一株高效降解角蛋白的菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株高效降解角蛋白的菌株及其应用。


背景技术：

2.随着禽类产品的大量消费，全球每年产生数千万吨的角蛋白废弃物，其中羽毛废弃物约850万吨。羽毛中含有超过85％的粗蛋白和70％的氨基酸，另外还包含一些高价值元素、维生素和生长因子等。最近，研究人员对将这些生物材料应用于各种产品的开发(例如，饲料，肥料和生物膜等)，表现出极大的兴趣。羽毛角蛋白普遍存在于自然界中，是一类不溶于水含硫量高的丝状蛋白，由于角蛋白表面富含疏水性氨基酸残基，且存在疏水相互作用、氢键以及分子间/内二硫键高度交联作用而表现出很高的机械稳定性，不易被降解。高温、微波和化学方法(强酸或强碱)已经被用来分解和回收羽毛。然而，剧烈的反应过程导致产品中必需氨基酸的大量损失，以及巨大的能源消耗，给环境带来了明显的负担。
3.近年来，将角蛋白废弃物生物转化为有价值的产品已成为可持续工业中的一种“绿色”概念。产角蛋白酶微生物及角蛋白酶的出现使得角蛋白的生物转化成为可能。具有角蛋白分解能力的微生物主要是细菌、真菌和放线菌，大部分是从含角蛋白腐烂废渣的羽毛和土壤中分离出来的。细菌是角蛋白分解的主要参与者，也是研究最多的。其中，bacilluslicheniformis,bacillus subtilis,bacillusamyloliquefaciens等芽孢杆菌已成为主要的角蛋白产生菌。虽然这些菌株具有降解角蛋白的能力，但由于野生型细菌分解或相关野生型酶的酶解效率低，基本上不可能回收角蛋白废弃物。因此，开发出更高效的微生物菌种或角蛋白酶 (系)，并阐明其角蛋白降解机制势在必行。
4.申请人筛选到一株能够高效降解羽毛角蛋白的菌株bacillus sp.cn2-1，其能够以废弃的羽毛为唯一氮源。发明人检测了降解体系中的功能酶组分以及角蛋白的降解产物，初步探究了该菌株降解羽毛角蛋白的方式，为今后深入解析芽孢杆菌有效转化角蛋白及其角蛋白酶的催化机制提供理论依据。最重要的是，利用生物转化这种简单、快速、绿色的方法回收角蛋白废料具有广阔的应用潜力，有利于工业规模化生产。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种高效降解角蛋白的菌株及其应用。
6.一方面，本发明提供了一种高效降解角蛋白的菌株，所述菌株为芽孢杆菌 (bacillus sp.)cn2-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.22517，保藏日期为2021年5月13 号，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，电话： 010-64807355。
7.另一方面，本发明还提供了上述菌株在降解角蛋白中的应用。
8.另一方面，本发明还提供了上述菌株在降解含角蛋白的材料中的应用。
9.在一个实施方式中，所述含角蛋白的材料为羽毛或动物毛发，例如，鸡毛、鸽子毛、牛毛、羊毛或头发。
10.另一方面，本发明提供了一种降解角蛋白或降解含角蛋白的材料的方法，所述方法包括利用上述菌株对角蛋白或含角蛋白的材料进行处理的步骤。
11.在一个实施方式中，所述处理的温度为30℃-40℃，优选，35℃-37℃；所述处理的时间为6h-96h，例如，12h、24h、36h、48h、60h和72h；所述菌株的用量为1％-10％(v/v)。
12.另一方面，本发明还提供了一种降解角蛋白或降解含角蛋白的材料的方法，所述方法包括利用上述菌株的胞外酶液对角蛋白或含角蛋白的材料进行处理的步骤；优选的，所述方法还包括利用还原剂对角蛋白或含角蛋白的材料进行处理的步骤。
13.在一个实施方式中，所述还原剂为dtt；优选的，所述dtt的用量为1％-5％ (w/v)，优选，2％(w/v)。
14.在一个实施方式中，所述菌株的胞外酶液通过对上述菌株发酵得到。
15.在一个具体的实施方式中，所述胞外酶液通过以下方式制备得到：将菌株接种到含羽毛的发酵培养基中，培养一段时间，取发酵液上清即得到胞外酶液。
16.进一步的，所述培养的温度为30℃-40℃，优选，35℃-37℃；所述培养的时间为6h-96h，例如，12h、24h、36h、48h、60h和72h；所述菌株的接种量为1％-10％(v/v)。
17.另一方面，本发明还提供了一种用于降解角蛋白或降解含角蛋白的材料的组合物。
18.在一个实施方式中，所述组合物包括上述菌株。
19.在其他的实施方式中，所述组合物包括上述菌株的胞外酶液；优选的，还包括还原剂，例如，dtt。
20.本发明中，所述含角蛋白的材料优选为羽毛或动物毛发，例如，鸡毛、鸽子毛、牛毛、羊毛或头发。
21.本发明筛选得到的bacillus sp.cn2-1可在以废弃的羽毛作为唯一的氮源的培养基中生长，具有高效的羽毛角蛋白降解能力。菌株cn2-1首先产生还原力打开角蛋白的二硫键，随后变性的角蛋白在三种s8丝氨酸内肽酶，1种m4 金属内肽酶和1个γ-谷氨酰基转移酶的作用下被降解成小肽。另外，羽毛废弃物经菌株cn2-1及其酶作用后产物富含氨基酸和多肽类营养物质，可被用作饲用蛋白补充剂等，实现了其高值化应用。
附图说明
22.图1.羽毛的生物降解。a.bacillus sp.cn2-1对羽毛的时序性降解过程。b. 降解体系中细胞密度和可溶性蛋白的变化。c.羽毛干重变化。d.降解系统中ph 的变化。e.降解体系中角蛋白酶活性变化。
23.图2.bacillus sp.cn2-1胞外蛋白和蛋白酶的分泌动态。a.胞外蛋白的动态变化。b.胞外蛋白酶的时序性变化。
24.图3.体外还原剂对角蛋白酶水解羽毛的影响。na2so3和dtt作为还原剂。发酵72h的cn2-1的胞外酶液作为水解羽毛角蛋白的粗酶。
25.图4.hplc检测羽毛在酶解过程中的产物变化。a.是芽孢杆菌cn2-1降解系统中可溶性多肽分析。b.是芽孢杆菌cn2-1发酵液中游离氨基酸分析。ck 是阴性对照，0h表示未接菌。6，12，24，36，48，60，72，96，120h是不同的取样时间。
26.实施方式
27.下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
28.实施例1、材料与方法
29.1.1羽毛的制备和降解率计算
30.从禹城(中国)家禽养殖场收集鸡羽毛废弃物，用自来水洗涤多次直至去掉全部皮肤和灰尘，无水乙醇洗涤两次并过夜浸泡，最后用去离子水洗涤三次以去除无水乙醇，清洗干净的羽毛置于65℃烘箱中干燥24h，然后将干燥的羽毛放在密封袋中保存以便进行后续分析。
31.羽毛的降解率定义为降解前后羽毛干重的变化。将发酵液通过滤纸以除去未降解的羽毛残留，并将未降解的残留羽毛用去离子水洗涤2-3次以完全除去可溶性物质和附着菌体，然后在65℃的烘箱中烘干至恒重。使用以下公式计算羽毛降解率：羽毛降解率(％)＝100
×
(b-a)/b,其中b是降解前羽毛的干重，而a是降解后羽毛的干重。
32.1.2羽毛角蛋白的摇瓶发酵与无细胞发酵液的制备
33.将菌株按1％(v/v)的接种量接种到1％(w/v)的羽毛培养基(羽毛10g，蔗糖5g,二水合柠檬酸三钠5g，k2hpo
4 5g，mgso4·
7h2o 0.1g,cacl2·
2h2o0.1g，蒸馏水定容至1l)中，37℃，200rpm震荡培养。间隔一定时间取样测其理化性质，发酵液用8层纱布过滤去除浮在表面的羽毛粉，滤液经10,000rpm，4℃离心10min得到的上清液即为发酵胞外酶液，并用于后续的实验分析。
34.1.3可溶性蛋白质的测定
35.使用考马斯亮蓝g-250测定发酵液中可溶性蛋白的浓度，以牛血清白蛋白为标准。
36.1.4角蛋白酶活性测定方法
37.角蛋白酶活性的测定是jaouadi等人的方法，并进行了适当的修改。取0.5 ml用50mm tris-hcl适当稀释的粗酶液加入0.5ml 10g/l的可溶性角蛋白底物中,40℃，200rpm振荡孵育1h。然后加入2ml 0.4mol/l tca终止反应。未利用的底物通过10,000rpm离心10min后去除，上清液过0.22μm滤膜。使用分光光度计测量在280nm处的吸光度值。对照组在添加酶溶液之前先加入 tca以终止反应，其余操作与实验组相同。所有酶活测定包含三组平行实验和一组对照实验。角蛋白酶活性的一个单位(u/ml)定义为在280nm下每分钟增加0.01od所需要的酶量。由下面的公式计算：u＝4
×n×
a280/(0.01
×
10)，n 为稀释率；4为最终反应体积(ml)；10为孵化时间(min)。
38.1.5硫酸盐含量的测定
39.采用铬酸钡分光光度法对硫酸盐含量进行测定：2ml发酵液上清与8ml 去离子水及5ml铬酸钡悬浊液混合，静置30min后与1.0ml钙-氨溶液、10ml 95％乙醇混合，用力振荡1min后，用中速定量滤纸过滤，于420nm处比色测定。以空白发酵液作为对照组，计算发酵液中so
42-含量。
40.1.6亚硫酸盐含量测定
41.亚硫酸盐浓度的测定采用盐酸副玫瑰法：取1ml发酵液上清与2ml甲醛-副玫瑰苯胺溶液混合均匀，于550nm处比色测定。以空白发酵液为参比，计算发酵液中so
32-含量。
42.1.7巯基化合物含量的测定
43.参考ellman描述的方法测定发酵液中的硫醇浓度。简单地说，取50μl 溶解于100mm ph 8.0磷酸盐缓冲液的4mg/ml硝基苯甲酸(dtnb)加入500 μl蒸馏水。然后，加入250μl无细胞滤液，室温静置5min，稳定显色。测定dtnb还原后形成的黄色2-硝基-5-硫代苯甲酸(tnb)在412nm处的吸光度。以上述方法处理的未接种培养基作为对照。进行三次实验，结果显示为平均值和标准差。
44.1.8发酵液中氨基酸和可溶性肽分析
45.发酵液通过八层纱布过滤并以10,000rpm,4℃,离心10min获得澄清的羽毛降解物。将上清液与等体积的1％tfa混合，混合物于4℃孵育30min，13,000 rpm离心15min，保留上清液并将上清液经0.22μm膜滤器过滤。使用氨基酸分析仪(日立l-8900，东京,日本)分析不同时间点采样的羽毛降解产物上清液中的游离氨基酸组分。
46.1.9扫描电镜观察降解羽毛的结构变化
47.按照gupta和singh描述的步骤对生物降解的羽毛进行扫描电镜观察。简单地说，收集不同发酵时间点的残余羽毛，用蒸馏水洗涤，在60℃下烘干24h。样品充分干燥后，将盖玻片粘附到贴好导电胶带的样品台上，镀金5min，并在扫描电子显微镜(quantafeg 250)下观察。
48.实施例2bacillus sp.cn2-1降解羽毛的研究
49.申请人将来自鸡粪堆肥的土壤样本稀释并等量接种到琼脂培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物、0.5％nacl、0.01％k2hpo4、0.02％硫酸镁，ph 7.5)，然后将培养物在37℃下培养24小时至获得克隆生长；选择具有不同特征的克隆，验证其对羽毛的降解活性，筛选到一株对羽毛角蛋白具有高效降解活性的菌株，鉴定为芽孢杆菌，本技术中将其命名为bacillus sp.cn2-1。该菌株“芽孢杆菌(bacillus sp.)cn2-1”已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.22517，保藏日期为2021年 5月13号，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，电话：010-64807355。
50.2.1bacillus sp.cn2-1角蛋白降解体系表征
51.按照1.2中描述的方法，对cn2-1降解羽毛角蛋白的过程和降解体系的理化性质进行了监测。结果如图1所示，在发酵初期(0-12h)菌体细胞吸收培养基中的可溶性蛋白质快速生长(图1b、c)，培养液逐渐浑浊，羽毛有降解的迹象；培养24h，羽毛明显被降解，降解率高达86.70％(图1d)；培养36h 后，羽片和羽枝几乎完全降解，仅余几支最粗大的羽轴，发酵液变为黄褐色，且具有明显刺鼻的氨味，这主要是由角蛋白被水解产生的氨基酸的脱氨作用引起的。随着培养时间的不断延长，菌株cn2-1从12h开始大量分泌角蛋白降解相关的蛋白酶，48h达到其最大值195.05
±
6.65u/ml(图1e)。此时体系中增多的蛋白酶作用于羽毛角蛋白，导致角蛋白被降解，产生大量的可溶性蛋白 (图1c)。
52.2.2bacillus sp.cn2-1胞外蛋白和蛋白酶动态酶谱展示
53.基于bacillus sp.cn2-1具有显著的羽毛角蛋白降解能力，检测了其胞外蛋白和蛋白酶的分泌情况，结果如图2所示，菌株cn2-1在羽毛角蛋白为唯一氮源的培养基(培养基配方见1.2的羽毛培养基)上生长时，能分泌多种蛋白质，主要是2个分子量(mw)约为45kda的蛋白和2个分子量(mw)约为30kda 的蛋白(图2a)。然而其中一个蛋白条带在培养至60h时
消失，推测可能是蛋白的结构稳定性差，从而易被体系中的其他蛋白酶水解作用。与此同时，菌株 cn2-1从6h开始分泌1种蛋白酶，发酵至48h胞外酶系达到稳定，主要包括 7种蛋白酶(图2b)，这与前边酶活测定的结果相一致。因此，菌株cn2-1丰富的胞外酶系可能是该菌高效的羽毛角蛋白降解能力的体现。
54.2.3bacillus sp.cn2-1胞外酶降解羽毛特性分析
55.羽毛角蛋白结构致密，存在疏水性抗降解屏障，其降解的限速步骤是二硫键的断裂。为了检验上述推理，研究了还原剂亚硫酸盐和dtt在体外促进角蛋白酶水解羽毛角蛋白的作用。通过在40℃和200rmp下将1％(w/v)羽毛与1mlcn2-1的胞外粗酶混合12h，发现羽毛在形态上没有任何变化。对照组中将羽毛浸入1ml的1％或2％亚硫酸钠和dtt中进行相同的反应，结果相似。但是，当在羽毛与1ml胞外粗酶体系中添加1％或2％dtt并反应4h后，羽毛被显著降解，12h后几乎降解完全，且2％dtt的促进效果更好(图3)。而亚硫酸钠对羽毛的降解毫无促进作用。单独的角蛋白酶和单独的还原剂都不能水解羽毛，而角蛋白酶和强还原剂dtt协同作用可以完全水解羽毛，这表明 dtt提供的还原力在角蛋白酶水解羽毛中起重要作用。
56.2.4lc-ms/ms分析bacillus sp.cn2-1胞外功能蛋白酶组分
57.bacillus sp.cn2-1主要通过分泌蛋白酶来利用环境中的有机氮源。为了进一步探究菌株获取外界营养的方式，采用lc-ms/ms检测菌株在1％羽毛底物上分泌的功能酶组分。在分泌组中共检测到12个具有分泌能力的蛋白酶(包括5个丝氨酸内肽酶，2个金属内肽酶，1个半胱氨酸内肽酶，1个外肽酶，1 个omega肽酶和2个未归类的肽酶)和24个胞内蛋白酶(表1)。关于相对分泌水平，外肽酶表达量远远高于内肽酶。绝大多数的内肽酶属于中性或碱性的丝氨酸蛋白酶，一个酸性的半胱氨酸内肽酶的相对表达量微乎其微，一般 《0.15％，这可能是由于该菌适宜生长在中碱性的腐生生境有关。
58.表1.芽孢杆菌cn2-1分泌功能酶成分的比较分析
59.60.[0061][0062]
在所有的蛋白酶中，三个s8家族的丝氨酸内肽酶(mer0988194、 mer0125992、mer0469171)的表达水平最高，分别命名为pros8a、pros8b 和pros8c。pros8b和一个m4金属内肽酶从6h就开始大量分泌，随着培养时间的延长，分泌量从32.46％和14.81％降到11.65％和6.02％，推测这两种酶可能是角蛋白酶，在发酵液中可溶性蛋白的诱导下最先分泌，破坏羽毛角蛋白的紧密结构，暴露出更多的蛋白酶接触位点。随后活性中心带正电荷的pros8a 和活性中心带负电荷的pros8c开始分泌，进一步降解暴露的角蛋白，将完整的羽毛降解成多肽段。有意思的是，t3家族的谷氨酰转肽酶在整个培养过程中都大量分泌，参与羽毛角蛋白的降解。γ-谷氨酰转移酶是一种与质膜结合的糖蛋白，在谷氨酰循环中起着重要的作用。它催化谷胱甘肽上的γ-谷氨酰基转移到不同的α氨基酸，生成游离的半胱氨酰基团，这些游离的半胱氨酰基团作为强还原剂参与了角蛋白的硫解，破坏二硫键结构，使其更容易受到角蛋白酶的攻击，这也是其在发酵初期大量分泌的主要原因。
[0063]
当培养菌株培养时间长达36h，在菌株cn2-1胞外检测到的24个胞内蛋白酶，可能是部分菌体死亡释放到培养中所导致的。lc-ms/ms结果显示，胞内蛋白酶相对于胞外蛋白酶的含量低，但是种类较多。这些表达量相对较高的氨肽酶主要分布在m42、m20、m29、m17和m55等家族，且都是序列专一性酶，因此能精确识别转运至胞内的特定小肽，并将其降解为游离氨基酸或者小肽，从而菌株可以根据自身的营养需求灵活调整寡肽和氨基酸的水解平衡。
[0064]
2.5发酵液中游离氨基酸和多肽含量变化
[0065]
图4示出了hplc检测羽毛在酶解过程中的产物变化情况。从图4a可以看出，在灭菌后(0h)的培养基里检测到了多肽段，但是含量较低。但当接入 1％的芽孢杆菌cn2-1后，随着发酵时间的延长，发酵液中可溶性多肽的含量逐渐升高，主要有9个明显的多肽峰，表明菌株cn2-1分泌的蛋白酶有效地降解了羽毛角蛋白。同时，对各发酵时间段的游离氨基酸的种类和含量进行了检测，结果如图4b所示，在发酵液中检测出的游离氨基酸有17种，包括苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸等5种必须氨基酸。同时发酵液中检测到了nh3，其含量随着发酵时间的延长逐渐增加。从氨基酸检测结果看，某些氨基酸(lys、 tyr、glu、cys和ala)在发酵液中含量高于未发酵液，且发酵6-12h，出现了游离氨基酸减少的现象，推测该时间段以羽毛为唯一氮源的芽孢杆菌cn2-1 正处于生长期，消耗了培养基中游离的氨基酸进行生长繁殖，此时主要是丝氨酸内肽酶pros8b和m4金属内肽酶参与角蛋白的降解。12-36h，菌体生长旺盛，角蛋白暴露的裂解位点增多，此时在丝氨酸内肽酶pros8a和pros8c以及谷胺酰转移酶的作用下，羽毛大量降解，部分氨基酸含量明显增加，发酵液中的nh3含量也随之升高。正是nh3的产生，引起了发酵体系中ph值的升高。发酵到60h，氨基酸总量开始减少，此时菌体进入衰亡期，从而使得酶解作用逐渐被削弱，少量菌体生长消耗了发酵液中的部分氨基酸，
使得氨基酸总量有所减少。最终，经过发酵过程后，必需氨基酸的占比增多。因此，营养丰富的芽孢杆菌cn2-1的发酵液可作为动物饲料中蛋白质的补充物和氮素肥料。
[0066]
以上结果反映出bacillus sp.cn2-1可在以废弃的羽毛作为唯一的氮源的培养基中生长，具有高效的羽毛角蛋白降解能力。菌株cn2-1首先产生还原力打开角蛋白的二硫键，随后变性的角蛋白在三种s8丝氨酸内肽酶，1种m4 金属内肽酶和1个γ-谷氨酰基转移酶的作用下被降解成小肽。另外，羽毛废弃物经菌株cn2-1及其酶作用后产物富含氨基酸和多肽类营养物质，可被用作饲用蛋白补充剂等，实现了其高值化应用。
[0067]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。