一种制备飞蝗Lmzen纯合突变体的方法、RNP复合物及应用与流程

一种制备飞蝗lmzen纯合突变体的方法、rnp复合物及应用
技术领域
1.本发明属于飞蝗生物技术和基因编辑技术领域，具体涉及一种制备飞蝗 lmzen纯合突变体的方法、rnp复合物及应用。


背景技术：

2.飞蝗(locusta migratoria)是世界农业生产中危害最严重的害虫之一，中国是蝗灾的历史多发地，给国家和人民造成了巨大的损失。目前我国的蝗虫防治体系主要包括以下四种方式：(1)化学防治：喷洒农药；(2)生物防治：牧鸡、牧鸭治蝗；(3)生态控制；(4)微生物防治：绿僵菌、病毒等。从分子层面研究蝗虫的生物防治，对我国害虫生物防治具有重要意义。
3.zerkn
ü
llt(zen)是有翅昆虫中起源的hox3同源基因，它的起源、表达位置和功能分化均与昆虫胚外膜的起源和进化对应。zen在部分完全变态类鞘翅目、双翅目和渐变态类半翅目中参与浆膜形成、形态变化和浆膜表皮形成，飞蝗是低等渐变态类直翅目昆虫，其卵具有完整的浆膜和浆膜表皮；飞蝗仅有1个 lmzen，分别参与浆膜细胞多核化、浆膜表皮形成和表皮几丁质合成酶基因表达等多个过程。但zen调控机制研究的匮乏和低等昆虫中功能研究的缺失，使得目前难以阐明zen与胚外膜形成和起源的关系，因而需要在新的模式昆虫中解析zen调控浆膜和浆膜表皮形成的分子机制。
4.crispr/cas9是进行特定基因功能研究的一种高效工具，它可以精确定位并切断dna上的某个基因位点，关闭基因片段，也可引入新的基因片段，近年来该技术已广泛应用于动物、植物、微生物。在飞蝗中，已有课题组利用 crispr/cas9系统进行飞蝗的基因功能研究，但利用该技术研究敲除zen基因、获得纯合突变体还未见报道。


技术实现要素：

5.本发明针对上述问题提供了一种制备飞蝗lmzen纯合突变体的方法、rnp 复合物及应用。
6.为达到上述目的，本发明提供了一种制备飞蝗lmzen纯合突变体的方法，其包括以下步骤：
7.1)构建lmzen基因敲除rnp复合物，其包括从5’端到3’端的以下可操作性连接的元件：t7启动子，lmzen基因靶点和tracrna-crrna所转录而成的 rna(sgrna)；cas9蛋白；ddh2o；
8.2)将步骤1)所述的lmzen基因敲除rnp复合物共转新鲜飞蝗卵，孵化，得g0代，将g0代与野生型杂交得g1代；
9.3)将步骤2)所述g1代自交，获得的g2代，即为飞蝗lmzen纯合突变体。
10.优选的，所述的lmzen基因靶点的核苷酸序列如seq id no:1所示。
11.优选的，所述的共转是将所述rnp复合物显微注射新鲜飞蝗卵。
12.本发明还提供一种lmzen基因敲除rnp复合物，其包括从5’端到3’端的以下可操作
性连接的元件：t7启动子，lmzen基因靶点和tracrna-crrna所转录而成的rna(sgrna)；cas9蛋白；ddh2o。
13.本发明还提供一种防治飞蝗的方法，包括以下步骤：将如上所述的方法制备而得的飞蝗lmzen纯合突变体野外放生，通过与野生飞蝗交配，使后代减少，降低种群数量。
14.与现有技术相比本发明具有以下优点：
15.本发明利用crispr/cas9技术敲除飞蝗zen基因，提供了稳定有效的lmzen 纯合突变体品系。首次敲除飞蝗zen基因，成功实现了纯合突变体的构建，其后代具有大量死亡表型。本发明将飞蝗胚胎显微注射技术与分子生物操作相结合，敲除飞蝗zen基因而获得纯合突变稳定遗传品系。可以推广至害虫的生物学防治，为飞蝗生物防治提供新的策略。
附图说明
16.图1为sgrna靶位点在lmzen中的位置；
17.图2为sgrna体外酶切检测图；
18.图3为lmzen基因野生型(wt)和突变体(z1、z2)部分外显子序列变异图；
19.图4为lmzen基因野生型(wt)和突变体(z1、z2)靶位点突变部分测序图谱；
20.图5为获得纯合突变体的杂交策略图；
21.图6为lmzen基因野生型(wt)和突变体(z1、z2)翅表型分析图；
22.图7为lmzen基因野生型(wt)和突变体(z1、z2)正常卵粒数比例图。
具体实施方式
23.本发明人经过广泛研究和反复试验，通过对基因突变位点的选择以及rnp 复合物的构建将飞蝗胚胎显微注射技术与分子生物操作相结合，构建了一个 lmzen基因突变飞蝗品系，发现zen基因突变后，雌雄突变体的正常交配行为均不受影响，其后代虫卵孵化率较低，成虫寿命较短可以用于飞蝗的遗传控制，防治飞蝗，从而完成了本发明。
24.目前普遍使用的基因组编辑技术的原理是通过人为的在基因组的特定位点实现dna片段的敲除、插入等。基因组编辑技术主要包括zen、talen、 crispr/cas9三种，均基于dna断裂/dna损伤修复来实现编辑功能。与另外两种技术相比，crispr/cas9具有灵活、简便的优势，因此在实验中运用较多。
25.本发明优选zen基因靶点序列，在crispr/cas9技术中作为靶点序列敲除 zen基因，从而得到飞蝗lmzen纯合突变体的功能。根据crispr/cas9的靶标位点特点，本发明优选的靶点位于飞蝗zen基因的第一外显子。将其命名为z1 (seq id no：1)。
26.鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员不难理解，尽管本发明的实例中提供了来源于飞蝗的zen基因的靶点序列，但是来源于其它昆虫的，与本发明启动子具有一定同源性(保守性)的zen基因靶点序列，只要本领域技术人员在阅读了本技术后根据本技术提供的信息可以方便地从其它昆虫中分离得到该zen基因靶点序列并验证其功能。
27.(1)sgrna合成及验证
28.首先利用sgrna合成引物，通过pcr方法获得sgrna的dna模板，用转录酶将pcr产物进行转录，以dnaseⅰ去除dna模板后，对获得的sgrna 进行纯化。
29.接着，由飞蝗基因组模板使用靶点鉴定引物f1、r1、f2、r2，通过pcr 方法获得靶点
片段。测序并鉴定靶点序列。用sgrna、cas9、cas9buffer酶切靶点片段，酶切完成后进行电泳检测。
30.(2)飞蝗zen敲除品系的获得
31.本发明中使用sgrna、cas9与ddh2o混合成rnp复合物，通过显微注射方法将rnp复合物注射入飞蝗新鲜卵中，注射完成后将其转入放有湿润滤纸的培养皿中，在30℃的环境中孵化，从g0代飞蝗中筛选出突变体后，将其与野生型交配，获得的g1代鉴定，将突变体进行自交获得g2代。
32.(3)lmzen突变体飞蝗的检测
33.本发明通过验证基因型突变以及观察其死亡表型，发现lmzen基因突变对飞蝗生长具有实质性影响。基因突变情况的鉴定：在飞蝗发育至5龄时，取其触角，使用碱裂解法获取基因组，通过pcr方法克隆靶点片段并测序。
34.本发明所用的飞蝗虫卵由购买于河北沧州市蝗虫养殖中心的成虫所产。购买的成虫饲养于铁网笼中(25cm*25cm*25cm)，所饲养环境温度为28-30℃，相对湿度为15％～25％，每日光照为14l:10d。
35.本发明的优点在于：首次利用crispr/cas9技术成功构建了lmzen突变体飞蝗。所得到的转基因lmzen突变体飞蝗品系，无论雌雄突变体在交配中均不存在任何障碍，但其后代孵化率却较低。另外，本发明使突变体的获得非常容易。本发明在飞蝗害虫通过卵期防治方面具有重要的价值。
36.实施例1sgrna合成及验证
37.1、sgrna靶位点的选择：
38.利用e-crispdesign在线设计工具，根据crispr/cas9技术设计靶位点的原则，选择lmzen基因的第一个外显子上的核苷酸序列作为sgrna靶标位点，其核苷酸序列为seqidno：1；(图1)
39.2、根据sgrna靶位点序列，设计sgrnapcr引物：
40.根据crispr/cas9引物设计的原则，设计sgrnapcr引物，上游引物sgrna-f核苷酸序列为seqidno：2，下游引物sgrna-r的核苷酸序列为seqidno：3。其构成的包含t7启动子，lmzen基因靶点和tracrna-crrna的sgrna全长序列为seqidno：4；
41.3、设计靶基因片段检测引物：根据靶基因，在sgrna序列的上游和下游分别设计两对引物，f1、f2、r1和r2，其中f1的核苷酸序列为seqidno：5，f2的核苷酸序列为seqidno：6，r1的核苷酸序列为seqidno：7，r2的核苷酸序列为seqidno：8；
42.4、靶基因片段合成：
43.以卵期飞蝗基因组为模板，进行巢式pcr，用f1、r1进行第一次pcr扩增，以第一次pcr产物为模板，用f2、r2进行第二次pcr扩增，获得靶基因片段并纯化，靶基因片段核苷酸序列为seqidno：9。
44.pcr第一次扩增体系为
45.试剂名称体积(μl)2*es taq master mix12.5f10.5r10.5
飞蝗基因组1(50ng)ddh2o10.5
46.pcr扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，25个循环；72℃延伸10min。
47.pcr第二次扩增体系为
48.试剂名称体积(μl)2*es taq master mix25f21r21第一次pcr扩增产物1(50ng)ddh2o22
49.pcr扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min。pcr产物纯化采用gel extraction kit试剂盒(康维世纪cat.cw2302m)。
50.5、sgrna的合成：
51.5.1以卵期飞蝗cdna为模板，用上游引物sgrna-f和下游引物sgrna-r进行扩增、转录、去除dna模板、纯化，获得sgrna片段并纯化；
52.sgrna扩增体系为：
[0053][0054]
扩增程序为：98℃预变性10s；98℃变性5s，55℃退火15s，32个循环； 72℃延伸1min。
[0055]
sgrna转录体系为：
[0056]
试剂名称体积(μl)ntpmix8sgrnadnatemplate65xtranscriptaid
tm
reactionbuffer4transcriptaid
tm
enzymemix2
[0057]
转录条件为：37℃孵育2h。
[0058]
sgrna去除dna模板体系为：在转录后的反应物中加dnasei(1u/μl)， 37℃孵育
15min去除dna模板。sgrna纯化采用geneart
tm
precisiongrnasynthesiskit试剂盒(赛默飞世尔a29377)。
[0059]
5.2sgrna纯化后在体外进行酶切验证；
[0060]
sgrna酶切反应体系为：
[0061][0062][0063]
37℃孵育2h，孵育完成后，加入2μl6*loadingbuffer，混匀后进行2％琼脂糖凝胶电泳检测(图2)
[0064]
实施例2飞蝗zen敲除品系的获得
[0065]
1、胚胎的收集：
[0066]
取野生型飞蝗未出现合胞体前的卵(2h内)，用无菌水将卵表面杂质清洗干净后整齐置于注射专用培养皿中进行显微注射。
[0067]
2、显微注射：
[0068]
将cas9/sgrna的rnp复合物利用显微操作系统注入新生飞蝗卵中，注射完成后将虫卵轻轻地放在有湿润滤纸的培养皿中放入30℃培养箱恒温培养，14d左右即可孵化出若虫；
[0069]
复合物体系为cas9蛋白(300ng/μl)1μl，sgrna(300ng/μl)1μl，ddh2o8μl。
[0070]
实施例3lmzen突变体飞蝗的检测
[0071]
1、筛选嵌合体：
[0072]
发育至5龄时，单头饲养于培养杯中，使用解剖剪将飞蝗触角剪下约5mm长度置于1.5ml离心管中，使用碱裂解法获取基因组，即加入45μl50mmnaoh，95℃裂解5min；之后加入5μl1mtris-hcl(ph＝9.5)。取上述模板1μl，对目的基因片段进行巢式pcr，对pcr产物进行测序，测序公司为生工生物工程(郑州)股份有限公司，测序引物序列为上述f2。
[0073]
根据测序结果筛选出在靶位点处有杂峰的阳性突变虫体g0代，使其与野生型进行交配，从其后代中鉴定筛选出杂合突变体g1代；
[0074]
2、获得纯合突变体：
[0075]
将g1代所得的杂合突变体进行配对，对其后代进行测序鉴定，筛选出纯合突变体g2代进行配对，经靶位点片段测序验证，即可获得部分或完全丧失lmzen基因功能且无外源基因插入的纯合突变体。
[0076]
根据测序结果分析，发现z1株系存在7bp的缺失，z2株系存在20bp的片段缺失(图3、图4)。将z1、z2突变体和野生型飞蝗进行比较，发现突变体翅卷曲比例显著高于野生型
(图5)。
[0077]
分别观察纯合突变体与野生型的后代，发现纯合突变体后代中不能正常发育的卵粒数显著高于野生型(图6)。
[0078]
可见，本发明成功利用crispr/cas9基因编辑技术将飞蝗lmzen基因进行编辑，获得了在靶位点突变的2个纯合突变体品系，通过与野生型飞蝗进行表型比较，发现lmzen突变体的翅卷曲且突变体后代中不能正常发育的卵粒数较多，说明了lmzen在飞蝗生长发育过程中发挥重要作用。
[0079]
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0080]
以上显示和描述了本发明的主要特征和优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0081]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。