pSFV-p32病毒样颗粒及其制备方法和应用与流程

psfv
‑
p32病毒样颗粒及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种psfv
‑
p32病毒样颗粒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.asfv是一种大型的胞内复制病毒，易感细胞为猪单核
‑
巨噬细胞系，破坏免疫系统引起猪的一种急性、热性、高接触性传染病，即非洲猪瘟。非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)在病毒分类中属于dna病毒目(dsdna)、非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属(asfivirus)，是非洲猪瘟病毒科唯一的成员，病毒粒子呈二十面体对称，平均直径约为200nm。非洲猪瘟临床症状以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血、高死亡率为主要特征，目前尚无有效的疫苗用于预防，一经发现只能大规模扑杀，对养猪业造成巨大损失。该病属于世界动物卫生组织(oie)要求法定报告的动物疫病，我国动物病原微生物名录中将其列为一类动物疫病。病毒粒子结构由内到外分别为核质体、核衣壳、囊膜(分为外层与内层)：核质体主要由病毒基因组、dna结合蛋白(p10、p14、p37、p34 等)及基因早期转录所需的酶组成；核衣壳主要含有结构蛋白p72和p17，由大约 2000个壳粒组成；内侧囊膜来源于宿主的内质网，结合着p12、p22、p32、p54 及cd2v蛋白，外层囊膜为病毒出芽附带产物，松散环绕在四周。asfv基因组为线性双链dna分子，不同毒株全长大小不一，大致范围在170～193kb，编码 150
‑
175个蛋白。基因组由中央保守区(约125kb)、两侧可变区(分别为38～48kb、 13～22kb)及基因组末端的反向重复序列(约2.1～2.5kb)组成。本文所研究的p32 蛋白分子量约为30kd。在病毒感染早期表达，能够引起机体产生免疫反应，因此该蛋白具有比较好的抗原性。研究表明，针对p32蛋白的抗体能够抑制病毒内化，说明p32蛋白也参与病毒进入细胞的过程。2018年8月之前我国尚未见非洲猪瘟发病的报道。但政府和研究人员从来没有放松对此病的监控。我国在 2013年就加入全球非洲猪瘟联盟，与世界各国成员共同加强非洲猪瘟的防控工作，开展对asfv的基础性研究。深入了解机体感染病毒后的免疫反应对asf 的预防和控制及疫苗研发具有非常重要的意义。近20年来，asf亚单位疫苗和重组疫苗得到了广泛的研究，多种参与asfv感染机体的病毒蛋白，如p72、p32、 p54等成为研究的靶蛋白，但是目前研制的亚单位疫苗和重组疫苗仍不能对机体产生足够的保护力，只能在一定程度上降低病毒血症水平，延缓临床症状出现的时间。
3.而rna复制子疫苗是一种基于rna的复制子、能够进行自主复制的新型疫苗。这种疫苗在胞质中表达,不会和基因组发生整合,具有良好的安全性。 rna复制子疫苗能够自主复制诱导全身免疫细胞免疫和黏膜免疫，具有高效性、应用范围广等优点而倍受关注。rna复制子是衍生于rna病毒基因组并能自主复制的rna。最常用于开发复制子的病毒是披膜病毒科中的甲病毒 (alphavirus),如辛德比斯病毒(sindbis virus,sin)、塞姆利基森林病毒(semlikiforest virus,sfv)以及委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelan equine encephalitis virus, vee)；除甲病毒外，还有黄病毒、小rna病毒、副粘病毒、杯状病毒等。表达抗原的rna复制子可由3种方式递送:(1)体外转录的裸rna；(2)构建成质粒dna由细胞
rna聚合酶ⅱ体内转录成复制子rna(基于dna)；(3)将复制子rna包装入病毒样颗粒。
4.裸rna存在不稳定、降解快、不易储存等缺点,而病毒样颗粒没有感染性, 作为免疫原,它可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞,有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应,成为良好的疫苗；作为基因治疗载体,可以插入外源蛋白的表位,通过释放外源蛋白达到特异性治疗的目的；由于在细胞表面存在相应受体,既可提高其稳定性还可以增加效率而倍受关注。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于，提供一种psfv
‑
p32病毒样颗粒及其制备方法，通过插入非洲猪瘟p32基因，制得的psfv
‑
p32病毒样颗粒能够高效表达外源蛋白p32，有利于非洲猪瘟蛋白的表达筛选和rna疫苗研制。
6.本发明还要解决的技术问题还在于，提供psfv
‑
p32病毒样颗粒的应用。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种psfv
‑
p32病毒样颗粒的制备方法，包括：
8.(1)构建得到psfv
‑
sp6
‑
p32质粒；
9.(2)将psfv
‑
sp6
‑
p32、sfv
‑
helper质粒体外转录成mrna，然后将 psfv
‑
sp6
‑
p32、sfv
‑
helper质粒体外转录的mrna共电转入bhk细胞中，得到 psfv
‑
p32病毒样颗粒；
10.其中，所述psfv
‑
sp6
‑
p32质粒是通过采用塞姆利基森林病毒为载体，并合成如seq id no.1所示的asfv p32基因，然后将所述asfv p32基因插入所述载体而得。
11.作为上述技术方案的改进，步骤(1)包括：
12.(1.1)合成asfv p32基因，所述asfv p32基因的序列为seq id no.1；
13.(1.2)设计引物tongyong
‑
f，sp6
‑
p32
‑
r并合成，所述引物tongyong
‑
f的序列为seq id no.2，所述引物sp6
‑
p32
‑
r的序列为seq id no.3；
14.(1.3)用bamhi/smai酶切双酶切质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp；
15.(1.4)将基因合成所述asfv p32基因片段和步骤(1.3)酶切的载体片段同源重组，得到重组产物；
16.(1.5)将所述重组产物加入到感受态细胞dh5α细胞，进行重组产物转化；
17.(1.6)将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；
18.(1.7)将鉴定后的重组产物提取质粒；
19.(1.8)对所述质粒进行酶切鉴定及测序。
20.作为上述技术方案的改进，步骤(1.3)中，所述psfv
‑
sp6
‑
egfp由下述方法制得：
21.设计与合成引物，所述引物包括设计引物cs
‑
egfp
‑
f和cs
‑
egfp
‑
r，以及菌液鉴定引物egfp
‑
鉴定
‑
f和egfp
‑
鉴定
‑
r：
22.以egfp
‑
c1为模板，以cs
‑
egfp
‑
f，cs
‑
egfp
‑
r为引物扩增cs
‑
egfp片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp；
23.以psfvcs
‑
sp6
‑
egfp为模板，以egfp
‑
f，egfp
‑
r为引物扩增片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp。
24.作为上述技术方案的改进，步骤(1.6)中，将转化后的重组产物进行重组产物鉴定包括：
25.将转化后的重组产物过夜培养并挑选菌落进行菌液鉴定；
26.所述菌液鉴定的pcr体系包括菌液、设计引物tongyong
‑
f，设计引物 sp6
‑
p32
‑
r。
27.作为上述技术方案的改进，步骤(2)包括：
28.(2.1)线性化psfv
‑
sp6
‑
p32和sfv
‑
helper；
29.(2.2)将线性化后的psfv
‑
sp6
‑
p32和sfv
‑
helper进行体外转录；
30.(2.3)将psfv
‑
sp6
‑
p32及sfv
‑
heleper体外转录的mrna共电转入bhk 细胞中，得到psfv
‑
p32病毒样颗粒。
31.作为上述技术方案的改进，所述sfv
‑
helper质粒是通过构建如seq id no.4 所示的重组载体，并合成如seq id no.5所示的插入片段基因，然后将所述插入片段基因克隆入所述重组载体而得。
32.作为上述技术方案的改进，所述sfv
‑
helper质粒由下述方法制得：
33.构建重组载体，构建得到的重组载体的序列为seq id no.4；
34.合成插入片段基因，所述插入片段的序列为seq id no.5；
35.将重组载体与插入片段进行同源重组，重组的产物转化dh5α感受态细菌，涂布平板，倒置培养，提取质粒，得到sfv
‑
helper质粒，其中，所述sfv
‑
helper 质粒的序列为seq id no.6。
36.相应的，本发明还提供一种psfv
‑
p32病毒样颗粒，其由上述的制备方法制得。
37.相应的，本发明还公开了一种psfv
‑
p32病毒样颗粒、以及psfv
‑
p32病毒样颗粒的制备方法在rna疫苗、治疗药物、动物模型中的应用。
38.作为上述技术方案的改进，所述rna疫苗为防控非洲猪瘟流行病的疫苗。
39.实施本发明，具有如下有益效果：
40.本发明采用塞姆利基森林病毒(semliki forest virus,sfv)为载体构建了一种包装体系:一个rna分子是包含插入了asfv p32蛋白的rna复制子载体。另一个rna分子是辅助rna，共电转入bhk细胞后，收集上清液成功制备了病毒样颗粒psfv
‑
p32；经过ifa实验成功鉴定了p32的蛋白表达，为后续其它重要非洲外源蛋白的表达筛选和mrna疫苗研制提供可靠的实验基础和科学依据，有利于研制防控非洲猪瘟流行病的疫苗。
41.因此，本发明psfv
‑
p32病毒样颗粒能够高效表达外源蛋白p32，且抑制病毒结构蛋白的表达，具有较高的生物安全性。
附图说明
42.图1是重组质粒psfv
‑
sp6
‑
p32图谱；
43.图2是psfv
‑
sp6
‑
egfp酶切结果示意图；
44.图3是重组质粒菌液鉴定结果示意图；
45.图4是重组质粒酶切鉴定结果示意图
46.图5是psfv
‑
sp6
‑
p32体外转录结果示意图；
47.图6是psfv
‑
helper体外转录结果示意图；
48.图7是ifa检测asfv p32蛋白表达结果示意图；
49.图8是扩增cs
‑
egfp的模板质粒pegfp
‑
c1图谱；
50.图9是psfvcs
‑
lacz质粒图谱；
51.图10是psfvcs
‑
sp6
‑
egfp质粒图谱。
具体实施方式
52.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
53.本发明提供了一种psfv
‑
p32病毒样颗粒的制备方法，包括：
54.(1)构建得到psfv
‑
sp6
‑
p32质粒；
55.所述psfv
‑
sp6
‑
p32质粒是通过采用塞姆利基森林病毒为载体，并合成如 seq id no.1所示的asfv p32基因，然后将所述asfv p32基因插入所述载体而得。
56.具体的，步骤(1)包括：
57.(1.1)合成asfv p32基因，所述asfv p32基因的序列为seq id no.1；
58.(1.2)设计引物tongyong
‑
f，sp6
‑
p32
‑
r并合成，所述引物tongyong
‑
f的序列为seq id no.2，所述引物sp6
‑
p32
‑
r的序列为seq id no.3；
59.(1.3)用bamhi/smai酶切双酶切质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp；
60.(1.4)将基因合成所述asfv p32基因片段和步骤(1.3)酶切的载体片段同源重组，得到重组产物；
61.(1.5)将所述重组产物加入到感受态细胞dh5α细胞，进行重组产物转化；
62.(1.6)将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；
63.(1.7)将鉴定后的重组产物提取质粒；
64.(1.8)对所述质粒进行酶切鉴定及测序。
65.优选的，步骤(1.3)中的psfv
‑
sp6
‑
egfp，其由下述方法制得：
66.设计与合成引物，所述引物包括设计引物cs
‑
egfp
‑
f和cs
‑
egfp
‑
r，以及菌液鉴定引物egfp
‑
鉴定
‑
f和egfp
‑
鉴定
‑
r：
67.以egfp
‑
c1为模板，以cs
‑
egfp
‑
f，cs
‑
egfp
‑
r为引物扩增cs
‑
egfp片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp。
68.又以psfvcs
‑
sp6
‑
egfp为模板，以设计与合成的引物egfp
‑
f，egfp
‑
r 扩增egfp片段，然后经过酶切psfvcs
‑
sp6
‑
egfp、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，最终构建得到复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp。优选的，步骤(1.4)包括：
69.将基因合成所述asfv p32基因片段和步骤(1.3)酶切的载体片段按照合适的体积，于冰上配置以下反应体系。所述asfv p32基因片段与酶切载体大片段的体积比为1:2。
70.优选的，步骤(1.6)中，将转化后的重组产物进行重组产物鉴定包括：
71.将转化后的重组产物过夜培养并挑选菌落进行菌液鉴定；
72.所述菌液鉴定的pcr体系包括菌液、设计引物tongyong
‑
f，设计引物 sp6
‑
p32
‑
r。根据浓度，所加入的菌液、设计引物tongyong
‑
f，设计引物sp6
‑
p32
‑
r 之间的体积比为(1
‑
2):(1
‑
2):(1
‑
2)。
73.(2)将psfv
‑
sp6
‑
p32、sfv
‑
helper质粒体外转录成mrna，然后将 psfv
‑
sp6
‑
p32、
sfv
‑
helper质粒体外转录的mrna共电转入bhk细胞中，得到 psfv
‑
p32病毒样颗粒；
74.具体的，步骤(2)包括：
75.(2.1)线性化psfv
‑
sp6
‑
p32和sfv
‑
helper；
76.(2.2)将线性化后的psfv
‑
sp6
‑
p32和sfv
‑
helper进行体外转录；
77.(2.3)将psfv
‑
sp6
‑
p32及sfv
‑
heleper体外转录的mrna共电转入bhk 细胞中，得到psfv
‑
p32病毒样颗粒。
78.优选的，步骤(2.1)中，所述sfv
‑
helper质粒是通过构建如seq id no.4 所示的重组载体，并合成如seq id no.5所示的插入片段基因，然后将所述插入片段基因克隆入所述重组载体而得。
79.更佳的，步骤(2.1)中，所述sfv
‑
helper质粒由下述方法制得：
80.构建重组载体，构建得到的重组载体的序列为seq id no.4；
81.合成插入片段基因，所述插入片段的序列为seq id no.5；
82.将重组载体与插入片段进行同源重组，重组的产物转化dh5α感受态细菌，涂布平板，倒置培养，提取质粒，得到sfv
‑
helper质粒，其中，所述sfv
‑
helper 质粒的序列为seq id no.6。
83.本发明采用塞姆利基森林病毒(semliki forest virus,sfv)为载体构建了一种包装体系:一个rna分子是包含插入了asfv p32蛋白的rna复制子载体。另一个rna分子是辅助rna，共电转入bhk细胞后，收集上清液成功制备了病毒样颗粒psfv
‑
p32；经过ifa实验成功鉴定了p32的蛋白表达，为后续其它重要非洲外源蛋白的表达筛选和mrna疫苗研制提供可靠的实验基础和科学依据，有利于研制防控非洲猪瘟流行病的疫苗。
84.相应的，本发明还提供一种psfv
‑
p32病毒样颗粒，其由上述的制备方法制得。本发明psfv
‑
p32病毒样颗粒能够高效表达外源蛋白p32，且抑制病毒结构蛋白的表达，具有较高的生物安全性。
85.相应的，本发明还公开了一种psfv
‑
p32病毒样颗粒、以及psfv
‑
p32病毒样颗粒的制备方法在rna疫苗、治疗药物、动物模型中的应用。优选的，所述 rna疫苗为防控非洲猪瘟流行病的疫苗。
86.下面以一具体实施例进一步阐述本发明
87.(一)实验准备
88.(1)试剂
89.dtaqdna聚合酶、10
×
pcr buffermgcl2(25mm)、dntp(10mm)、 marker、6
×
dna loading dye、10
×
tae、一步法快速感受态细胞制备试剂盒， sanprep柱式质粒dna少量抽提试剂盒、琼脂糖、dna柱式胶回收试剂盒购自生工生物工程股份有限公司；4s red plus核酸染色剂购自bbi血；胎牛血清 (fetal bovine serum)、胰酶(0.25％trypsin
‑
edta)、dmem培养基(dmem/highglucose)、0.25％trypsin
‑
edta等试剂均来自gibco公司；组织基因组dna提取试剂盒购自天根；2x qpcr mix购自诺唯赞；18
‑
t vector、sybr premixextaqtm(tli rnaseh plus)(rr420a)、primescripttm rt reagent kit with gdnaeraser(perfect real time)(rr047a)、胶回收试剂盒(gel extraction kit)、 stbl3感受态细胞、bamhi/asci限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司； rnaprep pure tissue kit(dp431)购自tiangen；质粒提取试剂盒(plasmid minikit)购自omega公司；转
染试剂lipofectamine 3000regeant购自invitrogen 公司；psfvcs
‑
lacz(#92076)购自addgene；egfp
‑
c1(9号楼)，psfv
‑
sp6
‑
egfp 质粒(质粒来源于申请号为2021108223525《一种psfvcs
‑
egfp病毒样颗粒及其制备方法》发明专利)sfv
‑
helper(质粒来源于申请号为2021108224072《一种sfv
‑
helper质粒》发明专利)。
90.(2)仪器
91.生物安全柜1300series a2(thermo公司)；恒温水浴锅dk
‑
8d(一恒/ 上海)；二氧化碳培养箱forma 371(thermo公司)；生化培养箱dhp
‑
9162(一恒/上海)；高性能高速台式冷冻离心机5804r(eppendorf/德国)；电热恒温培养箱dhp
‑
9162(一恒/上海)；涡旋振荡器vortex(thermo公司)；移液器researchplus(eppendorf/德国)；倒置显微镜dmi1(德国徕卡)；countstar细胞计数仪 ic
‑
1000(上海睿钰生物科技有限公司)；荧光定量pcr仪7500(abi)；microampoptical 96
‑
well reaction platen8010560(abi)；microamptm optical adhesivefilm4311971(abi)；洁净工作台sw
‑
cj
‑
2fd(苏净安泰)；荧光显微镜(leica，德国)；co2培养箱hf240(力康)；离心机neofuge 1600r(力康)；fc500 流式细胞仪(becton
‑
dickinson,美国)；高速离心机centrifuge 5840r(eppendorf 公司，德国)；超纯水仪(millipore公司，法国)；dyy
‑
6c型稳流稳压电泳仪 (北京六一)；h6
‑
1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂)；fr980凝胶成像系统(上海复日科技有限公司)；sma4000微量分光光度计(merinton)； pcr反应扩增仪(bio公司)。
92.(二)实验内容
93.(1)构建得到psfv
‑
sp6
‑
p32质粒；
94.(1.1)根据genbank中登陆的asfv p32的基因序列合成asfv p32基因，所述asfv p32基因的序列为seq id no.1；
95.(1.2)根据snapgene软件，采用同源重组技术设计引物tongyong
‑
f， sp6
‑
p32
‑
r并合成，所述引物tongyong
‑
f的序列为seq id no.2，所述引物 sp6
‑
p32
‑
r的序列为seq id no.3；
96.表1菌液鉴定引物
[0097][0098]
(1.3)用bamhi/smai酶切双酶切质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp；
[0099]
用bamhi/smai酶切双酶切质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp，酶切体系共300ul，分成6管，每管50ul，体系如下表2：
[0100]
表2酶切体系
[0101][0102]
酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，在726bp、11045bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将11045bp左右条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2ml的ep管中，进行胶回收，并测定dna浓度。
[0103]
需要说明的是，步骤(1.3)中，所述psfv
‑
sp6
‑
egfp由下述方法制得：
[0104]
设计与合成引物，所述引物包括设计引物cs
‑
egfp
‑
f和cs
‑
egfp
‑
r，以及菌液鉴定引物egfp
‑
鉴定
‑
f和egfp
‑
鉴定
‑
r：
[0105]
以egfp
‑
c1为模板，以cs
‑
egfp
‑
f，cs
‑
egfp
‑
r为引物扩增cs
‑
egfp片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp；
[0106]
又以psfvcs
‑
sp6
‑
egfp为模板，以设计与合成的引物egfp
‑
f，egfp
‑
r 扩增egfp片段，然后经过酶切psfvcs
‑
sp6
‑
egfp、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，最终构建得到复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp。
[0107]
下面以优选的具体实施例进一步阐述psfv
‑
sp6
‑
egfp质粒的制备方法
[0108]
(a)引物设计与合成：
[0109]
所述引物包括设计引物cs
‑
egfp
‑
f、cs
‑
egfp
‑
r、egfp
‑
f、egfp
‑
r以及菌液鉴定引物egfp
‑
鉴定
‑
f、egfp
‑
鉴定
‑
r、tongyong
‑
f：
[0110]
具体的，根据snapgene软件，采用同源重组技术设计引物cs
‑
egfp
‑
f、 cs
‑
egfp
‑
r及菌液鉴定引物egfp
‑
鉴定
‑
f、egfp
‑
鉴定
‑
r，在金唯智科技有限公司(苏州)合成，设计引物如下表1
‑
1：
[0111]
表1
‑
1基因合成引物
[0112][0113]
(b)复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp的构建：
[0114]
以egfp
‑
c1为模板，以cs
‑
egfp
‑
f，cs
‑
egfp
‑
r为引物扩增cs
‑
egfp片段，然后经过酶切、同源重组、重组产物转化和鉴定、提取质粒、酶切鉴定及测序，构建得到复制子质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp。
[0115]
其中，步骤(b)包括：
[0116]
(b.1)以egfp
‑
c1为模板，cs
‑
egfp
‑
f，cs
‑
egfp
‑
r为引物扩增cs
‑
egfp 片段；
[0117]
(b.2)用bamhi酶切质粒psfvcs
‑
lacz，得到酶切载体大片段；
[0118]
(b.3)将所述cs
‑
egfp片段和酶切载体大片段同源重组，得到重组产物；
[0119]
(b.4)将重组产物加入到感受态细胞dh5α细胞，进行重组产物转化；
[0120]
(b.5)将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；
[0121]
(b.6)将鉴定后的重组产物提取质粒；
[0122]
(b.7)对所述质粒进行酶切鉴定及测序。
[0123]
具体的，作为本发明一优选的具体实施例，步骤(2)包括：
[0124]
(b.1)目的片段的扩增
[0125]
以egfp
‑
c1为模板(图8)，cs
‑
egfp
‑
f，cs
‑
egfp
‑
r为引物扩增cs
‑
egfp 片段，pcr体系和条件如下表1
‑
2和表1
‑
3所示：
[0126]
表1
‑
2 cs
‑
egfp扩增pcr体系
[0127][0128]
表1
‑
3 cs
‑
egfp扩增pcr程序
[0129][0130]
pcr扩增结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，在754bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将含有目的条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2ml的ep管中，进行胶回收，并测定dna浓度。
[0131]
(b.2)bamhi酶切质粒psfvcs
‑
lacz
[0132]
用bamhi酶切质粒psfvcs
‑
lacz(购自addgene)(图9)，酶切体系共300ul，分成6管，每管50ul，体系如下表1
‑
4：
[0133]
表1
‑
4酶切体系
[0134][0135][0136]
酶切结束后进行0.8％核酸凝胶电泳鉴定，在3072bp、11851bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将11851bp左右条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度
照射而降解。将切好的凝胶转移到2ml的ep 管中，进行胶回收，并测定dna浓度。
[0137]
(b.3)目的片段和酶切载体大片段同源重组
[0138]
胶回收结束后将目的片段和载体片段按照合适的体积，于冰上配置以下反应体系(表1
‑
5)，温柔的轻轻摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min中，然后放置4℃或冰上冷却。
[0139]
表1
‑
5同源重组体系
[0140][0141]
(b.4)重组产物转化
[0142]
在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞dh5α细胞，取10μl重组产物加入到 100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2
‑
3min。加入900μlsoc，37℃摇菌1 h(转速200
‑
250rpm)。将相应含氯霉素抗性的lb平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂在有含氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养 12
‑
16h。
[0143]
(b.5)重组产物鉴定
[0144]
过夜培养后，查看平板的菌落并挑取其中菌落进行菌液鉴定，至于加有含氯霉素抗性的lb培养基的2ml ep管中，在37℃的摇床中培养约5个小时，然后进行菌液鉴定,鉴定片段为413bp，鉴定pcr体系如下表1
‑
6：
[0145]
表1
‑
6菌液鉴定pcr体系
[0146][0147]
取鉴定阳性的菌液100ul于加有含氯霉素抗性的lp培养基的50ml离心管中进行大摇，过夜培养。
[0148]
(b.6)提取质粒
[0149]
1.柱平衡步骤：向吸附柱cp3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液bl，12,000rpm(～13,400
×
g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0150]
2.取15ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm(～13,400
×
g)离心1min，尽量吸除上清。
[0151]
3.向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液p1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
[0152]
4.向离心管中加入500μl溶液p2，温和地上下翻转6
‑
8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组dna，造成提取的质粒中混有基因组dna片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
[0153]
5.向离心管中加入700μl溶液p3，立即温和地上下翻转6
‑
8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400
×
g)离心10min。注意：p3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
[0154]
6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱cp3中12,000rpm (～13,400
×
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
[0155]
7.向吸附柱cp3中加入600μl漂洗液pw(请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm(～13,400
×
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
[0156]
8.重复操作步骤7。
[0157]
9.将吸附柱cp3放入收集管中,12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱cp3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0158]
10.将吸附柱cp3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50
‑
100 μl洗脱缓冲液eb，室温放置2min，12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
[0159]
(b.7)酶切鉴定及测序：
[0160]
用smai、bamhi双酶切质粒，酶切体系共20ul，如下表1
‑
7：
[0161]
表1
‑
7酶切体系
[0162][0163]
酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，条带经鉴定正确后，送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
[0164]
(c)复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp的构建：
[0165]
(c.1)目的片段的扩增
[0166]
以psfvcs
‑
sp6
‑
egfp为模板(图10)，egfp
‑
f，egfp
‑
r为引物扩增片段，pcr体系和条
件如下：
[0167]
表1
‑
8 egfp片段扩增pcr体系
[0168][0169][0170]
表1
‑
9 egfp片段扩增pcr程序
[0171][0172]
pcr扩增结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，在745bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将含有目的条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2ml的ep管中，进行胶回收，并测定dna浓度。
[0173]
(c.2)bamhi/bg1ii酶切双酶切质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp
[0174]
用bamhi/bg1ii酶切双酶切质粒psfvcs
‑
sp6
‑
egfp，酶切体系共300ul，分成6管，每管50ul，体系如下表1
‑
10：
[0175]
表1
‑
10酶切体系
[0176]
[0177]
酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，在1508bp、11063bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将11063bp左右条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2ml的ep管中，进行胶回收，并测定dna浓度。
[0178]
(c.3)目的片段和酶切载体大片段同源重组
[0179]
胶回收结束后将目的片段和载体片段按照合适的体积，于冰上配置以下反应体系(表1
‑
11)，温柔的轻轻摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min中，然后放置4℃或冰上冷却。
[0180]
表1
‑
11同源重组体系
[0181][0182]
(c.4)重组产物转化
[0183]
在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞dh5α细胞，取10μl重组产物加入到 100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。 42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2
‑
3min。加入900μl soc，37℃摇菌1h(转速200
‑
250rpm)。将相应含氯霉素抗性的lb平板固体培养基在 37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂在有含氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养12
‑
16h。
[0184]
(c.5)重组产物鉴定
[0185]
过夜培养后，查看平板的菌落并挑取其中菌落进行菌液鉴定，至于加有含氯霉素抗性的lp培养基的2ml ep管中，在37℃的摇床中培养约5个小时，然后进行菌液鉴定,鉴定片段为1467bp，鉴定pcr体系如下表1
‑
12：
[0186]
表1
‑
12菌液鉴定pcr体系
[0187][0188][0189]
取鉴定阳性的菌液100ul于加有含氯霉素抗性的lp培养基的50ml离心管中进行大摇，过夜培养。
[0190]
(c.6)提取质粒
[0191]
1.柱平衡步骤：向吸附柱cp3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液bl，12,000rpm(～13,400
×
g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0192]
2.取15ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm (～13,400
×
g)离心1min，尽量吸除上清。
[0193]
3.向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液p1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
[0194]
4.向离心管中加入500μl溶液p2，温和地上下翻转6
‑
8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组dna，造成提取的质粒中混有基因组dna片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
[0195]
5.向离心管中加入700μl溶液p3，立即温和地上下翻转6
‑
8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400
×
g)离心10min。注意：p3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
[0196]
6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱cp3中12,000rpm (～13,400
×
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
[0197]
7.向吸附柱cp3中加入600μl漂洗液pw(请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm(～13,400
×
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
[0198]
8.重复操作步骤7。
[0199]
9.将吸附柱cp3放入收集管中,12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱cp3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0200]
10.将吸附柱cp3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50
‑
100μl洗脱缓冲液eb，室温放置2min，12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min 将质粒溶液收集到离心管中。
[0201]
(c.7)酶切鉴定及测序：
[0202]
如下表1
‑
13，用smai、bamhi双酶切，酶切体系共20ul
[0203]
表1
‑
13酶切体系
[0204][0205]
酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定。条带经鉴定正确后，送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
[0206]
以此制得psfv
‑
sp6
‑
egfp质粒。
[0207]
(1.4)将基因合成所述asfv p32基因片段和步骤(1.3)酶切的载体片段同源重组，得到重组产物；
[0208]
将基因合成的p32片段和载体片段按照合适的体积，于冰上配置以下反应体系，体系如下表3：
[0209]
表3同源重组体系
[0210][0211]
温柔的轻轻摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min中，然后放置4℃或冰上冷却，得到图1所示的重组质粒psfv
‑
sp6
‑
p32。
[0212]
(1.5)将所述重组产物加入到感受态细胞dh5α细胞，进行重组产物转化；
[0213]
在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞dh5α细胞，取10μl重组产物加入到 100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2
‑
3min。加入900μl soc，37℃摇菌1h (转速200
‑
250rpm)。将相应含氯霉素抗性的lb平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂在有含氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养 12
‑
16h。
[0214]
(1.6)将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；
[0215]
过夜培养后，查看平板的菌落并挑取其中菌落进行菌液鉴定，至于加有含氯霉素抗性的lb培养基的2ml ep管中，在37℃的摇床中培养约5个小时，然后进行菌液鉴定,鉴定片段为1344bp，鉴定pcr体系如下表4：
[0216]
表4菌液鉴定pcr体系
[0217][0218]
取鉴定阳性的菌液100ul于加有含氯霉素抗性的lb培养基的50ml离心管中进行大摇，过夜培养。
[0219]
(1.7)将鉴定后的重组产物提取质粒，包括以下步骤：
[0220]
1.柱平衡步骤：向吸附柱cp3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液bl，12,000rpm(～13,400
×
g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0221]
2.取15ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm(～13,400
×
g)离心1min，尽量吸除上清。
[0222]
3.向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液p1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
[0223]
4.向离心管中加入500μl溶液p2，温和地上下翻转6
‑
8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组dna，造成提取的质粒中混有基因组dna片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
[0224]
5.向离心管中加入700μl溶液p3，立即温和地上下翻转6
‑
8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400
×
g)离心10min。注意： p3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
[0225]
6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱cp3中12,000rpm (～13,400
×
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
[0226]
7.向吸附柱cp3中加入600μl漂洗液pw(请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm(～13,400
×
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 cp3放入收集管中。
[0227]
8.重复操作步骤7。
[0228]
9.将吸附柱cp3放入收集管中,12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱cp3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0229]
10.将吸附柱cp3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50
‑
100μl洗脱缓冲液eb，室温放置2min，12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
[0230]
(1.8)对所述质粒进行酶切鉴定及测序。
[0231]
用smai、bamhi双酶切，酶切体系共20ul，如下表5
[0232]
表5酶切体系
[0233][0234]
酶切结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，条带经鉴定正确后，送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
[0235]
(2)复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
p32和辅助质粒sfv
‑
heleper体外转录；
[0236]
(2.1)用spei分别酶切psfv
‑
sp6
‑
p32及sfv
‑
heleper，以线性化 psfv
‑
sp6
‑
p32和sfv
‑
helper；
[0237]
步骤(2.1)中，所述sfv
‑
helper质粒由下述方法制得：
[0238]
(2.1.1)构建重组载体，构建得到的重组载体的序列为seq id no.4；
[0239]
(2.1.2)构合成插入片段基因，所述插入片段的序列为seq id no.5；
[0240]
(2.1.3)构将重组载体与插入片段进行同源重组，重组的产物转化dh5α感受态细菌，涂布平板，倒置培养，提取质粒，得到sfv
‑
helper质粒，其中，所述sfv
‑
helper质粒的序列为seq id no.6。
[0241]
下面以优选的具体实施例进一步阐述sfv
‑
helper质粒的制备方法
[0242]
(2.1.1)构建重组载体：
[0243]
(a)引物设计与合成
[0244]
根据snapgene软件，采用同源重组技术设计引物第一段
‑
f、第一段
‑
r、及第二段
‑
f、第二段
‑
r，在金唯智科技有限公司(苏州)合成，设计引物如下表 2
‑
1：
[0245]
表2
‑
1扩增载体片段的引物
[0246][0247]
(b)载体片段的扩增
[0248]
以psfvcs
‑
lacz(#92076)购自addgene为模板，分别以第一段
‑
f,第一段
‑
r 为引物扩增片段1；以第二段
‑
f,第二段
‑
r为引物扩增片段2，pcr体系和条件分别如下表2
‑
2、表2
‑
3、表2
‑
4、表2
‑
5：
[0249]
表2
‑
2片段1扩增pcr体系
[0250][0251][0252]
表2
‑
3片段1扩增pcr程序
[0253][0254]
表2
‑
4片段2扩增pcr体系
[0255][0256]
表2
‑
5片段2扩增pcr程序
[0257][0258]
pcr扩增结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，分别在3042bp、1665bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将含有目的条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2ml的 ep管中，进行胶回收，并测定dna浓度。
[0259]
(c)载体片段1、2同源重组
[0260]
胶回收结束后将载体片段1、片段2按照合适的体积，于冰上配置以下反应体系，体系如下表2
‑
6：
[0261]
表2
‑
6同源重组体系
[0262][0263]
轻轻摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min中，然后放置4℃或冰上冷却。
[0264]
(d)重组产物转化
[0265]
在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞dh5α细胞，取10μl重组产物加入到 100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2
‑
3min。加入900μl soc，37℃摇菌1h (转速200
‑
250rpm)。将相应含氯霉素抗性的lb平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂在有含氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养 12
‑
16h。
[0266]
(e)重组产物鉴定
[0267]
过夜培养后，查看平板的菌落并挑取其中菌落进行菌液鉴定，至于加有含氯霉素抗性的lb培养基的2ml ep管中，在37℃的摇床中培养约5个小时，然后进行菌液鉴定,鉴定片段为4691bp，鉴定pcr体系如下表2
‑
7：
[0268]
表2
‑
7菌液鉴定pcr体系
[0269][0270][0271]
取鉴定阳性的菌液100ul于加有含氯霉素抗性的lp培养基的50ml离心管中进行大摇，过夜培养。
[0272]
(f)提取质粒
[0273]
柱平衡步骤：向吸附柱cp3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液bl，12,000rpm(～13,400
×
g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0274]
取15ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm (～13,400
×
g)离心1min，尽量吸除上清。
[0275]
向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液p1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
[0276]
向离心管中加入500μl溶液p2，温和地上下翻转6
‑
8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组dna，造成提取的质粒中混有基因组dna片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
[0277]
向离心管中加入700μl溶液p3，立即温和地上下翻转6
‑
8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400
×
g)离心10min。注意：p3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
[0278]
将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱cp3中12,000rpm (～13,400
×
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
[0279]
向吸附柱cp3中加入600μl漂洗液pw(请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm(～13,400
×
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
[0280]
重复操作步骤7。
[0281]
将吸附柱cp3放入收集管中,12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱cp3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0282]
将吸附柱cp3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50
‑
100 μl洗脱缓冲液eb，室温放置2min，12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
[0283]
(g)重组载体测序
[0284]
提取的质粒进行酶切，经鉴定正确后，送去金唯智生物科技有限公司进行测序。
[0285]
(2.1.2)合成插入片段基因，
[0286]
需要插入的sfv
‑
heper基因的序列如seq id no.5所示，将其进行基因合成。
[0287]
(2.1.3)将重组载体与插入片段进行同源重组，
[0288]
(a)同源重组、转化及提取质粒
[0289]
将重组载体与插入片段进行同源重组。重组的产物转化dh5α感受态细菌，涂布氨苄抗性的lb平板，37℃倒置培养16小时。将菌落pcr阳性的菌落进行小摇，保菌，参照omega质粒小量提取试剂盒说明书提取质粒
[0290]
(b)质粒酶切鉴定及测序
[0291]
将提取的质粒酶切鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳检测结果；将验证正确的结果送到金唯智生物科技有限公司进行测序。
[0292]
以此制得sfv
‑
helper质粒。
[0293]
(2.2)线性化后的psfv
‑
sp6
‑
p32及sfv
‑
heleper进行体外转录，根据 mmessage mmachine
tm
sp6转录试剂盒(am1340，购自赛默飞)所述方法进行体外转录，体系如下表6、7：
[0294]
表6 psfv
‑
sp6
‑
p32体外转录体系
[0295][0296]
表7 sfv
‑
helper体外转录体系
[0297][0298]
上述体系配好后37℃转录40min，然后加入1ul gtp 37℃继续转录2h,随后再加入1ul turbo dnase37℃、15min。转录结束后分别吸取1ul转录产物，加入4ul的nuclease
‑
free water及6
×
loading buffer进行稀释，注意无菌操作及防止rna降解，然后在1％sds
‑
page中进行电泳实验，验证条带正确与否。
[0299]
(2.3)psfv
‑
sp6
‑
p32及sfv
‑
heleper体外转录的mrna共电转入bhk细胞中，包括：
[0300]
1.细胞提前传至t75方瓶中，当细胞汇合度达到80％时，进行实验；
[0301]
2.在冰上预冷1.5ml ep管和pbs。在
‑
20℃冰箱中预冷0.2mm比色杯(电极杯)；
[0302]
3. 37℃预热6毫升培养基(含1％fbs dmem)；
[0303]
4.胰蛋白酶消化t25方瓶中细胞并用5毫升完全培养基重新悬浮；
[0304]
5. 500g、4℃离心5分钟；
[0305]
6.弃去上清液，并用10ml冰冷pbs清洗细胞颗粒；
[0306]
7. 500g、4℃离心5分钟，再次重复pbs清洗；
[0307]
8.弃去上清液并完全去除残留的pbs,并用遇冷的260ul pbs重悬细胞，混匀后分别吸取260ul的pbs细胞重悬液别置于预冷的1.5ml ep管；
[0308]
9.pbs细胞重悬液分别加入10ul的psfvcs
‑
sp6
‑
p32及sfv
‑
heleper转录产物放置冰上；
[0309]
10.将上述混合物转移到预冷的电极杯(4mm)中，设置电转仪条件同为100 v，20ms，电击一次，电击后置于冰上1min；
[0310]
11.然后分别向电极杯中加入约400ul的含1％fbs dmem吹打混匀，随即转至t25方瓶中，并加入6ml含1％fbs dmem,放置37℃5％co2培养箱中进行培养；
[0311]
12.电穿孔后观察细胞生长情况，待36h后收取上清液保存于
‑
80℃。
[0312]
(3)、间接免疫荧光实验鉴定p32蛋白表达
[0313]
1.上述收取上清后的细胞，用预冷至4℃的甲醇固定过夜，pbst洗涤三次；正常bhk细胞用作空白对照；
[0314]
2.加入5％1ml的bsa，37℃孵育1h,pbst洗涤三次；
[0315]
3.每孔加入1500倍稀释的非洲猪瘟血清，37℃孵育1h,pbst洗涤三次；
[0316]
4.每孔加入200倍稀释的iftc标记的山羊抗猪igg,37℃孵育1h,pbst洗涤三次,注意避光；
[0317]
5，培养板置于荧光显微镜下观察，及与正常细胞进行对比。
[0318]
(4)psfv
‑
p32病毒颗粒tcid
50
的测定
[0319]
用dmem培养基将psfv
‑
p32病毒作连续10倍稀释，即10
‑
1、10
‑2…
10
‑
8每个稀释度取100μl加入96孔细胞培养板中，随后加入经0.25％胰酶消化的bhk
‑
21细胞100μl(细胞含量以105/ml左右为宜)，每个稀释度作8个重复，并设空白细胞培养对照。置37℃5％co2培养箱中。逐日观察细胞病变，并记录细胞病变孔数，直到对照细胞老化脱落为止。按照reed
‑
muench法计算病毒的tcid50。
[0320]
(三)实验结果
[0321]
(1)bamhi/smai酶切双酶切质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp
[0322]
bamhi/smai酶切双酶切质粒psfv
‑
sp6
‑
egfp后，如下图片段分别为11051bp、725bp与理论值相符合，如下图2所示。图2中，m由上至下分别是:15000,10000,7500,5000,3000,1500,1000,500，1为smai、bamh双酶切片段。
[0323]
(2)重组质粒菌液鉴定
[0324]
分别挑取8个菌落，进行鉴定，如下图3所示的重组质粒菌液鉴定结果，菌落2,5,6,7,8大小均为1344bp左右，与理论值大小相符合。图3中，m由上至下分别是:2000、1000、750、500、250、100。
[0325]
(3)酶切鉴定及测序
[0326]
用smai、bamhi对菌液鉴定成功的质粒双酶切,如图4所示的片段大小分别为593bp、11051bp，与理论值大小相符合；送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果完全相同。
[0327]
图4中m由上至下分别是:15000,10000,7500,5000,3000，1500,1000,500；1为smai、bamh双酶切片段。
[0328]
(4)复制子质粒psfv
‑
sp6
‑
p32和辅助质粒sfv
‑
heleper体外转录
[0329]
用spei分别酶切psfv
‑
sp6
‑
p32及sfv
‑
heleper后，根据mmessagemmachine
tm
sp6转录试剂盒(am1340，购自赛默飞)所述方法进行体外转录，如下图5、6：
[0330]
图5中，m1由上至下分别是:15000,10000,7500,5000,3000,1500,1000,500；m2由上至下分别是:8000,5000,3000,1500，1000，500；泳道2为psfv
‑
sp6
‑
p32体外转录结果；
[0331]
图6中，m由上至下分别是:8000,5000,3000,1500，1000，500；泳道4为sfv
‑
helper体外转录结果。
[0332]
由图5和图6可知，psfv
‑
sp6
‑
p32及sfv
‑
helper体外转录经电泳后的目的条带与理论值相符合。
[0333]
(5)间接免疫荧光实验鉴定p32蛋白表达
[0334]
上述体外转录的psfvcs
‑
sp6
‑
p32、sfv
‑
helper起电转入bhk细胞中,然后接入t25方瓶中进行培养，36h后收集上清液后的细胞进行ifa鉴定asfv p32 蛋白的表达，结果发现有较强荧光表达，而阴性对照组却无荧光表达(图7)。
[0335]
(6)psfv
‑
p32病毒颗粒tcid
50
的测定
[0336]
按照reed
‑
muench法计算病毒的滴度为10
‑3tcid
50
/
0.1ml
，滴度满足于后续的动物实验要求。
[0337]
综上，本发明经过ifa实验成功鉴定了p32的蛋白表达，为后续其它重要非洲外源蛋白的表达筛选和mrna疫苗研制提供可靠的实验基础和科学依据。
[0338]
以上所述的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。