用于核酸检测的分子探针及其制备方法和用途与流程

1.本发明属于分子生物检测领域，具体涉及一种用于体内或体外核酸检测的寡核苷酸分子探针，及其制备方法和用途。


背景技术：

2.核酸检测技术广泛应用于医学诊断、食品安全和环境监测等领域。该技术以例如病原或病症源性靶核酸为研究对象，通过鉴定靶核酸的存在或检测靶核酸的水平，来证实病原或病症(例如，病原性生物体、疾病细胞或组织等)的存在。
3.目前已有的核酸检测方法包括核酸印迹、微阵列、核酸扩增技术(例如，rt-pcr、rt-lamp、sat)等。然而，这些方法需对样品进行核酸提取、扩增和检测，其中涉及繁琐的操作步骤和昂贵的仪器及材料，从而检测成本高、费时耗力；此外，操作中对于条件和试剂的选用以及操作人员的操作差异也可能对样品核酸产生干扰，致其损失或被遮蔽，导致部分样品不能被正常检出，易产生假阴性结果。
4.用于原位杂交的核酸探针被越来越多地用于细胞内外生物化学物质的检测。在细胞或组织结构保持不变的情况下，使带标记的核苷酸片段，基于碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的靶核酸特异性结合(例如，杂交)，并通过光学方法或成像技术标识出来，以实现对靶核酸的检测(例如，可视化定位和/或定量)。常用于此类检测的探针包括用放射性核素或荧光标记的探针。然而，这些探针在检测精确性、安全性方面仍有限制。
5.基于以上，仍继续需要一种新型分子探针，其制备便捷，且能够提供安全、准确的核酸检测。


技术实现要素：

6.在本发明的一个方面中，提供一种用于核酸检测的分子探针，其包含：
7.(1)分子探针载体，其包含细胞穿膜肽和与之相连的可检测标记物，和
8.(2)靶向性寡核苷酸，
9.其中，所述分子探针载体连接至所述靶向性寡核苷酸。
10.在本发明的另一个方面中，提供一种用于制备分子探针的方法，其包括：
11.使可检测标记物与细胞穿膜肽连接，以获得分子探针载体；和
12.使所述分子探针载体与靶向性寡核苷酸孵育足以允许所述分子探针载体与所述靶向性寡核苷酸之间发生连接的时间，以获得所述分子探针。
13.在本发明的另一个方面中，提供一种用于核酸检测的方法，其包括：
14.向对象或来自对象的样品给予根据本文所述的分子探针；和
15.通过检测所述对象或来自对象的样品中的可检测标记物来确定靶核酸的存在和/或水平。
16.在本发明的另一个方面中，提供一种用于核酸检测的试剂盒，其包含：
17.含有根据本文所述的分子探针载体的容器；
18.含有根据本文所述的靶向性寡核苷酸的容器；和
19.任选的，使用说明。
20.我们发现，本文所述的分子探针能够由分子探针载体(也即，可检测标记物与细胞穿膜肽的连接物)与靶向性寡核苷酸通过一步法制备获得。相对于现有的多步骤探针合成方法，本文所述的分子探针制备方法简单、高效、对原材料利用率高且产废少，且所制备的探针能够提供安全、准确的核酸检测。
附图说明
21.下面结合附图对本发明作进一步说明。所提供的附图及说明仅为图示说明本发明的实施方案，而不意在局限本发明的范围。
22.图1：显示细胞穿膜肽-vsp分子探针载体制备的实验流程图。
23.图2：显示通过实验验证ttr靶向性sirna靶向ttr mrna的效果。图2a、2b和2c显示大鼠肝细胞brl3a体外转染12h后的荧光成像结果。其中，图2a为转染ttr靶向性sirna的结果；图2b为转染阴性对照nc-sirna的结果；图2c为未经转染的空白对照组的结果。图2d显示转染ttr靶向性sirna、转染阴性对照nc-sirna和未经转染的空白对照组在不同时间点的荧光密度曲线。
24.图3：通过western印迹分析ttr靶向性sirna靶向ttr mrna的作用效果。
25.图4：显示相对于正常肝脏而言，肝脏纤维化病症下的组织异常状态及ttr蛋白的异常表达。其中，图4a至4c显示健康大鼠的he、masson和ttr蛋白免疫组化染色的结果；图4d至4f显示肝脏纤维化模型鼠的he、masson和ttr蛋白免疫组化染色的结果。
26.图5：显示健康大鼠和肝脏纤维化模型大鼠的肝脏对18f-ttr靶向性sirna分子探针的获取情况。其中，图5a和5c分别为向肝脏纤维化模型组大鼠注射分子探针后60分钟对探针积累的伪色和灰度pet成像；图5b和5d分别为向健康组大鼠注射分子探针后60分钟对探针积累的伪色和灰度pet成像；图5e为肝脏纤维化模型组及健康大鼠肝脏中分子探针的放射性时间曲线。
具体实施方式
27.本技术中科技术语的含意与本领域技术人员的普遍理解一致，除非另做说明。本技术中，“一”或其与各种量词的组合既包括单数含意也包括复数含意，除非特别说明。本技术中，对于同一参数或变量，当给出多个数值、数值范围、或其组合予以说明时，相当于具体揭示了这些数值、范围端值以及由它们任意组合而成的数值范围。本技术中，任一数值不论是否带有“约”之类的修饰词，一律涵盖本领域技术人员能够理解的约略范围，例如正负10％、5％等。本文中，每一“实施方式”均同等地指代且涵盖了本技术各项方法和各项系统的实施方式。本技术中，任意实施方式中一项或多项技术特征可以与任何一个或多个其他实施方式中的一项或多项技术特征自由组合，由此得到的实施方式同样属于本技术公开的内容。
28.一方面，本公开内容提供一种用于核酸检测的分子探针，其包含(1)分子探针载体，其包含细胞穿膜肽和与之相连的可检测标记物；和(2)靶向性寡核苷酸；其中，所述分子探针载体连接至所述靶向性寡核苷酸。
29.在一些实施方式中，本公开内容所述的分子探针可以是寡核苷酸分子探针。
30.在一些实施方式中，所述核酸检测可以是体外核酸检测。在一些实施方式中，所述核酸检测可以是含细胞样品的体外核酸检测。在另一些实施方式中，所述核酸检测可以是体内检测。
31.本文所述的分子探针包含细胞穿膜肽。本文中，术语“细胞穿膜肽”(本文中也简称作“cp”)是指一类能够促进细胞摄取各种分子载物(从纳米粒子到小化学分子和大片段dna)的短肽，其具有将载物递送进入细胞的作用。
32.在一些实施方式中，细胞穿膜肽可包含如seq id no:1所示的氨基酸序列。
33.在一个实施方式中，细胞穿膜肽可包含在seq id no:1所示氨基酸序列的任何一或两个位点处包含一或两个氨基酸突变的氨基酸序列。在一个具体实施方式中，细胞穿膜肽可包含在seq id no:1所示氨基酸序列的任何一或两个位点处包含一或两个氨基酸突变的氨基酸序列，其中seq id no:1中的赖氨酸残基保持不变。所述氨基酸突变选自：添加、取代、缺失或其组合。所述氨基酸突变可出现在seq id no:1所示氨基酸序列的任何一端、两端或内部的相同或不同位置。
34.在一些实施方式中，细胞穿膜肽的长度可在8至12个氨基酸范围内。在一些可选实施方式中，细胞穿膜肽的长度可在以8、9、10、11、12中任选两个作为端点而形成的范围内。
35.在一些实施方式中，细胞穿膜肽可具有与seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿膜肽由seq id no:1所示的氨基酸序列组成。
36.在一些具体实施方式中，细胞穿膜肽可以是环肽。所述环肽可由细胞穿膜肽氨基酸序列的首尾两个氨基酸残基相连而成。
37.本文所述的细胞穿膜肽可根据本领域已知的多肽合成和/或修饰方法而获得。
38.本文所述的分子探针还包含可检测标记物。本文中，术语“可检测标记物”是指能够产生或增强检测信号的物质。
39.在一些实施方式中，可检测标记物可以是造影剂。本文所用术语“造影剂”是指为形成影像或增强影像观察效果而引入待测部位(例如细胞、组织或器官)的物质。在一些情况中，“造影剂”也可称作“对比剂”或“显像剂”。
40.在一些实施方式中，所述造影剂可包括ct造影剂。所述ct造影剂可作为用于电子计算机断层扫描(ct)检测的可检测标记物。在一些实施方式中，所述ct造影剂可包括选自下组的一种或多种：碘克沙醇、碘海醇、碘帕醇、碘普罗胺和碘佛醇。在一些具体实施方式中，所述造影剂可以是碘克沙醇。本文中，术语“碘克沙醇”可与其商品名称“威视派克(visipaque)”(简称“vsp”)互换使用，其作为一种含六碘双体非离子型造影剂可用于电子计算机断层扫描(ct)检测。一般而言，碘克沙醇具有下式(i)所示结构：
[0041][0042]
在一些实施方式中，所述可检测标记物还可包括其它造影剂，例如，选自mri造影剂(例如，uspio)、荧光造影剂(例如，5-fam se)和放射性造影剂(例如，正电子核素18f或68ga)的一种或多种造影剂。
[0043]
本文所述的可检测标记物可直接地连接至细胞穿膜肽，或可通过连接部分间接地连接至细胞穿膜肽。
[0044]
在一些实施方式中，所述可检测标记物与所述细胞穿膜肽之间的连接可以是共价连接。在一些实施方式中，可检测标记物与细胞穿膜肽可通过酰胺键连接。在一些实施方式中，可检测标记物可与细胞穿膜肽所含的一个氨基酸残基上的氨基连接。在一个具体实施方式中，可检测标记物与细胞穿膜肽所含的赖氨酸残基(例如，赖氨酸残基上的氨基)连接。在一些实施方式中，可检测标记物可通过连接部分间接地连接至细胞穿膜肽。在一些实施方式中，所述连接部分可包含亚烷基羰基。在一些实施方式中，所述亚烷基羰基可以是c
1-c
12
亚烷基羰基，例如，c
1-c
10
亚烷基羰基、c
1-c8亚烷基羰基、c
1-c6亚烷基羰基或c
1-c4亚烷基羰基。本文中，所用“亚烷基”指的是直链亚烷基、支化亚烷基或环亚烷基，优选直链亚烷基。本文中，例如“c
1-c
12
亚烷基”指的是含有所指示数量(1-12)个碳原子的亚烷基。
[0045]
在可检测标记物为vsp的示例性实施方式中，vsp可通过酰胺键与细胞穿膜肽连接。在一些实施方式中，vsp可与细胞穿膜肽所含的一个氨基酸残基上的氨基连接。在一个具体实施方式中，vsp可与细胞穿膜肽中所含的赖氨酸残基(例如，赖氨酸残基上的氨基)连接。在一些实施方式中，vsp可通过连接部分间接地连接至细胞穿膜肽。在一些实施方式中，所述连接部分可包含亚烷基羰基。在一些实施方式中，所述亚烷基羰基是c
1-c
12
亚烷基羰基，例如，c
1-c
10
亚烷基羰基、c
1-c8亚烷基羰基、c
1-c6亚烷基羰基或c
1-c4亚烷基羰基。在一个示例性的具体实施方式中，vsp通过连接部分与细胞穿膜肽相连，所述连接部分包含-(ch2)nco-，其中n为1-10的整数。在一个更具体的实施方式中，vsp与细胞穿膜肽可按以下方式连接：[vsp]-(ch2)nco-[细胞穿膜肽]，其中n为1至10的整数。在一些可选实施方式中，n可以是1至8的整数。在一些可选实施方式中，n可以是1至6的整数，具体地是1至4的整数，更具体地是2、3或4。
[0046]
本文中，与细胞穿膜肽连接的可检测标记物也可称作“探针载体”或“分子探针载体”，其用于进一步与靶向性寡核苷酸连接。
[0047]
本文所述的分子探针还包含靶向性寡核苷酸。本文中，术语“靶向性寡核苷酸”指对于靶基因(例如靶基因或靶核酸内的靶位点)具有靶向性(例如互补性)且长度为至多100(例如，10至80、10至50、10至40)个碱基的短核酸序列。本文所述的靶向性寡核苷酸包括脱氧核糖核酸(dna)和/或核糖核酸(rna)。本文所述的靶向性寡核苷酸可以是单链寡核苷酸，也可以是双链寡核苷酸。
[0048]
在一些实施方式中，靶向性寡核苷酸是能够特异性结合至病原微生物(例如，病原微生物基因组)的独特靶位点(例如，与病原微生物基因组靶位点特异性互补)的寡核苷酸。所述病原微生物包括但不限于，病毒、支原体、衣原体、细菌和真菌。在另一些实施方式中，靶向性寡核苷酸是针对疾病或病症特异性靶位点的寡核苷酸。所述疾病或病症通常以一种或多种生物分子的异常活性(例如，过表达)或一种或多种生物分子的异常变异体活性为特征，其包括但不限于：癌前病症、癌症、组织纤维化、炎性疾病、遗传性疾病、发育异常等。
[0049]
在一些实施方式中，靶向性寡核苷酸可以是sirna或shrna。在一些实施方式中，靶向性寡核苷酸可以是sirna。
[0050]
在一个示例性实施方式中，靶向性寡核苷酸可以是针对转甲状腺素蛋白(ttr)基因中特异性位点的sirna，其在本文中也可称作“ttr靶向性sirna”。在一个具体实施方式中，所述ttr靶向性sirna可具有包含如seq id no:2所示的核苷酸序列的正义链。在一个更具体的实施方式中，所述ttr靶向性sirna具有包含经甲基化修饰的seq id no:2所示的核苷酸序列的正义链。例如，所述经甲基化修饰的seq id no:2所示的核苷酸序列可以是5
’-
mcagmugmumumcmumugmcmumcmuamuaadtdt-3’，其中m表示对应碱基的2'羟甲基化修饰。在一个具体实施方式中，所述ttr靶向性sirna可具有包含如seq id no:3所示的核苷酸序列的反义链。在一个更具体的实施方式中，所述ttr靶向性sirna具有包含经甲基化修饰的seq id no:3所示的核苷酸序列的反义链。例如，所述经甲基化修饰的seq id no:3所示的核苷酸序列可以是：5
’-
umuamuagagmcaagaamcacugdtdt-3’，其中m表示对应碱基的2'羟甲基化修饰。
[0051]
在一个具体实施方式中，所述ttr靶向性sirna可具有包含如seq id no:2所示的核苷酸序列的正义链和包含如seq id no:3所示的核苷酸序列的反义链。
[0052]
在一个示例性实施方式中，靶向性寡核苷酸是针对新型冠状病毒(sars-cov-2)(也可称作“新冠病毒”或“2019-ncov”)基因中特异性位点的sirna，其在本文中也可称作“新冠病毒靶向性sirna”或“sars-cov-2靶向性sirna”。在一个具体实施方式中，所述sars-cov-2靶向性sirna可具有包含如seq id no:4所示的核苷酸序列的正义链。在另一个具体实施方式中，所述sars-cov-2靶向性sirna可具有包含如seq id no:5所示的核苷酸序列的正义链。
[0053]
在一个示例性实施方式中，靶向性寡核苷酸是针对甲型流感病毒(iav)基因中特异性位点的sirna，其在本文中也可称作“甲型流感病毒靶向性sirna”。在一个具体实施方式中，所述甲型流感病毒靶向性sirna可具有包含如seq id no:6所示的核苷酸序列的正义链。在另一个具体实施方式中，所述甲型流感病毒靶向性sirna可具有包含如seq id no:7所示的核苷酸序列的正义链。所示例的甲型流感病毒靶向性sirna是具有广谱抗病毒活性的针对甲型流感病毒基因中高度保守序列设计的特异性位点的sirna。
[0054]
在一些实施方式中，所述分子探针载体与所述靶向性寡核苷酸可通过共价或非共价相互作用连接。在一些实施方式中，所述分子探针载体与所述靶向性寡核苷酸可通过非共价相互作用连接。
[0055]
另一方面，本发明提供一种用于制备分子探针的方法，其包括：
[0056]
使可检测标记物与细胞穿膜肽连接，以获得分子探针载体；和
[0057]
使所述分子探针载体与靶向性寡核苷酸孵育足以允许所述分子探针载体与所述
靶向性寡核苷酸之间连接的时间，以获得所述分子探针。
[0058]
本文所述的用于制备分子探针的方法包括提供细胞穿膜肽。
[0059]
在一些实施方式中，细胞穿膜肽可包含如seq id no:1所示的氨基酸序列。
[0060]
在一个实施方式中，细胞穿膜肽可包含在seq id no:1所示氨基酸序列的任何一或两个位点处包含一或两个氨基酸突变的氨基酸序列。在一个具体实施方式中，细胞穿膜肽可包含在seq id no:1所示氨基酸序列的任何一或两个位点处包含一或两个氨基酸突变的氨基酸序列，其中seq id no:1中的赖氨酸残基保持不变。所述氨基酸突变选自：添加、取代、缺失或其组合。所述氨基酸突变可出现在seq id no:1所示氨基酸序列的任何一端、两端或内部的相同或不同位置。
[0061]
在一些实施方式中，细胞穿膜肽的长度可在8至12个氨基酸范围内。在一些可选实施方式中，细胞穿膜肽的长度在以8、9、10、11、12中任选两个作为端点而形成的范围内。
[0062]
在一些实施方式中，细胞穿膜肽可具有与seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿膜肽由seq id no:1所示的氨基酸序列组成。
[0063]
在一些具体实施方式中，细胞穿膜肽可以是环肽。所述环肽由细胞穿膜肽氨基酸序列的首尾两个氨基酸残基相连而成。
[0064]
本文所述的细胞穿膜肽可根据本领域已知的多肽合成和/或修饰方法而获得。
[0065]
本文所述的用于制备分子探针的方法包括提供可检测标记物。在一个实施方式中，可检测标记物可以是造影剂。
[0066]
在一些实施方式中，可检测标记物可包括ct造影剂。在一些实施方式中，所述ct造影剂可包括选自下组的一种或多种：碘克沙醇、碘海醇、碘帕醇、碘普罗胺和碘佛醇。在一些具体实施方式中，所述造影剂是碘克沙醇(vsp)。
[0067]
在一些实施方式中，所述可检测标记物还可包括其它造影剂，例如，选自mri造影剂(例如，uspio)、荧光造影剂(例如，5-fam se)和放射性造影剂(例如，正电子核素18f或68ga)的一种或多种造影剂。
[0068]
在一些情况中，本文所述的用于制备分子探针的方法还可包括对可检测标记物进行修饰，以使修饰后的可检测标记物具有用于与细胞穿膜肽连接的部分。在一些实施方式中，所述连接可以是共价连接。
[0069]
在一些实施方式中，用于与细胞穿膜肽连接的部分可包含羧基。在一些实施方式中，用于与细胞穿膜肽连接的部分可包含亚烷基羧基。在一些实施方式中，所述亚烷基羧基可以是c
1-c
12
亚烷基羧基，例如，c
1-c
10
亚烷基羧基、c
1-c8亚烷基羧基、c
1-c6亚烷基羧基或c
1-c4亚烷基羧基。
[0070]
在可检测标记物为vsp的示例性实施方式中，vsp可经修饰以包含用于与细胞穿膜肽连接的部分。在一些实施方式中，用于与细胞穿膜肽连接的部分可包含羧基。在一些实施方式中，用于与细胞穿膜肽连接的部分可包含亚烷基羧基。在一些实施方式中，所述亚烷基羧基是c
1-c
12
亚烷基羧基，例如，c
1-c
10
亚烷基羧基、c
1-c8亚烷基羧基、c
1-c6亚烷基羧基或c
1-c4亚烷基羧基。在一些实施方式中，vsp可经修饰以包含用于与细胞穿膜肽连接的部分，所述用于与细胞穿膜肽连接的部分包含-(ch2)ncooh，其中n可以是1至10的整数。在一些可选实施方式中，n可以是1至8的整数。在一些可选实施方式中，n可以是1至6的整数，具体地是1
至4的整数，更具体地是2、3或4。
[0071]
在一个示例性实施方式中，修饰后的vsp具有下式(ii)所示结构：
[0072][0073]
本文所述的用于制备寡核苷酸分子探针的方法包括使可检测标记物与细胞穿膜肽连接，以获得分子探针载体。
[0074]
在一些实施方式中，所述可检测标记物与细胞穿膜肽的连接可以是共价连接。在一些实施方式中，可检测标记物可与细胞穿膜肽通过酰胺键连接。在一些实施方式中，可检测标记物可通过所带羧基与细胞穿膜肽所含的一个氨基酸残基上的氨基形成酰胺键来与细胞穿膜肽连接。在一个具体实施方式中，可检测标记物可与细胞穿膜肽所含的赖氨酸残基连接。
[0075]
在可检测标记物为经修饰以包含用于与细胞穿膜肽连接的部分(例如，含羧基部分)的vsp的示例性实施方式中，经修饰的vsp可与细胞穿膜肽通过酰胺键连接。例如，经修饰的vsp可通过所带羧基与细胞穿膜肽所含的一个氨基酸残基上的氨基形成酰胺键来与细胞穿膜肽连接。在一些实施方式中，经修饰的vsp可与细胞穿膜肽所含的赖氨酸残基连接。在一个示例性的具体实施方式中，经修饰的vsp可通过用于与细胞穿膜肽连接的部分，例如-(ch2)ncooh，其中n可以是1至10的整数，与细胞穿膜肽所含的赖氨酸残基上的氨基连接。在一些可选实施方式中，n可以是1至8的整数。在一些可选实施方式中，n可以是1至6的整数，具体地是1至4的整数，更具体地是2、3或4。
[0076]
在一些情况中，在使可检测标记物与细胞穿膜肽连接之前，所述方法还可包括使可检测标记物的末端羧基活化。在一些示例性的实施方式中，所述活化可利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基硫代琥珀酰亚胺(磺基-nhs)进行。
[0077]
在一些实施方式中，可通过将可检测标记物与细胞穿膜肽混合或孵育使两者连接。在一些实施方式中，所述混合或孵育可进行1至4小时，例如1至3小时，例如2至3小时的一段时间。
[0078]
在一些实施方式中，所述混合或孵育可在室温条件下进行。在一些实施方式中，可检测标记物与细胞穿膜肽可按3:1至1:3，例如，2.5:1至1:2.5、2:1至1:2、1:1.5至1.5:1或1:1的摩尔比混合。
[0079]
在一些情况中，本文所述的用于制备分子探针的方法还可包括从可检测标记物与细胞穿膜肽的混合反应物中分离与细胞穿膜肽连接的可检测标记物，作为分子探针载体。在一些实施方式中，所述分离可通过选自离心分离法和hplc分离法的分离方法进行。
[0080]
本文所述的用于制备分子探针的方法进一步包括使所得分子探针载体与靶向性
寡核苷酸孵育足以允许所述分子探针载体与所述靶向性寡核苷酸之间发生连接的时间，以获得所述分子探针。
[0081]
在一些实施方式中，所述分子探针载体与所述靶向性寡核苷酸可通过共价或非共价相互作用连接。在一些实施方式中，所述分子探针载体与所述靶向性寡核苷酸可通过非共价相互作用连接。
[0082]
所述靶向性寡核苷酸可以是单链寡核苷酸，也可以是双链寡核苷酸。
[0083]
在一些实施方式中，靶向性寡核苷酸是能够特异性结合至病原微生物(例如，病原微生物基因组)的独特靶位点(例如，与病原微生物基因组靶位点特异性互补)的寡核苷酸。所述病原微生物包括但不限于，病毒、支原体、衣原体、细菌和真菌。在另一些实施方式中，靶向性寡核苷酸是针对疾病或病症特异性靶位点的寡核苷酸。所述疾病或病症通常以一种或多种生物分子的异常活性(例如，过表达)或一种或多种生物分子的异常变异体活性为特征，其包括但不限于：癌前病症、癌症、组织纤维化、炎性疾病、遗传性疾病、发育异常等。
[0084]
在一些实施方式中，靶向性寡核苷酸可以是sirna或shrna。在一些实施方式中，靶向性寡核苷酸可以是sirna。
[0085]
在一个示例性实施方式中，靶向性寡核苷酸可以是ttr靶向性sirna。在一个具体实施方式中，所述ttr靶向性sirna可具有包含如seq id no:2所示的核苷酸序列的正义链。在一个更具体的实施方式中，所述ttr靶向性sirna具有包含经甲基化修饰的seq id no:2所示的核苷酸序列的正义链。例如，所述经甲基化修饰的seq id no:2所示的核苷酸序列可以是5
’-
mcagmugmumumcmumugmcmumcmuamuaadtdt-3’，其中m表示对应碱基的2'羟甲基化修饰。在一个具体实施方式中，所述ttr靶向性sirna可具有包含如seq id no:3所示的核苷酸序列的反义链。在一个更具体的实施方式中，所述ttr靶向性sirna具有包含经甲基化修饰的seq id no:3所示的核苷酸序列的反义链。例如，所述经甲基化修饰的seq id no:3所示的核苷酸序列可以是：5
’-
umuamuagagmcaagaamcacugdtdt-3’，其中m表示对应碱基的2'羟甲基化修饰。
[0086]
在一个具体实施方式中，所述ttr靶向性sirna可具有包含如seq id no:2所示的核苷酸序列的正义链和包含如seq id no:3所示的核苷酸序列的反义链。
[0087]
在一个示例性实施方式中，靶向性寡核苷酸可以是sars-cov-2靶向性sirna。在一个具体实施方式中，所述sars-cov-2靶向性sirna可具有包含如seq id no:4所示的核苷酸序列的正义链。在另一个具体实施方式中，所述sars-cov-2靶向性sirna可具有包含如seq id no:5所示的核苷酸序列的正义链。
[0088]
在一个示例性实施方式中，靶向性寡核苷酸可以是甲型流感病毒靶向性sirna。在一个具体实施方式中，所述甲型流感病毒靶向性sirna可具有包含如seq id no:6所示的核苷酸序列的正义链。在另一个具体实施方式中，所述甲型流感病毒靶向性sirna可具有包含如seq id no:7所示的核苷酸序列的正义链。
[0089]
在一些实施方式中，使分子探针载体与靶向性寡核苷酸可按5:1至30:1，例如，10:1至25:1，15:1至20:1的摩尔比混合，用于孵育。在一些实施方式中，混合介质可以是水性液体，例如纯水或水性溶液(如细胞培养基)。在一些实施方式中，所述孵育在环境温度(例如室温条件，例如，15℃至25℃)进行。在一些实施方式中，所述孵育持续10至30分钟，例如，10至20分钟，例如15至20分钟。
[0090]
在一些实施方式中，孵育后所得的分子探针无需进一步纯化即可直接使用。
[0091]
在一些实施方式中，所述分子探针可制备用于体内或体外核酸检测。
[0092]
在一些实施方式中，本文所述的分子探针载体的制备(例如，可检测标记物与细胞穿膜肽的连接)能够采用一步法完成。
[0093]
在一些实施方式中，分子探针载体与靶向性寡核苷酸的孵育可在检测前即刻进行。在一些实施方式中，本文所述的分子探针能够由分子探针载体(也即，可检测标记物与细胞穿膜肽的连接物)与靶向性寡核苷酸通过一步法制备获得。相对于现有的多步骤探针合成方法，本文所述的分子探针制备方法简单、高效、对原材料利用率高且产废少。本文所述的方法实用性好，适合分子探针的批量化生产。
[0094]
另一方面，本发明提供一种用于核酸检测的方法，其包括：
[0095]
向对象或来自对象的样品给予本文所述的分子探针；和
[0096]
通过检测所述对象或来自对象的样品中的可检测标记物来确定靶核酸的存在和/或水平。
[0097]
在一些实施方式中，所述对象是动物，例如哺乳动物，例如人类。
[0098]
在一些实施方式中，所述核酸检测可以是体内核酸检测。在一些实施方式中，所述分子探针可通过注射(如肌肉内注射、静脉注射等)、口服、吸入(如雾化吸入)中的一种或多种方式给予。在一些实施方式中，所述分子探针通过雾化吸入方式给予。在一些实施方式中，分子探针可以6.5至32.5mg/kg对象体重的范围的量给予。在一些实施方式中，可在给予所述分子探针后1至4小时，优选2至3小时进行检测。
[0099]
在一些实施方式中，所述检测可包括但不限于，ct检测、mri检测、荧光检测、放射性核素检测等。在一些实施方式中，所述检测是ct检测。
[0100]
在一些实施方式中，所述核酸检测可以是体外核酸检测。在一些实施方式中，来自对象的样品是取自对象的含细胞的离体样品。例如，含细胞的组织或细胞群(例如活检物、组织标本、细胞悬浮液等)。在一些实施方式中，所述含细胞的离体样品可以是单细胞悬浮液或贴壁细胞培养物。在一些实施方式中，分子探针的给予可包括使来自对象的样品与本文所述的分子探针接触(例如，孵育)。在所述含细胞的离体样品为附着生长型细胞培养物的实施方式中，可在细胞汇合达30％至80％，优选40％至70％时加入分子探针。在一些实施方式中，加入分子探针后，使样品与分子探针在适于细胞培养的条件(例如，37℃，5％co2)孵育。在一些实施方式中，所述孵育可进行12至36小时，任选地12至24小时，例如18至24小时。
[0101]
在一些实施方式中，所述方法还任选地包括在孵育结束后，用细胞培养基(例如，含20％胎牛血清的细胞培养基)对细胞进行半量换液。本文中，细胞的“半量换液”指的是弃掉一半旧的培养基，并添加一半新培养基至细胞培养皿中。在一些实施方式中，可于孵育结束后80分钟至72小时，例如4至48小时，例如4至24小时，例如8至12小时进行检测。
[0102]
在一些实施方式中，所述方法还可任选地包括在检测前清洗细胞，以去除未与靶基因结合且被细胞排出的分子探针。在一些实施方式中，所述清洗可采用pbs或细胞培养基(例如，含20％胎牛血清的细胞培养基)进行2至3次。
[0103]
在一些实施方式中，所述方法可包括在给予本文所述的分子探针之前，由本文所述的分子探针载体和靶向性寡核苷酸制备分子探针。
[0104]
在一些实施方式中，由本文所述的分子探针载体和靶向性寡核苷酸制备分子探针可通过一步法完成，也即，该分子探针的制备可通过将所述分子探针载体和靶向性寡核苷酸混合并孵育而完成，无需进一步处理即可用于检测。
[0105]
在一些实施方式中，分子探针载体可包含如上所述的与细胞穿膜肽连接的可检测标记物。在一些实施方式中，所述方法可包括使分子探针载体与靶向性寡核苷酸按5:1至30:1，例如，10:1至25:1，15:1至20:1的摩尔比混合，用于孵育。在一些实施方式中，混合介质可以是水性液体，例如纯水或水性溶液(如细胞培养基)。在一些实施方式中，所述方法可包括使分子探针载体与靶向性寡核苷酸的混合物在环境温度(例如，室温，例如15℃至25℃)孵育。在一些实施方式中，所述孵育可持续10至30分钟，例如，10至20分钟，例如15至20分钟。
[0106]
本公开内容中提供的用于核酸检测的方法允许在检测前即刻通过一步法由分子探针载体与靶向性寡核苷酸制成分子探针。该分子探针的制备便捷、安全，且所制成的分子探针无需进一步处理即可用于检测。
[0107]
进一步地，相较于当前用于核酸检测的探针(例如带有放射性核素或荧光标记的探针)，本公开内容中提供的探针无放射性污染，且受背景光干扰较低，因而能够提供改善的检测准确性。
[0108]
另一方面，本发明提供一种用于核酸检测的试剂盒，其包含：
[0109]
含有本文所述的分子探针载体的容器；
[0110]
含有靶向性寡核苷酸的容器；和
[0111]
任选的，使用说明。
[0112]
在一些实施方式中，所述试剂盒可用于体内检测。在另一些实施方式中，所述试剂盒可用于体外检测。
[0113]
在一些实施方式中，所述靶向性寡核苷酸可以是即用溶液(无需进一步稀释即可使用)、浓缩液或冻干形式。
[0114]
在一些实施方式中，所述分子探针载体可以是即用溶液(无需进一步稀释即可使用)、浓缩液或冻干形式。
[0115]
在一些可选实施方式中，所述试剂盒还可包含用于混合分子探针载体和靶向性寡核苷酸的介质，例如水性液体，例如纯水或水性溶液(如细胞培养基)。在一些可选实施方式中，所述试剂盒还可包含用于稀释和/或混合分子探针载体和/或靶向性寡核苷酸的一个或多个器具(例如，一个或多个容器)。
[0116]
实施例
[0117]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
[0118]
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0119]
实施例1：细胞穿膜肽-vsp分子探针载体的制备
[0120]
发明人经过研究发现，相对于线性细胞穿膜肽，采用环状细胞穿膜肽获得的细胞转染效果更佳。在本发明的示例性实施例中，采用氨基酸序列为如seq id no:1所示氨基酸序列的环肽(下文中简称“cp”)作为细胞穿膜肽，用于下述实验。
[0121]
本实施例中，采用造影剂vsp-320(ge healthcare，产品编号1181607chn)作为可检测标记物。
[0122]
a).vsp结构及修饰
[0123]
采用vsp-320，vsp-320具有下式(i)所示结构：
[0124][0125]
在式(i)的vsp-320基础上进行修饰，使其增加一末端修饰为羧基的碳链，形成新的威视派克(cvsp)，其具有下式(ii)所示结构：
[0126][0127]
b).利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc，sigma，产品编号e7750)和n-羟基硫代琥珀酰亚胺(磺基-nhs，sigma，产品编号56485)活化cvsp末端羧基，具体方案如下：
[0128]
a.向1ml的cvsp溶液(10mg/ml)中加入11.93mg的dec(终浓度为0.0623mm/ml)，然后向溶液中加入32.58mg的磺基-nhs(终浓度为0.156mm/ml)；
[0129]
b.混合物充分混匀，室温下反应15分钟；
[0130]
c.向反应溶液中加入浓pbs(10
×
)将缓冲液的ph值提高至7.0以上，以终止上述反应；
[0131]
c).环肽中赖氨酸中的氨基与末端活化的cvsp反应得到探针载体，具体方案如下：
[0132]
a.向上述b).c的反应液中加入6.85mg环肽，充分混合溶液，室温下反应2h；
[0133]
b.反应结束后，将0.33mg的羟胺加入到上述溶液中，使其终浓度为10mm以猝灭反应；
[0134]
d).通过hplc对上述产物进行分离，得到最终产物vsp-cp。
[0135]
图1显示了细胞穿膜肽-vsp分子探针载体制备的实验流程图。
[0136]
实施例2：细胞穿膜肽-vsp-ttr靶向性sirna分子探针的制备
[0137]
采用针对肝脏纤维化特异性标志物基因ttr的sirna(由吉玛基因定制合成)，其序列如下所示：
[0138]
正义链：5
’-
mcagmugmumumcmumugmcmumcmuamuaadtdt-3’[0139]
反义链：5
’-
umuamuagagmcaagaamcacugdtdt-3’[0140]
其中，m表示对应碱基的2'羟甲基化修饰。
[0141]
分子探针的制备过程：
[0142]
a).将sirna加入到depc水中，使其终浓度为5μm/ml，待用；
[0143]
b).将分子探针载体vsp-cp与sirna按照20:1的摩尔比例混合，室温下孵育15-20分钟；
[0144]
c).分子探针载体vsp-cp与sirna之间发生非共价结合，制备成完整的分子探针。
[0145]
所得分子探针可立即用于体外细胞检测或雾化吸入检测。
[0146]
实施例3：采用细胞穿膜肽-vsp-ttr靶向性sirna分子探针的靶核酸检测
[0147]
a).将大鼠brl3a细胞(购自atcc)接种于六孔板中，细胞密度为1.2
×
105/孔，加入1.5ml mem含血清培养基，37℃，5％co2条件下孵育24h，使细胞汇合达到40-70％；
[0148]
b).制备转染所需的分子探针：
[0149]
a.a液用无血清培养基稀释sirna，终量600μl，浓度0.4nm/μl；
[0150]
b.b液用无血清培养基稀释vsp-cp，终量600μl，浓度8nm/μl；
[0151]
c.混合a、b液，轻轻混匀，室温放置15-20分钟，形成vsp-cp-sirna分子探针；
[0152]
c).转染准备：用无血清培养基清洗两次细胞，向细胞中加入无血清培养基1.3ml/孔；
[0153]
d).将vsp-cp-sirna分子探针混合物加入到六孔板中，200μl/孔，轻轻地摇晃细胞培养板，37℃，5％co2条件下孵育24h。
[0154]
e).在孵育后80分钟，4小时，8小时，12小时，24小时，48小时，和72小时，用pbs清洗细胞2-3次，通过ct对细胞进行检测。
[0155]
实施例4：验证针对ttr的sirna靶向ttr mrna的效果
[0156]
本实施例中，通过实验验证针对ttr的sirna靶向ttr mrna的效果。
[0157]
检测结果示于图2。图2a、2b和2c显示大鼠肝细胞brl3a体外转染12h后的荧光成像结果。其中，图2a为转染ttr靶向性sirna的结果；图2b为转染阴性对照nc-sirna的结果；图2c为未经转染的空白对照组的结果。图2d显示转染ttr靶向性sirna、转染阴性对照nc-sirna和未经转染的空白对照组在不同时间点的荧光密度曲线。
[0158]
结果中可以看出，图2a所见荧光亮度明显高于图2b和2c，表明ttr靶向性sirna成功进入细胞并与胞内ttr靶位点特异性结合。由图2d可见，在转染后80分钟brl3a细胞中开始逐渐显现荧光，之后荧光逐渐在细胞内积累，细胞内的荧光密度在转染后8h急剧升高，并于12h达到峰值，之后荧光密度开始下降，并于24h之后逐渐平稳。推定最佳检测时间在探针孵育后的约12h。
[0159]
进一步通过western印迹分析ttr靶向性sirna靶向ttr mrna的作用效果。40nm的ttr靶向性sirna或nc-sirna利用n-ter作为载体转染brl3a细胞，48h后提取细胞蛋白，进行western印迹以检测细胞中ttr蛋白的表达。未处理的brl3a细胞作为空白对照，β-肌动蛋白作为内参。结果示于图3。
[0160]
图3结果显示，ttr靶向性sirna能够靶向并与ttr mrna相互作用，进而抑制ttr蛋白的表达。
[0161]
实施例5：验证肝脏纤维化模型鼠中ttr的异常表达。
[0162]
该实施例中，验证了相对于正常肝脏而言，肝脏纤维化病症下的组织异常状态及ttr蛋白的异常表达。
[0163]
实验方案：
[0164]
健康组和肝纤维化模型组的大鼠在成像扫描结束后立即处死，获取肝脏标本。将肝脏标本在10％甲醛中固定14天后，获取组织5μm石蜡切片。对健康组和肝纤维化模型组的大鼠的肝脏标本均进行he染色、masson染色和ttr分子病理染色并进行比较分析。
[0165]
he染色具体步骤：
[0166]
1、将石蜡切片放置于烤箱中60℃，过夜；
[0167]
2、将切片从烤箱中取出，立即放入二甲苯中。切片依次使用两组二甲苯各处理20分钟，两组100％乙醇各处理5分钟，两组95％乙醇各处理5分钟，脱蜡入水；
[0168]
3、tpbs(含0.05％tween-20的pbs)，洗3次，每次2分钟，放入蒸馏水中；
[0169]
4、苏木素对切片进行染色3-5分钟；
[0170]
5、盐酸酒精分化；
[0171]
6、氨水返蓝20s；
[0172]
7、伊红染色2-3分钟；
[0173]
8、甩干，脱水。依次使用两组95％乙醇各处理5分钟，两组100％乙醇各处理5分钟，两组二甲苯各处理20分钟。中性树脂封片。
[0174]
masson染色具体步骤：
[0175]
1、将石蜡切片放置于烤箱中60℃，过夜；
[0176]
2、将切片从烤箱中取出，立即放入二甲苯中，切片依次使用两组二甲苯各处理20分钟，两组100％乙醇各处理5分钟，两组95％乙醇各处理5分钟，脱蜡入水；
[0177]
3、1％高锰酸钾对切片进行氧化5分钟；
[0178]
4、蒸馏水冲洗，草酸漂白1分钟；
[0179]
5、蒸馏水冲洗，天青石蓝染色5分钟；
[0180]
6、不要水洗，直接用regaud苏木精染液染核3-5分钟；
[0181]
7、蒸馏水进行充分清洗；
[0182]
8、用masson丽春红酸性复红液5-10分钟；
[0183]
9、以2％冰醋酸水溶液浸洗1分钟；
[0184]
10、1％磷钼酸水溶液分化3-5分钟；
[0185]
11、不经水洗，直接用苯胺蓝染色5分钟；
[0186]
12、0.2％冰醋酸水溶液浸洗1分钟；
[0187]
13、甩干，脱水。依次使用两组95％乙醇各处理5分钟，两组100％乙醇各处理5分钟，两组二甲苯各处理20分钟。中性树脂封片。
[0188]
ttr分子病理染色具体步骤：
[0189]
1、将石蜡切片放置于烤箱中60℃，过夜；
[0190]
2、将切片从烤箱中取出，立即放入二甲苯中。切片依次使用两组二甲苯各处理20
分钟，两组100％乙醇各处理5分钟，两组95％乙醇各处理5分钟，脱蜡入水；
[0191]
3、tpbs(含0.05％tween-20的pbs)，洗3次，每次2分钟，放入蒸馏水中；
[0192]
4、切片置于枸橼酸盐缓冲液(ph6.0)中，放入微波炉中，中高火4-5分钟(至沸腾)，温度95℃以上，中低火维持15分钟，室温自然冷却；
[0193]
5、切片置于蒸馏水中浸泡3分钟，tpbs洗3次，每次2分钟；
[0194]
6、滴加辣根酶阻断剂(3％h2o2)，室温湿盒中孵育15分钟，以消除内源性hrp活性；
[0195]
7、tpbs洗3次，每次2分钟；
[0196]
8、滴加封闭用正常羊血清工作液(10％正常羊血清原液，用pbs稀释)，室温湿盒孵育30分钟，吸取血清，勿洗；
[0197]
9、按1:200滴加anti-ttr(羊血清工作液稀释)。4℃，湿盒，过夜；
[0198]
10、第二天，将切片平衡至室温，tpbs洗3次，每次2分钟；
[0199]
11、滴加pv-9001kit(中杉金桥)中的试剂1，湿盒孵育20分钟；
[0200]
12、tpbs洗3次，每次2分钟；
[0201]
13、滴加pv-9001kit(中杉金桥)中的试剂2，湿盒孵育30分钟；
[0202]
14、tpbs洗3次，每次2分钟；
[0203]
15、临用前配置dab工作液；
[0204]
16、在每张切片上加30-40μl或足以覆盖组织的上述工作液，显微镜下观察显色情况；
[0205]
17、蒸馏水涮洗以终止反应；
[0206]
18、苏木素复染2分钟，蒸馏水清洗5分钟；
[0207]
19、pbs浸泡3分钟，返蓝，自来水清洗；
[0208]
20、甩干，脱水。依次使用两组95％乙醇各处理5分钟，两组100％乙醇各处理5分钟，两组二甲苯各处理20分钟。中性树脂封片。
[0209]
实验结果示于图4。其中，图4a-4c显示健康大鼠的he、masson和ttr蛋白免疫组化染色结果；图4d-4f显示肝脏纤维化模型鼠的he、masson和ttr蛋白免疫组化染色结果。
[0210]
结果表明肝脏纤维化模型大鼠的肝脏ttr蛋白表达量显著高于正常健康大鼠的肝脏，因此肝脏ttr蛋白可以作为肝脏纤维化的检测指标。
[0211]
实施例6：采用18f-ttr靶向性sirna探针对健康和肝脏纤维化模型大鼠进行体内检测。
[0212]
该实施例中，采用18f-ttr靶向性sirna探针对健康和肝脏纤维化模型大鼠进行体内检测。
[0213]
实验方案：
[0214]
健康组和肝纤维化模型组的大鼠在硫酰胺溶液治疗后的第四周进行pet/ct成像。在成像前，大鼠禁水6小时并禁食。成像前，大鼠以0.3ml/100g的量腹腔注射10％的氯水合物，进行麻醉。肝脏纤维化模型和对照组的大鼠均通过尾静脉注射0.5mci 18f-ttr靶向性sirna探针。对大鼠进行动态扫描，pet扫描层厚度为3.75毫米，ct扫描参数为80kv、50ma、层厚度3.75mm。ct扫描结束后，持续进行pet动态扫描60分钟，并在第80分钟进行常规扫描。通过sharpir、vue point hd图像重建技术以及osem迭代重建方法，对采集的图像进行预处理。通过ge aw4.5和xeleris 3.0工作站对图像进行处理。构建了三维pet和ct和融合图像
的大鼠肝脏的横截面、矢状面、冠状面和放射性时间曲线。
[0215]
图5显示健康大鼠和肝脏纤维化模型大鼠的肝脏对18f-ttr靶向性sirna分子探针的获取情况。其中，图5a和5c分别为向肝脏纤维化模型组大鼠注射分子探针后60分钟对探针积累的伪色和灰度pet成像；图5b和5d分别为向健康组大鼠注射分子探针后60分钟对探针积累的伪色和灰度pet成像；图5e为肝脏纤维化模型组及健康大鼠肝脏中分子探针的放射性时间曲线。
[0216]
结果表明肝脏纤维化大鼠和健康鼠的肝脏放射性随时间而减少。两组之间的放射性差异自注射探针后第24分钟开始出现，健康大鼠肝脏的追踪率在扫描结束时(注射后80分钟)变得显著。
[0217]
综合图4和5的结果，证明利用靶向ttr mrna的分子探针能够对肝脏纤维化进行非侵入性检测。
[0218]
实施例7：其它细胞穿膜肽-vsp-sirna分子探针的制备
[0219]
本实施例中，制备含有其它疾病特异性sirna分子的cp-vsp-sirna分子探针，以供其它疾病的核酸检测。
[0220]
(1)细胞穿膜肽-vsp-新冠病毒靶向性sirna分子探针的制备
[0221]
采用针对新冠病毒基因的sirna(由吉玛基因定制合成)，其序列如下所示：
[0222]
正义链包含：5
’-
gcgaaauaccaguggcuuadtdt-3’(seq id no:4)；
[0223]
或5
’-
gcuacuaauggaccacuuadtdt-3’(seq id no:5)。
[0224]
分子探针制备过程：
[0225]
a).将sirna分别加入到depc水中，使其终浓度为5μm/ml，待用；
[0226]
b).将分子探针载体vsp-cp(根据实施例1中所述制备)与sirna按照20:1的摩尔比例混合，室温下孵育15-20分钟；
[0227]
c).分子探针载体vsp-cp与sirna之间通过非共价相互作用结合，制备成完整的分子探针。所得分子探针可立即用于体外细胞检测或雾化吸入检测。
[0228]
(2)细胞穿膜肽-vsp-流感病毒靶向性sirna分子探针的制备
[0229]
采用针对甲型流感病毒基因的sirna(由吉玛基因定制合成)，其序列如下所示：
[0230]
正义链包含：5
’-
caagcaguguguacauugadtdt-3’(seq id no:6)；
[0231]
或5
’-
ggagacgugguguugguaadtdt-3’(seq id no:7)。
[0232]
分子探针制备过程：
[0233]
a).将sirna分别加入到depc水中，使其终浓度为5μm/ml，待用；
[0234]
b).将分子探针载体vsp-cp(根据实施例1中所述制备)与sirna按照20:1的摩尔比例混合，室温下孵育15-20分钟；
[0235]
c).分子探针载体vsp-cp与sirna之间通过非共价相互作用结合，制备成完整的分子探针。所得分子探针可立即用于体外细胞检测或雾化吸入检测。
[0236]
实施例8：根据实施例7的分子探针的体外核酸检测
[0237]
a).将取样自待检测对象的细胞(附着生长型)接种于六孔板中，细胞密度为1.2
×
105/孔，加入1.5ml mem含血清培养基，37℃，5％co2条件下孵育24h，使细胞汇合达到40-70％；
[0238]
b).检测前即刻制备转染所需分子探针：
[0239]
a.a液：用无血清培养基稀释sirna(根据实施例7中所述的sirna)，终量600μl，浓度0.4nm/μl；
[0240]
b.b液：用无血清培养基稀释vsp-cp(根据实施例1所述制备的vsp-cp分子探针)，终量600μl，浓度8nm/μl；
[0241]
c.混合a、b液，轻轻混匀，室温放置15-20分钟，形成vsp-cp-sirna分子探针；
[0242]
c).转染准备：用无血清培养基清洗两次细胞，向细胞中加入无血清培养基1.3ml/孔；
[0243]
d).将步骤b)中制得的vsp-cp-sirna分子探针制备混合物加入到六孔板中，200μl/孔，轻轻地摇晃细胞培养板，37℃，5％co2条件下孵育12h。
[0244]
e).用含20％胎牛血清培养基对细胞进行半量换液，37℃，5％co2条件下留置80分钟至72小时的时间，用培养基清洗细胞，ct观测细胞影像并检测靶标的存在和/或水平。
[0245]
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
[0246]
[0247]
[0248]