一种DNA修饰二氧化硅材料的方法及其产物和产物的应用与流程

一种dna修饰二氧化硅材料的方法及其产物和产物的应用
技术领域
1.本发明属于材料技术领域，更具体地说，涉及一种dna修饰二氧化硅材料的方法及其产品和产品的应用。


背景技术：

2.二氧化硅纳米颗粒(sinps)具有尺寸可调控性和高度的生物相容性，是生命科学中最具吸引力的纳米材料之一。鉴于dna分子可实现分子组装、生物催化、生物传感、基因调控、药物输送等多种生物学应用，利用寡核苷酸dna分子对sinps进行功能化有效提高了其利用率。
3.通常，所合成的sinps对dna分子呈惰性，因为它们两者都是高度亲水性和带负电的，难以直接将dna链固定在sinps表面。目前，主要有两种方法可以在sinps表面修饰dna链。一种常用的方法是利用硅烷化学共价固定dna链。硅烷偶联剂如氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)，氧化丙甲基三甲氧基硅烷(omtms)，乙烯基三甲氧基硅烷(vtms)，3-巯基丙基三甲氧基硅烷(mptms)可改变sinps的表面化学，并产生大量官能团如氨基、环氧基、乙烯基、硫醇基团等用于固定dna。同时，还需对dna分子进行基团修饰来完成交联反应。尽管其具有高稳定性，但制备过程相对复杂，通常需要较长时间(＞6小时)，这可能导致sinps的不可逆团聚，降低其生物利用度。此外，大量化学试剂的使用和dna的基团修饰不可避免地提高了成本。更重要的是，鉴于dna结构的多样性和复杂性，难以选择合适偶联基团，且sinps表面的dna密度也难以控制，进一步限制其实际应用。另一种方法是通过静电相互作用进行物理吸附，利用带正电荷的氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)或阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(pei)预处理sinps，使其易于吸附dna分子。该方法简单、快速，但在复杂的生物介质中吸附量较低，且状态不稳定，寡聚核苷酸易脱落。此外，阳离子聚合物的细胞毒性可能会阻碍这种方法在细胞中的应用。
4.金属离子作为必需的生物元素，在调节多种生命活动中起着至关重要的作用。近年来，随着dna纳米技术的发展，人们发现许多金属离子对dna分子的活性有很大影响。例如，许多金属离子如na

、mg
2
、zn
2
和pb
2
是dna酶的辅助因子；k

可以控制g-四链体的形成；汞离子和银离子介导t-hg-t和c-ag-c结构的形成，且已广泛应用于生物传感和废水处理。然而，金属离子介导的纳米材料表面dna组装研究仍很少。大多数已开发的方法都集中于在硅材料上吸附长链dna(例如遗传dna、质粒等)，而短链dna片段(＜100bp)与硅材料之间的相互作用很少被探索。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种dna修饰二氧化硅材料的方法，能够在纳米二氧化硅或玻璃片表面稳固修饰dna。本发明所要解决的另一技术问题在于提供前述方法制备得到的产物。本发明所要解决的最后一技术问题在于提供前述产物的具体应用。
6.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
7.一种dna修饰二氧化硅材料的方法，将dna、金属离子溶液与二氧化硅材料混合后孵育，使dna固定于二氧化硅材料表面。
8.进一步地，所述的二氧化硅材料为纳米二氧化硅或玻璃片。
9.进一步地，所述的纳米二氧化硅采用法制备。
10.进一步地，所述的金属离子是zn
2
、al
3
、y
3
、zr
4
、la
3
、dy
3
或lu
3
。
11.进一步地，dna的修饰密度通过改变dna或金属离子的浓度进行调节。
12.所述的dna修饰二氧化硅材料的方法制备得到的产物。
13.所述的产物在核酸分子纯化、核酸分子传递、生物传感或生物成像中的应用。
14.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
15.本发明公开了一种简单、快速和高效的dna分子修饰二氧化硅材料的方法，二氧化硅材料可以是sinps或玻璃片，该方法只需一步孵育即可实现，不需要任何复杂的化学修饰和耗时的步骤，修饰过程可以在几分钟内完成，且金属离子介导形成的dna-sinps稳定性很高，只需改变dna或金属离子的浓度，就可以对dna密度进行调节。sinps和dna不需要任何化学改性且不涉及任何昂贵或有害的试剂，有利于其生物学应用。将金属离子介导的sinps表面dna分子组装原理成功应用于dna微阵列构建及生物传感。通过简单调整金属离子和dna的种类，即可灵活地实现不同生物学应用，在生物分子纯化、核酸传递、生物传感和生物成像等领域具有很大的潜力。
附图说明
16.图1为金属离子筛选结果图；
17.图2为dna修饰密度调节结果图；
18.图3为dna微阵列构建及其生物传感应用结果图；
19.图4为金属离子介导的sinps表面dna分子组装原理示意图。
具体实施方式
20.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
21.实施例1：sinps合成与表征
22.sinps按照常规的法制备。将含有无水乙醇、氨(28-30％)和去离子水的溶液搅拌5分钟，以确保完全混合。然后在上述溶液中加入原硅酸四乙酯无水乙醇溶液，在室温下反应24小时。合成的sinps在室温下储存于乙醇溶液中。
23.使用前，通过在12000rpm下离心10分钟来收集sinps，并用milli-q水清洗三次，然后重新分散在milli-q水中进行后续实验。使用malvern zetasizer nano zs系统测量sinps的尺寸分布和zeta电位，并使用透射电子显微镜(tem)表征其形态。
24.透射电子显微镜(tem)和动态光散射(dls)的结果表明成功制备了具有均匀尺寸(直径＝400nm)的球形sinps。由于sinps不是荧光淬灭剂，因此可以通过灵敏的荧光技术快速分析dna分子的吸附情况。
25.实施例2：筛选介导dna修饰sinps表面的金属离子
26.(1)dna修饰sinps方法
27.将10nm fam/cy3标记的dna(ph7.4，10mm hepes)、100μg ml-1 sinp(ph7.4，10mm hepes)和不同浓度的金属离子混合(ph7.4，10mm hepes)，在室温下孵育5分钟，离心后用缓冲液(10mm hepes，1mm金属离子，ph7.4)清洗纳米颗粒3次。使用荧光光谱仪记录吸附的dna的荧光光谱(ex＝490nm，em＝518nm)。
28.(2)金属离子筛选
29.将荧光团6-羧基荧光素(fam)标记在25-mer dna聚腺苷链5
′
端(fam-a25)，筛选可以有效介导dna与sinps表面组装的金属离子。只需将fam-a25、sinps和金属离子混合，在紫外光(365nm)照射下即可得到均匀的绿色溶液。离心后，sinps沉淀并在管底部显示亮绿光，而未检测到上清液的荧光，表明dna分子有效吸附在sinps表面。
30.筛选周期表中的阳离子元素：金属离子如hg
2
、pb
2
、cr
6
、cd
2
等，对生物体极为有害，所以没有对它们进行进一步实验。此外，ni
2
、cu
2
、fe
3
和一些镧系金属离子，即使在低浓度下也能强烈淬灭fam的荧光(图1.a)。为了排除fam淬灭带来的假阳性结果，采用氰化物染料(cy3)代替fam，结果表明，zn
2
、al
3
、y
3
、zr
4
和一些镧系金属离子(如la
3
、dy
3
和lu
3
)可有效地将dna固定在sinps表面(图1.b)；此外，这种金属离子辅助的dna组装方法对纳米级sinps与宏观玻璃片均有效(图1.c)。
31.(3)dna修饰密度调节及修饰性能实验
32.锌离子与其它有效金属离子相比具有更高的生物相容性，因此以zn
2
为模型佐剂，系统地考查了dna对sinps的功能化修饰。
33.在1mm zn
2
和100μg ml-1 sinps条件下，测量了fam-a25 dna吸附等温线。随着dna浓度从0nm增加到300nm，dna吸附量逐渐增加(图2.a)，数据拟合呈langmuir等温线，表明dna单层吸附。当dna浓度为100nm时，100μg ml-1 sinps(d＝400nm)可以达到7.92
×
104链/μm2的饱和负载，相当于3.86
×
104链/纳米颗粒，且其负载力与共价组装dna方法的负载力相当。
34.实验考查不同浓度的zn
2
对fam-a25修饰二氧化硅纳米颗粒的影响：如图2.b所示，dna吸附量随着zn
2
浓度的增加而增加，并在1mm zn
2
时达到峰值。吸附于sinps表面的dna密度可以在0-3.86
×
104链/纳米颗粒线性范围内进行调节，该线性范围明显宽于传统方法。
35.实验考查金属离子介导的dna修饰sinps的时间：结果表明，dna分子在sinps表面的吸附是相当快的，超过90％dna在前三分钟内被吸附。
36.实验考查dna序列及长度对其吸附力的影响：因为g15的合成过程很困难，且容易形成g-四联体结构，因此并未研究其对dna吸附力的影响。结果表明，zn
2
介导的dna组装依赖于dna序列，并且a15和c15的吸附能力明显大于t15；过短的dna链(如a5)不能有效地吸附在sinps的表面，而当长度超过15个核苷酸时，负载力趋于稳定。
37.实验考查金属离子介导的dna-sinps的稳定性：当缓冲液中没有zn
2
时，大部分的dna分子仅在储存一天后就开始脱离si表面；当缓冲液中含有zncl2(1mm)时，储存8天后，dna才会发生微弱的解离，表明金属离子介导的dna-sinps可以长期储存与应用。
38.实施例3：dna微阵列构建
39.使用spotbot 2微阵列点样器将溶于点样缓冲液(10mm tris-hcl，100μm zrcl4，ph 7.4)中的dna探针打印到干净的玻璃片上。样斑平均直径为100μm，两个斑点之间的距离
为50μm。准备就绪的玻片在室温下于恒湿箱中孵育5分钟。随后，用tris-hcl缓冲液(10mm tris-hcl，ph 7.4)清洗两次，并将玻片在室温下浸入封闭液(含有10μm poly15a的tris-hcl缓冲液，ph7.4)中5分钟以钝化表面。用tris-hcl缓冲液清洗两次后，将玻片保存在4℃以备进一步使用。
40.dna微阵列已被广泛用于体外dna分析和临床诊断。传统方法中，dna探针组装于玻璃片表面主要依赖硅烷化学，操作复杂、耗时。鉴于zr
4
不会对fam荧光产生影响，并且与zn
2
相比，其对dna表现出更高的结合亲和力，因此选择利用zr
4
来辅助制备微阵列传感表面。zr
4
介导的dna组装使得dna微阵列的制备更容易。在干净的玻璃片表面共孵育zr
4
和dna捕获探针，以形成dna单分子层。不同浓度的fam-dna点样于玻璃片上时，均产生均匀、可重复的荧光信号，并且荧光强度随着dna探针浓度从50到400nm增加而逐渐增加(图3.a)。dna微阵列制备好后可用于检测目标dna分子。将与目标dna半互补的dna捕获探针在金属离子的辅助下组装于玻璃片表面捕获目标dna，目标dna随后与标记有荧光基团的信号探针结合，如图3.b所示，随着目标dna的增加，微阵列的荧光强度随之增加，这表明玻璃片表面上的dna探针仍然保持杂交活性。该方法针对目标dna的检测限低至5nm。微阵列中的dna序列如下：
41.捕获探针：5
′‑
aaaaaaaaaaaaaaacggatcaagtatgcc-3
′
；
42.目标dna序列：5
′‑
gtagcgagtgtctttggcatacttgatccg-3
′
；
43.信号探针：5
′‑
aaagacactcgctac-fam-3
′
。
44.综上所述，本发明公开了一种简单、快速和高效的dna分子修饰二氧化硅材料的方法，只需一步孵育即可实现，不需要任何复杂的化学修饰和耗时的步骤(图4)。只需改变dna或金属离子的浓度，就可以对dna密度进行调节，且金属离子介导形成的dna-sinps稳定性很高。修饰过程可以在几分钟内完成，sinps和dna不需要任何化学改性且不涉及任何昂贵或有害的试剂，有利于其生物学应用。可将金属离子介导的二氧化硅材料表面dna分子组装原理应用于dna微阵列构建及生物传感中。此外，通过简单调整金属离子和dna的种类，即可灵活地实现不同生物学应用，在生物分子纯化、核酸传递、生物传感和生物成像等领域具有很大的潜力。