具有适当方向和间距的位点。参见boch j,nature biotechnology(2011)29:135
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6；boch j,science(2009)326:1509
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12；moscou mj和bogdanove aj,science(2009)326(5959):1501；juillerat a等，scientific reports(2015)5:8150；
52.christian等，genetics(2010)186:757
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61；li等，nucleic acids research(2010)39:1
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14。
53.大范围核酸酶是以大识别位点(12至40个碱基对的双链dna序列)为特征的脱氧核糖核酸内切酶。因此，被大范围核酸酶识别的位点通常在任何给定的基因组中只出现一次。例如，i-scei大范围核酸酶识别的18-碱基对序列平均需要人类基因组大小20倍的基因组才能偶然出现一次(尽管单个错配的序列在每个人类大小的基因组中出现大约3次)。因此，认为大范围核酸酶是最特异的天然存在的限制酶。
54.在大范围核酸酶中，laglidadg归巢核酸内切酶家族在过去15年中已成为研究基因组和基因组工程的宝贵工具。大范围核酸酶是“分子dna剪刀”，可用于以高度靶向的方式替代、消除或修饰序列。通过蛋白工程修改其识别序列，可以改变靶向序列。大范围核酸酶用于修饰所有基因组类型，无论是细菌、植物还是动物。其为创新开辟了广阔的道路，特别是在人类健康领域，例如消除病毒遗传物质或者使用基因疗法“修复”受损基因。
55.位点特异性重组酶指介导被酶识别的特定dna序列之间的位点特异性重组的酶家族。位点特异性重组酶的实例包括但不限于cre重组酶、flp重组酶、λ整合酶、γ-δ解离酶、tn3解离酶、sin解离酶、gin转化酶、hin转化酶、tn5044解离酶、tn3转座酶、睡美人转座酶、is607转座酶、bxb1整合酶、wbeta整合酶、bl3整合酶、phir4整合酶、a118整合酶、tg1整合酶、mr11整合酶、phi370整合酶、spbc整合酶、sv1整合酶、tp901-1整合酶、phirv整合酶、fc1整合酶、k38整合酶、phibt1整合酶和phic31整合酶。
56.基因组编辑的方法
57.本公开内容在一个方面提供了用于基因组编辑的方法，如染色体易位或倒位。在图1-3所示的实施方式中可以理解这些方法。
58.图1显示了用于产生具有染色体易位的基因组修饰细胞的示例方法。参考图1，该方法包括将至少第一位点特异性核酸酶、第二位点特异性核酸酶和供体dna 130引入细胞。所述第一位点特异性核酸酶靶向在染色110中的位点111。位点111将染色110分成区段112和区段113。所述第二位点特异性核酸酶靶向在染色120中的位点121。位点121将染色体120分成区段122和区段123。供体dna 130包括5’同源臂131、选择区132和3’同源臂133。5’同源臂131与位点111附近的区段112中的区域同源。3’同源臂133与位点121附近的区段123中的区域同源。选择区132包含至少一个正选择标志物。
59.如本技术所公开的，可以使用本领域公知的任何方法将位点特异性核酸酶引入细胞中。在某些实施方式中，可以将位点特异性核酸酶蛋白引入细胞中。在某些实施方式中，通过将编码位点特异性核酸酶的核酸序列插入细胞中，可以在细胞中表达位点特异性核酸酶。将核酸序列插入细胞的方法包括转染、转化和转导，其中核酸序列可以暂时存在于细胞中或可以掺入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体dna)，转化为自主复制子。将核酸序列转化入细胞的各种技术包括，例如：显微注射、逆转录病毒介导的基因转移、电穿孔、转染等(参见，例如，keown等，methods in enzymology 1990,185:527-537)。在一个实施方式中，通过病毒将核酸序列引入细胞中。
60.在某些实施方式中，第一和第二位点特异性核酸酶是crispr/cas蛋白，例如，cas9蛋白。在这种情况下，所述方法进一步包括将靶向位点111的第一引导rna和靶向位点121的第二引导rna引入细胞。
61.第一和第二位点特异性核酸酶在引入细胞后，分别在靶向位点111和靶向位点121处产生双链断裂。供体dna 130与染色体110和染色体120重组，产生中间融合染色体140，其包含区段112、选择区132和区段123。选择区132中正选择标记物的存在允许选择包含中间融合染色体140的细胞。
62.然后，将第三和第四位点特异性核酸酶引入细胞，分别在区段112中的位点141和区段123中的位点142产生双链断裂，其中位点141和位点142在选择区132侧翼。如在图1中所示，靶向位点141位于区段112内并且在区段112和选择区之间的连接位点处或附近。靶向位点142位于区段123内并且在区段123和选择区之间的连接位点处或附近。在某些实施方式中，靶向位点141距离区段112和选择区之间的连接位点约0-10kb(例如，约0kb、0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、5.5kb、6kb、6.5kb、7kb、7.5kb、8kb、8.5kb、9kb、9.5kb或10kb)。在某些实施方式中，靶向位点142距离区段123和选择区之间的连接位点约0-10kb(例如，约0kb、0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、5.5kb、6kb、6.5kb、7kb、7.5kb、8kb、8.5kb、9kb、9.5kb或10kb)。
63.在某些实施方式中，第三和第四位点特异性核酸酶两者均是crispr/cas蛋白，并且将分别靶向位点141和位点142的两个向导rna引入细胞，从而产生双链断裂。在某些实施方式中，将分别靶向位点141和位点142的两个zfn或两个talen引入细胞，从而产生双链断裂。由该对位点特异性核酸酶产生的区段112的至少一部分(区段114)和区段123的至少一部分(区段124)然后通过非同源末端连接而连接，产生包含区段114和区段124的重排染色体150。在某些实施方式中，选择区132还包含负选择标记物，例如，胸苷激酶，这允许选择重
排的染色体150，例如，在更昔洛韦存在的情况下。
64.在某些实施方式中，靶向位点141和靶向位点142的每一个均包含重组酶识别位点，其可以通过供体dna 130引入中间染色体。将位点特异性重组酶，例如，cre重组酶、flp重组酶和整合酶，例如，phic31整合酶引入细胞，以介导两个重组酶识别位点之间的重组，产生包含区段112和区段123的重排染色体150。
65.图2显示了用于产生具有染色体缺失的基因组修饰细胞的示例性方法。参见图2，所述方法包括将至少第一位点特异性核酸酶、第二位点特异性核酸酶和供体dna 220引入细胞。第一位点特异性核酸酶靶向染色体210中的位点211。第二位点特异性核酸酶靶向染色体210中的位点212。位点211和位点212将染色体210分成区段213、区段214和区段215。供体dna 220包含5’同源臂221、选择区222和3’同源臂223。5’同源臂221与位点211附近的区段213中的区域同源。3’同源臂223与位点212附近的区段215中的区域同源。选择区222包含至少一个正选择标志物。
66.在引入细胞后，第一和第二位点特异性核酸酶分别在位点211和位点212处产生双链断裂。供体dna 220与染色体重组，产生中间融合染色体230，其包含区段213、选择区222和区段215。在选择区222中存在正选择标志物允许选择包含中间融合染色体230的细胞。
67.与图1中所示的实施方式类似，第一和第二位点特异性核酸酶可以是靶向位点211和位点212的zfn或talen。或者，第一和第二位点特异性核酸酶是crispr/cas蛋白，并且所述方法还包括将分别靶向位点211和位点212的两个grna引入细胞。
68.然后，将第三和第四位点特异性核酸酶引入细胞，分别在位点231和位点232处产生双链断裂，其中位点231和位点232在选择区222侧翼。由该对位点特异性核酸酶产生的区段213的至少一部分(区段216)和区段215的至少一部分(区段217)然后通过非同源末端连接而连接，产生包含区段216和区段217的重排染色体240。或者，将位点特异性重组酶引入细胞，介导两个重组酶识别位点之间的重组，分别靠近位点231和位点232，通过供体dna 220引入中间染色体。在某些实施方式中，选择区222还包含负选择标志物，例如，胸苷激酶，这允许选择重排的染色体240，例如，在更昔洛韦存在的情况下。
69.图3显示了用于产生具有染色体倒位的基因组修饰细胞的示例性方法。参见图3，所述方法包括将至少第一位点特异性核酸酶、第二位点特异性核酸酶和供体dna 320引入细胞。第一位点特异性核酸酶靶向染色体310中的位点311。第二位点特异性核酸酶靶向染色体310中的位点312。位点311和位点312将染色体310分成区段313、区段314和区段315。位点311和位点312分别位于第一基因和第二基因中。第一基因和第二基因在基因表达方面具有相反方向。供体dna 320包含5’同源臂321、选择区322和3’同源臂323。5’同源臂321与位点311附近的区段313中的区域同源。3’同源臂323与区段314中的区域同源，但在位点312附近具有相反的方向。选择区322包含至少一个正选择标志物。
70.在引入细胞后，第一和第二位点特异性核酸酶分别在位点311和位点312处产生双链断裂。供体dna 320与染色体310重组，产生中间融合染色体330，其包含区段313、选择区322和区段314，其中区段314的方向相对于区段313是颠倒的。选择区322中正选择标志物的存在允许选择包含中间融合染色体330的细胞。
71.然后，将第三和第四位点特异性核酸酶或位点特异性重组酶引入细胞，分别在位点331和位点332处产生双链断裂，其中位点331和位点332在选择区322侧翼。由该对位点特
异性核酸酶产生的区段313的至少一部分(区段316)和区段314的至少一部分(区段317)然后通过非同源末端连接而连接，产生包含区段316和区段317的重排染色体340。在某些实施方式中，选择区322还包含负选择标志物，例如，胸苷激酶，这允许选择重排的染色体340，例如，在更昔洛韦存在的情况下。
72.染色体重排还产生第一基因和第二基因的融合基因，其中所述第二基因的方向相反。
73.已经出于说明和描述的目的呈现了本发明的前述描述。并不意在穷举或将本发明限制为所公开的精确形式。根据上述教导，其他修改和变化是可能的。选择和描述实施方式是为了最好地解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域的其他技术人员能够在适合预期的特定用途的各种实施方式和各种修改中最好地利用本发明。所附权利要求旨在包括本发明的其他替代实施方式；包括等效的组分、方法和手段。
74.应当理解，概述和摘要部分可以阐述发明人所设想的本发明的一个或多个，但并非如发明人所设想的本发明的所有示例性实施方式，并且因此不旨在以任何方式限制本发明和所附权利要求。
75.实施例
76.实施例1
77.本实施例说明了具有kif5b-alk易位的基因组修饰细胞的生产。
78.方法：首先，通过rnp法分别在kif5b内含子24和alk内含子19处引入双链dna断裂。将包含两个基因的同源臂、嘌呤霉素抗性表达盒和tk表达盒(图4)的易位供体用rna-蛋白复合物共转染。嘌呤霉素选择后，通过基因分型结果确认kif5b-puro-tk-alk融合系。嘌呤霉素选择后的效率为约1％。其次，使用两个新grna除去嘌呤霉素抗性基因和tk表达盒。gcv处理后，对单细胞克隆进行基因分型，11.9％的克隆显示正确的基因型。
79.结果：发明人证实分离的细胞具有kif5b-alk易位的染色体重排。发明人还证实kif5b-alk融合mrna在分离的细胞中的表达。
80.实施例2
81.本实施例说明了基因组修饰细胞的生产稳定性，该细胞具有染色体反转产生的eml4-alk融合基因。
82.方法：使用rnp法同时破坏eml4内含子13和alk内含子19，并在同源臂桥的中间插入瞬态嘌呤霉素抗性tk选择表达盒。该eml4-puro-tk-alk融合系随后被一对grna/cas9蛋白复合物切割。未经gcv处理的效率为13.5％。
83.结果：发明人证实分离的细胞具有带有eml4-alk融合基因的重排染色体。发明人还证实eml4-alk融合蛋白在细胞中的表达(见图5)。
84.尽管已经参考特定实施方式(其中一些是优选的实施方式)具体地示出和描述了本公开内容，但是本领域技术人员应当理解的是，在不脱离如本文所公开的本公开内容的主旨和范围的前提下，可以在形式和细节上进行各种改变。