一类功能性单链环状聚(β-氨基酯)及其制备方法和基因递送药物应用与流程

一类功能性单链环状聚(
β-氨基酯)及其制备方法和基因递送药物应用
技术领域
1.本发明属于生物医用材料领域，涉及一类功能性单链环状聚(β-氨基酯)及其制备方法和基因递送药物应用。


背景技术：

2.基因治疗是指使用一定的方法将具有特异性功能的dna或rna等基因材料递送进入靶向组织细胞，替换其中的病变基因或抑制病变基因的表达，已成为治疗各种遗传性疾病(如隐性营养不良性大疱疹表皮松懈症等)或获得性疾病(如帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、类风湿性关节炎等)最有前景的治疗方法之一。但目前，缺乏安全而有效的非病毒基因载体极大地限制了基因治疗在临床中的应用。
3.阳离子聚合物载体作为目前最具代表性的非病毒基因载体之一，已经有大量的报道。目前，常用的阳离子聚合物如聚乙烯亚胺基转染效率高，但其降解性能差因而造成较高的细胞毒性，常用的聚赖氨酸细胞相容性良好，但转染效率较低，需要较为复杂的功能化改性以提高其转染性能。也就是说，阳离子聚合物载体转染效率和细胞毒性的不可兼容性严重阻碍了其在临床上的应用。
4.聚(β-氨基酯)作为一种高效可降解的阳离子聚合物载体已经成为目前最具潜力的新型聚合物载体之一。目前关于聚(β-氨基酯)主要的研究集中在线性结构和超支化结构，虽然已经表现出一定的应用潜力，但由于目前制备聚(β-氨基酯)主要采用简单高效的迈克尔加成方法，产物往往分子量分布较宽，批次与批次之间不可避免存在差异。但目前对相同组分、不同分子量的聚(β-氨基酯)hpae的分离，几乎毫无办法，极大地限制了其临床审批及大规模应用。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一类功能性单链环状聚(β-氨基酯)及其制备方法和基因递送药物应用。
6.为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
7.本发明公开了一类功能性单链环状聚(β-氨基酯)，所述功能性单链环状聚(β-氨基酯)的结构式如下：
[0008][0009]
式中，r1为双丙烯酸酯类单体；r2为小分子有机胺；r3为封端剂单体；p＝10-25，q＝15-30，n＝4-12，m＝4-13。
[0010]
优选地，所述功能性单链环状聚(β-氨基酯)的分子量在10000-60000da范围内。
[0011]
优选地，所述双丙烯酸酯类单体为1,4-丁二醇二丙烯酸酯、2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、二乙二醇双丙烯酸酯、四甘醇二丙烯酸酯、双酚a聚氧乙烯醚二丙烯酸酯或1,1，-异亚丙基双(对亚苯氧基)二-2-丙醇二丙烯酚酯。
[0012]
优选地，所述小分子有机胺为5-氨基-1-戊醇、4-氨基-1-丁醇、十二胺或十八胺。
[0013]
优选地，所述封端剂单体为1,2-乙二胺、1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、1,6-己二胺、1,11-二氨基-3,6,9-三氧杂十一烷、1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪、1-(2-氨基乙基)哌嗪、n-(3-氨丙基)吗啉、n-(2-氨基乙基)吗啉、2-甲基-2-吗啉-4-基丙烷-1-胺或4-氨甲基苯基硼酸。
[0014]
本发明还公开了上述的功能性单链环状聚(β-氨基酯)的合成方法，包括以下步骤：
[0015]
1)将双丙烯酸酯类单体与小分子有机胺通过迈克尔加成反应制得带双键的线性聚(β-氨基酯)；
[0016]
2)对步骤1)制备的带双键的线性聚(β-氨基酯)通过可逆加成断裂链转移聚合反应，制备出结构和组成可控的单链多环状聚(β-氨基酯)；
[0017]
3)对步骤2)制备的单链多环状聚(β-氨基酯)加入封端剂单体进行功能化封端处理，制备出功能性单链环状聚(β-氨基酯)。
[0018]
优选地，步骤1)中，所述双丙烯酸酯类单体和小分子有机胺的反应投料摩尔比为0.5：1～1.5：1。
[0019]
优选地，步骤2)中，所述可逆加成断裂链转移聚合反应是将步骤1)制备的带双键的线性聚(β-氨基酯)和链转移剂cta加入反应溶剂中充分溶解，然后在氮气气氛下，加入引发剂偶氮二异丁氰；
[0020]
其中，带双键的线性聚(β-氨基酯)和链转移剂cta的反应投料摩尔比为1000:1-100:1；引发剂偶氮二异丁氰与链转移剂cta的反应投料摩尔比为1:2～1:5。
[0021]
优选地，步骤3)中，封端剂单体与单链多环状聚(β-氨基酯)的反应投料摩尔比为1:1～5:1。
[0022]
本发明还公开了上述的功能性单链环状聚(β-氨基酯)作为阳离子聚合物载体的应用，所述功能性单链环状聚(β-氨基酯)用于递送基因药物至组织细胞。
[0023]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0024]
本发明公开的功能性单链多环状聚(β-氨基酯)，其主链由线性低分子量聚(β-氨基酯)组成，是一类结构全新的功能性多环状聚合物。通过改变主链中线性低聚(β-氨基酯)的组成和比例、聚合物分子量及环化度，可制备出的多环状聚(β-氨基酯)，产物具有较窄的pdi和较高的转染效率。该功能性单链多环状聚(β-氨基酯)具有全新的单链多环结构，电荷密度和组成易于调节，可生物降解，以及良好的生物相容性，与目前本领域技术中主要采用商业化转染试剂xfect、jetpei相比，本发明公开的功能性单链多环状聚(β-氨基酯)更具临床潜力。
[0025]
进一步地，本发明的功能性单链多环状聚(β-氨基酯)的分子量在10000-60000da范围内，所得产物呈现多环结构和窄的pdi。
[0026]
本发明还公开了上述的功能性单链多环状聚(β-氨基酯)的合成方法，通过使用商业化的双丙烯酸酯和小分子有机胺，先以迈克尔加成策略制备出低分子量和pdi较窄(带双键的)的线性聚(β-氨基酯)，然后将制得的线性聚(β-氨基酯)以一锅法通过raft聚合反应制备出结构和组成可控的单链多环状聚(β-氨基酯)，再通过功能化封端处理，制得功能性单链环状聚(β-氨基酯)，该合成方法成本低、合成路径简单，对设备要求低，适合产业化放大生产。
[0027]
本发明还公开了上述功能性单链多环状聚(β-氨基酯)的用途，通过实验证实其是一类全新结构的具有高转染效率低毒的基因递送载体，同时在多种组织细胞(hela细胞，hct 166细胞，hepg2细胞，a549细胞，cos-7细胞，sy5y细胞，hacat细胞，l929细胞，mcf7细胞，3t3细胞，vec细胞，hpdf细胞，rdebf细胞，rdebk细胞)中验证了发明的准确性和广泛的适用性。
附图说明
[0028]
图1为单链多环状聚(β-氨基酯)合成示意图及主要的单体种类；
[0029]
图2为单链多环状聚(β-氨基酯)在25℃时的物理相态示意图；
[0030]
图3为代表性单链多环状聚(β-氨基酯)的1hnmr谱图；
[0031]
图4为单链多环状聚(β-氨基酯)纯化后凝胶渗透色谱(gpc)曲线；其中，(a)为分子量约为30,000da的单链多环状聚(β-氨基酯)；(b)为分子量约为40,000da的单链多环状聚(β-氨基酯)；
[0032]
图5为单链环状聚(β-氨基酯)转染编码绿色荧光蛋白(gfp)dna后细胞的荧光照片；
[0033]
图6为在不同的细胞中不同浓度的单链多环状聚(β-氨基酯)转染编码荧光素霉(gluc)dna后的效率；其中，(a)为hela细胞；(b)为hct166细胞；
[0034]
图7为在不同的细胞中不同浓度的单链多环状聚(β-氨基酯)转染后的细胞成活率；其中，(a)为hela细胞；(b)为hct166细胞。
具体实施方式
[0035]
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
[0036]
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
[0037]
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
[0038]
本发明公开的一类功能性单链环状聚(β-氨基酯)的合成方法，合成路线参见图1，包括以下步骤：
[0039]
1)将双丙烯酸酯单体与小分子有机胺通过迈克尔加成反应制得带双键的线性聚(β-氨基酯)；
[0040]
2)对步骤1)制备的带双键的线性聚(β-氨基酯)通过可逆加成断裂链转移聚合反应，制得结构和组成可控的单链多环状聚(β-氨基酯)；
[0041]
3)对步骤2)制备的单链多环状聚(β-氨基酯)加入功能化封端剂进行功能化封端处理，制得功能性单链环状聚(β-氨基酯)。
[0042]
具体地，包括以下步骤：
[0043]
1)将一定量的双丙烯酸酯单体和小分子有机胺，加入有反应溶剂二甲基亚砜或四氢呋喃的两口瓶中并通过磁力搅拌使单体充分溶解，双丙烯酸酯单体、小分子有机胺的反应投料摩尔比为(0.5：1-1.5：1)；
[0044]
其中，反应在氮气保护氛围下进行；
[0045]
进一步地，在反应过程中使用凝胶渗透色谱监测聚合物分子量，聚合物的分子量到达预设的1000da-5000da，终止反应；在反应体系中加入一定的双丙烯酸酯单体和二甲基亚砜或四氢呋喃，25℃，反应48h；使用沉淀法对产物进行提纯，真空干燥，得到低分子量和pdi较窄的线性聚(β-氨基酯)。
[0046]
2)将一定量低分子量的线性低聚(β-氨基酯)和链转移基(cta)加入有反应溶剂丁酮或二甲基亚砜的三口瓶中并通过磁力搅拌使单体充分溶解，低分子量线性聚(β-氨基酯)与cta投料摩尔比为(1000:1-100:1)；
[0047]
使用通氮气鼓泡的方法除氧30分钟，在通氮气条件下，将引发剂偶氮二异丁氰(aibn)快速加入，并继续通氮气5分钟；其中，aibn与cta反应投料摩尔比为(1:2-1:5)，将三
口瓶没入预先加热到50-70℃的油浴中，开始反应；
[0048]
其中，使用凝胶渗透色谱监测聚合物分子量，当反应分子量接近设定值10000da-60000da时，停止反应，淬灭自由基；使用沉淀法对产物进行提纯，真空干燥。
[0049]
3)使用一定量的封端剂对单链多环状聚(β-氨基酯)进行封端，封端剂与单链环状聚(β-氨基酯)投料摩尔比为(1:1-5:1)，使用沉淀法对产物进行提纯。
[0050]
进一步地，本发明所使用的双丙烯酸酯单体包括：1,4-丁二醇二丙烯酸酯，2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯，低聚乙二醇二丙烯酸酯，二乙二醇双丙烯酸酯，二乙二醇二甲基丙烯酸酯，四甘醇二丙烯酸酯，双酚a聚氧乙烯醚二丙烯酸酯和1，1，-异亚丙基双(对亚苯氧基)二-2-丙醇二丙烯酚酯)，结构式如下：
[0051][0052]
进一步地，本发明所使用的小分子有机胺包括5-氨基-1戊醇，4-氨基-1-丁醇，十二胺和十八胺，结构式如下：
[0053][0054]
进一步地，本发明所使用的封端剂为1,2-乙二胺，1,3-丙二胺，1,4-丁二胺，1,6-己二胺，1,11-二氨基-3,6,9-三氧杂十一烷，1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪，1-(2-氨基乙基)哌嗪，n-(3-氨丙基)吗啉，n-(2-氨基乙基)吗啉，2-甲基-2-吗啉-4-基丙烷-1-胺，十二胺，十八胺和4-氨甲基苯基硼酸，其结构式如下：
[0055][0056]
将本发明制得的功能性单链多环状聚(β-氨基酯)进行转染编码绿色荧光蛋白dna和荧光素霉dna，同时对细胞毒性进行测试，方法如下：
[0057]
1)细胞培养：hela细胞，hct 166细胞，hepg2细胞，a549细胞，cos-7细胞，sy5y细胞，hacat细胞，l929细胞，mcf7细胞，3t3细胞，vec细胞，hpdf细胞，rdebf细胞，rdebk细胞以1.0*10
4-2.0*104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在37℃过夜下培养。
[0058]
2)将一定量功能性单链多环状聚(β-氨基酯)混合到编码绿色荧光蛋白dna或荧光素霉dna溶液中，静置5-40min，然后加入细胞中。
[0059]
3)转染48h-72h后，在荧光显微镜下对转染的绿色荧光蛋白的细胞进行观察和拍照。
[0060]
4)转染48h-72h后，吸取一定量的转染荧光素霉的细胞上清液在避光条件下，加入荧光素霉工作液，在酶标仪中快速检测发光的强度。
[0061]
5)转染48-72h后，移除细胞上清液，然后加入一定的pbs缓冲溶液对细胞进行清洗，然后加入alamarblue(10％)，在培养箱中孵育30min，然后在酶标仪中测试活细胞的荧光强度，未做转染处理的细胞活性为100％。
[0062]
具体实施例：
[0063]
实施例1
[0064]
2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯和十二胺的反应投料比为2：1，在60℃下反应5h；加入0.5当量的2,2-二硫二乙醇二丙烯酸酯，25℃下反应48h，得到的低分子量线性聚(β-氨基酯)分子量为3000da。
[0065]
低分子量线性聚(β-氨基酯),链转移剂和aibn反应投料比为300:1:1，在50℃下反应50h，然后加入4当量的n-(2-氨基乙基)吗啉，25℃下反应48h，得到的单链多环状聚(β-氨基酯)分子量为30000da。
[0066]
图2是本实施例制备的分子量为30000da单链多环状聚(β-氨基酯)溶于二甲基亚砜中的溶液状态。图3为本实施例制备的分子量为30000da单链多环状聚(β-氨基酯)的核磁氢谱。
[0067]
参见图4，图4中(a)为本实施例制得的分子量约为30000da的单链多环状聚(β-氨基酯)纯化后凝胶渗透色谱(gpc)曲线。
[0068]
实施例2
[0069]
双酚a聚氧乙烯醚二丙烯酸酯和十二胺的反应投料比为0.5：1，在60℃下反应2h；加入1当量的双酚a聚氧乙烯醚二丙烯酸酯，25℃下反应48h，得到分子量为2800da的线性聚(β-氨基酯)。
[0070]
低分子量线性聚(β-氨基酯),链转移剂和aibn反应投料比为200：5：1，在50℃下反应96h，然后加入5当量的1,11-二氨基-3,6,9-三氧杂十一烷，在25℃下反应48h，得到的单链多环状聚(β-氨基酯)分子量为40000da。
[0071]
参见图4，图4中(b)为本实施例制得的分子量约为40000da的单链多环状聚(β-氨基酯)纯化后凝胶渗透色谱(gpc)曲线。
[0072]
实施例3
[0073]
hela细胞，以1.0
×
104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，细胞在37℃过夜下培养。将5μg功能性单链多环状聚(β-氨基酯)的醋酸钠缓冲溶液混合到0.2μg编码绿色荧光蛋白dna或荧光素霉dna醋酸钠缓冲溶液中，静置5min，然后缓慢的加入hela细胞中。然后在hela细胞中继续培养48h后，在荧光显微镜下对转染的绿色荧光蛋白的细胞进行观察和拍照。对于转染编码荧光素dn的细胞，在避光条件下，将25μl的hct166细胞上清液加入白板中，加入50μl提前配置的荧光素霉工作液(按照试剂商提供的制备配方)，在酶标仪中快速检测发光的强度。对于细胞活性的检测，hela细胞转染48h后，移除细胞上清液，然后加入
100μl pbs缓冲溶液对细胞进行清洗，然后加入alamarblue(10％)，在培养箱中孵育30min，将所有上清液移入干净的孔板中。在酶标仪中测试活细胞的荧光强度，激发波波长为530nm，发射波波长为590nm，未做转染处理的hela细胞活性为100％。
[0074]
实施例4
[0075]
hct166细胞，以2.0
×
104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并细胞在37℃过夜下培养。将10μg功能性单链多环状聚(β-氨基酯)的醋酸钠缓冲溶液混合到0.1μg编码绿色荧光蛋白dna或荧光素霉dna醋酸钠缓冲溶液中，静置5min，然后缓慢的加入细胞中。然后在细胞中继续培养48h后，在荧光显微镜下对转染绿色荧光蛋白的细胞进行观察和拍照。对于转染编码荧光素霉dna的细胞，在避光条件下，将50μl的hct166细胞上清液加入白板中，然后加入100μl提前配置的荧光素霉工作液(按照试剂商提供的制备配方)，在酶标仪中快速检测发光的强度。对于细胞活性的检测，在hct166细胞转染48h后，移除细胞上清液，然后加入100μl pbs缓冲溶液对细胞进行清洗，然后加入alamarblue(10％)，在培养箱中孵育50min。在酶标仪中测试活细胞的荧光强度，激发波波长为530nm，发射波波长为590nm，未做转染处理的hct166细胞活性为100％。
[0076]
结果参见图5和图6，本发明制备的单链多环状聚(β-氨基酯)，由于其具有和生物分子类似的环状结构，并且可改变的单体众多，因此可在多种组织细胞(hela细胞，hct 166细胞，hepg2细胞，a549细胞，cos-7细胞，sy5y细胞)表现出较高的绿色荧光蛋白和荧光素霉的表达。
[0077]
其中，图6中(a)显示，在hela细胞中不同浓度下单链多环状聚(β-氨基酯)转染编码荧光素霉(gluc)dna后的效率，从图中可以看出单链多环状聚(β-氨基酯)的转染效率优于商业化转染试剂，可以替代商业化转染试剂。
[0078]
图6中(b)显示，在hct166细胞中不同浓度下单链多环状聚(β-氨基酯)转染编码荧光素霉(gluc)dna后的效率，从图中可以看出单链多环状聚(β-氨基酯)整体具有较高的转染效率。
[0079]
参见图7为本发明制备的单链多环状聚(β-氨基酯)，由于酯键在水中可以较为快速的降解，因此可在多种组织细胞(hela细胞，hct 166细胞，hepg2细胞，a549细胞，cos-7细胞，sy5y细胞)表现出较高的细胞活性。
[0080]
其中，(a)显示，在hela细胞中不同浓度下的单链多环状聚(β-氨基酯)转染后的细胞成活率；(b)显示在hct166细胞中不同浓度下的单链多环状聚(β-氨基酯)转染后的细胞成活率，从图中可以发现，单链多环状聚(β-氨基酯)转染后对细胞的成活率影响极低，单链多环状聚(β-氨基酯)的细胞活性明显优于商业化转染试剂，说明单链多环状聚(β-氨基酯)在基因递送方面具有明显的优势。以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。