染色体重排的方法与流程

技术特征：
1.一种用于生产基因组修饰的细胞的方法，所述方法包括：向细胞中引入：靶向第一染色体中的第一位点的第一位点特异性核酸酶，所述第一位点将所述第一染色体分成所述第一染色体的第一区段和第二区段，靶向第二染色体中的第二位点的第二位点特异性核酸酶，所述第二位点将所述第二染色体分成所述第二染色体的第一区段和第二区段，和依次包含以下的供体dna：5’同源臂，选择区，和3’同源臂，其中所述5’同源臂与在所述第一位点侧翼的所述第一染色体的所述第一区段中的区域同源，并且其中所述3’同源臂与在所述第二位点侧翼的所述第二染色体的所述第二区段中的区域同源；产生中间细胞，所述中间细胞包含依次包含以下的中间融合染色体：所述第一染色体的所述第一区段，所述选择区，和所述第二染色体的所述第二区段；和向所述中间细胞中引入(i)靶向第三位点的第三位点特异性核酸酶，和靶向第四位点的第四位点特异性核酸酶，其中所述第三位点和所述第四位点位于所述选择区侧翼，或者(ii)靶向所述第三位点和所述第四位点的位点特异性重组酶，从而产生包含融合染色体的细胞，所述融合染色体包含与所述第二染色体的所述第二区段的至少一部分连接的所述第一染色体的所述第一区段的至少一部分。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶中的任一种是锌指核酸酶(zfn)、基于转录激活因子样效应物的核酸酶(talen)、大范围核酸酶或crispr/cas蛋白。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶是crispr/cas蛋白，并且所述方法还包括引入靶向在第一染色体中的所述第一位点的第一向导rna和靶向在第二染色体中的所述第二位点的第二向导rna。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体dna包含第一重组酶识别位点和第二重组酶识别位点。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一染色体与所述第二染色体是相同的。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一染色体与所述第二染色体是不同的。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择区包含正选择标志物。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述正选择标志物是嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟素s抗性基因或荧光基因。10.根据权利要求8所述的方法，其中所述选择区还包含负选择标志物。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述负选择标志物是胸腺嘧啶激酶基因。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶是crispr/cas蛋白，并且所述方法还包括引入靶向所述第三位点附近区域的第三向导rna和靶向所述第四位点附近区域的第四向导rna。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述位点特异性重组酶是cre重组酶、flp重组酶或整合酶。14.一种根据权利要求1所述的方法生产的基因组修饰的细胞。15.一种用于生产基因组修饰的细胞的方法，所述方法包括：向细胞中引入：靶向染色体中的第一位点的第一位点特异性核酸酶，靶向所述染色体中的第二位点的第二位点特异性核酸酶，依次包含以下的供体dna：5’同源臂，选择区，和3’同源臂，其中所述第一位点和所述第二位点将所述染色体依次分成第一区段、第二区段和第三区段，其中所述5’同源臂与在所述第一位点侧翼的所述第一区段中的区域同源，并且其中所述3’同源臂与在所述第二位点侧翼的所述第二区段中的区域同源；产生中间细胞，所述中间细胞包含依次包含以下的中间融合染色体：所述第一区段，所述选择区，和所述第二区段，当与在所述染色体中的其方向相比时，所述第二区段颠倒了其方向；向所述中间细胞中引入(i)靶向第三位点的第三位点特异性核酸酶，和靶向第四位点的第四位点特异性核酸酶，其中所述第三位点和所述第四位点位于所述选择区侧翼，或者(ii)靶向所述选择区侧翼的所述位点的位点特异性重组酶，从而产生包含融合染色体的细胞，所述融合染色体包含与所述第二区段的至少一部分连接的所述第一区段的至少一部分，其中所述第二区段在所述染色体中的方向与其原来的方向相比是颠倒的。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一位点特异性核酸酶、所述第二位点特异性核酸酶、所述第三位点特异性核酸酶和所述第四位点特异性核酸酶中的任一种是锌指核酸酶(zfn)、基于转录激活因子样效应物的核酸酶(talen)、大范围核酸酶或crispr/cas蛋白。18.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一位点特异性核酸酶和所述第二位点特异性核酸酶是crispr/cas蛋白，并且所述方法还包括引入靶向在第一染色体中的所述第一位点的第一向导rna和靶向在第二染色体中的所述第二位点的第二向导rna。19.根据权利要求15所述的方法，其中所述第三位点特异性核酸酶和所述第四位点特异性核酸酶是crispr/cas蛋白，并且所述方法还包含引入靶向所述第三位点附近区域的第
三向导rna和靶向所述第四位点的第四向导rna。20.根据权利要求15所述的方法，其中所述选择区包含正选择标志物。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述正选择标志物是嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟素s抗性基因或荧光基因。22.根据权利要求20所述的方法，其中所述选择区还包含负选择标志物。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述负选择标志物是胸腺嘧啶激酶基因。24.根据权利要求15所述的方法，其中所述位点特异性重组酶是cre重组酶、flp重组酶或整合酶。25.根据权利要求15所述的方法，其中所述第三位点位于第一基因上并将所述第一基因分成所述第一基因的第一区域和第二区域，其中所述第四位点位于第二基因上并将所述第二基因分成所述第二基因的第一区域和第二区域，其中所述融合染色体包含融合基因，所述融合基因包含与所述第二基因的所述第一区域连接的所述第一基因的所述第一区域，并且其中所述第二基因的所述第一区域在在所述染色体中的方向与其原来的方向相比是颠倒的。26.一种根据权利要求15所述的方法生产的基因组修饰的细胞。

技术总结
本发明提供了用于生产具有染色体易位、缺失或倒位的细胞的方法。在一个实施方式中，所述的用于生产具有染色体易位的细胞的方法包括将位点特异性核酸酶引入所述细胞以在第一染色体和第二染色体中产生双链断裂；产生中间融合染色体，其包含所述第一染色体的第一区段、选择区和第二染色体的第二区段；以及在所述选择区侧翼的位点处产生双链断裂，从而产生融合染色体，所述融合染色体包含与所述第二染色体的所述第二区段的至少一部分连接的所述第一染色体的所述第一区段的至少一部分。第一染色体的所述第一区段的至少一部分。第一染色体的所述第一区段的至少一部分。


技术研发人员：郑起 孔令洁 R
受保护的技术使用者：应用干细胞有限公司
技术研发日：2020.06.19
技术公布日：2022/2/7