一种芸苔链格孢菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种芸苔链格孢菌及其在抑菌方面的应用。


背景技术：

2.芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)隶属于真菌界、子囊菌门、子囊菌亚门、座囊菌纲、格孢腔目、孢腔菌科，是链格孢属常见的一种。链格孢属(alternaria spp.)是半知菌暗色丝孢菌中重要的一类真菌，该属真菌种类多，寄主范围和地理分布广泛。95％以上的种能兼性寄生在植物上，是重要的植物病原菌。有些种是人和动物的条件致病菌，引起多种疾病。有些种可用作杀菌剂、除草剂等，是有应用潜力的生物资源。
3.小麦赤霉病由真菌禾谷镰孢菌(fusarium graminearum)引起，不仅造成小麦大幅度减产，还能产生真菌毒素，给农业生产、生态造成巨大的损失。由于降水增加、秸秆还田等因素，小麦赤霉病在我国小麦各大主产区频繁大面积发生，已成为黄淮麦区小麦的主要病害，严重影响小麦的产量和品质。
4.玉米大斑病是为害玉米较重的叶部病害，由真菌玉米大斑病菌引起。玉米大斑病菌的无性态(exserohilum turcicum)为玉米大斑凸脐蠕孢菌，属无性菌类凸脐蠕孢属；有性态 (setosphaeria turcica)为大斑刚毛座腔茵，属子囊菌门毛球腔菌属。玉米大斑病表现为植株变黄早枯，发生翻秸，常常地里一片枯黄，严重损失玉米产量。玉米大斑病的发生和流行，不仅造成严重的经济损失而且降低了玉米的品质。该病自70年代以来，在我国主要分布在北方和高海拔山区等冷凉玉米种植区。一般年份减产20％左右，在严重流行的年份和地区，导致玉米减产50％，甚至更多。
5.柑橘褐斑病是一种由真菌alternaria alternate引起的落叶性病害，病菌主要危害嫩叶、新梢和幼果(对高感病品种，果实整个生育期均可受害)，引起落叶、落果和枯梢，未脱落果实也因果面病斑无法上市鲜销。感病植株的果实则可以刚坐果一直到采果前都可以感染并导致严重落果。橘红原产我国，主产四川、重庆等地，其中三峡库区腹地的云阳县，以种植大红袍红橘为主，种植历史达4000年。近年来，柑橘褐斑病的危害面积不断扩大，对橘红品质的影响严重。
6.植物病害一直严重影响种植产品的品质和产量，每一年，国内外的农作物及药用植物的总产量因植物病害减少10％以上，因此解决农作物及药用植物的品质不佳和总产量降低的问题，对研究植物病害的防治迫在眉睫。生物防治具有生防效果较好、药效期持久、没有残留等优势，可以避免化学防治所带来的弊端，日益成为农业可持续发展的热门研究方向。


技术实现要素：

7.本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种芸苔链格孢菌及其在抑菌方面的应用，该菌株具有易于培养、产量高、培养性状稳定等的特点，其培养物对上述5株农作
物病原真菌具有较高的抑菌活性。
8.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：本发明第一方面提供一种芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010，已于2021年7月15 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.23045。
9.本发明第二方面提供所述的芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010在制备抑菌剂中的应用。
10.进一步，优选的是，所述的抑菌剂抑制的真菌为小麦赤霉病菌、玉米大斑病菌、橘红褐斑病病原菌中的至少一种。
11.进一步，优选的是，所述的抑菌剂中的活性成分包括所述的芸苔链格孢菌(alternariabrassicae)xl-0010培养物。
12.进一步，优选的是，所述的抑菌剂中的活性成分包括芸苔链格孢菌(alternariabrassicae)xl-0010培养物的提取物；所述的提取物以芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl
‑ꢀ
0010培养物为原料经有机溶剂萃取获得。
13.本发明第三方面提供所述的芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010培养物，所述的芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010培养物为液体培养物；培养方法为：将芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010划线接种于pda斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养3-5天；配制pdb液体培养基，将生长好的斜面直接接入pdb液体培养基，置于28℃、180rpm摇床中培养15-20天，取出，即得液体培养物；所述pda斜面培养基配方：马铃薯浸粉3g/l，葡萄糖20g/l，琼脂14g/l，ph值5.6
±
0.2；所述pdb液体培养基配方：马铃薯浸粉5g/l，葡萄糖15g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l， ph值自然。
14.本发明第四方面提供所述的芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010培养物的提取物，将所述的芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010培养物采用有机溶剂进行萃取，即得。
15.进一步，优选的是，所述的有机溶剂为乙酸乙酯。
16.本发明所述的芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010培养物还可以以芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010为原料，以本领域常规的pda培养基、pdb培养基等进行培养获得。
17.本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明提供一种芸苔链格孢菌及其在抑菌方面的应用，本发明芸苔链格孢菌xl-0010的液体培养物对于小麦赤霉病菌(fusarium graminearum，nb-05)、玉米大斑病菌(setosphaeriaturcica，nb-06)、橘红褐斑病病原菌(alternaria alternata)这3株真菌具有显著的抑制作用，其抑菌率能最高可达到40％，应用前景广泛。
附图说明
18.图1为芸苔链格孢菌xl-0010的单菌落形态图(pda平板)；其中，图1-a为平板正面
图；图1-b为平板背面图。
19.图2为芸薹链格孢菌xl-0010对3株植物病原真菌的抑制作用(pda平板)；其中，图2-a为平板正面图；图2-b为平板背面图芸薹链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010，已于2021年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.23045，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
20.下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
21.本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
22.实施例1芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010的来源及鉴定
①
芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010的来源2017年9月4日从辽宁省沈阳药科大学植物园采摘的决明中分离到一株真菌，命名为xl
‑ꢀ
0010。
23.②
菌株xl-0010的鉴定xl-0010的的its测序序列见序列表(seq id no.1)，与sequence id:mw008951.1的序列相似性最高，相似性为99.62％。
24.根据以上鉴定结果，xl-0010属于芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)。
25.实施例2芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010的主要形态特征将芸苔链格孢菌xl-0010接于马铃薯葡萄糖培养基上，28℃恒温培养，菌落初期为白色，呈放射状扩展，菌丝体茂密，菌落圆形，边缘整齐，气生菌丝发达，3d后菌落颜色逐渐变深，慢慢变为灰褐色。分生孢子梗暗色，单支，长短不一，顶生分生孢子。分生孢子暗色，分生孢子具横隔膜6～12个，纵、斜隔膜0～6个，孢身64.0～158.0
×
19.5～38.0μm，喙 23.0～93.0
×
6.0～8.0μm。
26.所述pda培养基配方：马铃薯浸粉3g/l，葡萄糖20g/l，琼脂14g/l，ph值5.6
±ꢀ
0.2。
27.该菌株在pda平板单菌落形态图见图1，图1-a为图1-a为平板正面图；图1-b为平板背面图。
28.实施例3芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010对病原真菌抑菌率测定采用平板对峙法测定待筛真菌(芸苔链格孢菌xl-0010)对供试真菌(十数株病原真菌)的抑菌能力，具体方法如下：配制pda平板，分别培养待筛真菌和供试真菌，待菌落直径达到70-80mm后，然后用灭菌的5mm的打孔器，分别在两种培养基生长一致的部位打孔(距皿边缘等距离)。在pda空平板上，分别用灭菌的小镊子挑取打孔的培养基块，在距离平板中心同一直线上约为3cm处，分别反转接种两种真菌，然后每24小时度量一次抑菌圈大小(十字交叉法)。依据以下公式计算抑菌率：抑菌率＝[(对照菌落直径-5)-(处理菌落直径-5)]
÷
(对照菌落直径-5)
×
100％
注：“5”为打孔器所取菌落的直径。
[0029]
所述pda培养基配方：马铃薯浸粉3g/l，葡萄糖20g/l，琼脂14g/l，ph值5.6
±ꢀ
0.2。
[0030]
芸苔链格孢菌xl-0010对不同病原真菌抑制率见表1(表中只记载了待筛真菌对供试真菌抑制率高于20％的供试真菌)。
[0031]
表1芸苔薹链格孢菌xl-0010对不同病原真菌的抑制作用选用供试真菌抑菌率％nb-0531.84％nb-0646.00％yb-0529.06％其中，nb-05为小麦赤霉病菌(fusarium graminearum)，nb-06为玉米大斑病菌(setosphaeriaturcica)，yb-05为橘红褐斑病病原菌(alternaria alternata)。
[0032]
由表1可见，xl-0010对3株植物病原真菌抑菌活性较强，其中对的玉米大斑病菌 (setosphaeria turcica，nb-06)抑菌率最高，为46.00％。
[0033]
该菌株对3株植物病原真菌在pda平板的抑制作用见图2，平板上半部分为3株植物病原真菌，下半部分为芸苔链格孢菌xl-0010，其中，图2-a为平板正面图；图2-b为平板背面图。由图2可见，芸苔链格孢菌xl-0010对3株植物病原真菌表现出明显的抑制作用。
[0034]
实施例4芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010的液体培养菌株的活化：将保藏的芸苔链格孢菌xl-0010划线接种于pda斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养3-5天；菌株的液体培养：配制200ml/瓶的pdb液体培养基，将生长好的斜面直接接入液体摇瓶，置于28℃、180rpm摇床中培养15-20天，取出，即得液体培养物(即发酵液)。
[0035]
所述pda斜面培养基配方：马铃薯浸粉3g/l，葡萄糖20g/l，琼脂14g/l，ph值5.6
ꢀ±
0.2。
[0036]
所述pdb液体培养基配方：马铃薯浸粉5g/l，葡萄糖15g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠 5g/l，ph值自然。
[0037]
实施例5芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010乙酸乙酯粗提物的制备取实施例4的发酵液用等体积乙酸乙酯进行萃取，方法为：振荡30min，使发酵液与乙酸乙酯充分混合后，静置24h分液后，取出乙酸乙酯相即上层相，42℃减压旋蒸(真空度一般为﹣0.08mpa～﹣0.01mpa)，利用旋转蒸发仪将溶剂完全蒸干，得到菌液乙酸乙酯粗提物，置 4℃冰箱保藏备用。
[0038]
实施例6芸苔链格孢菌(alternaria brassicae)xl-0010乙酸乙酯粗提物的mic和 mbc值的测定取实施例5的菌液乙酸乙酯粗提物采用96孔板法进一步测定其最小抑菌浓度(mic)和最小杀菌浓度(mbc)，具体方法如下：
①
供试菌液的培养：将保藏的供试真菌(3株病原真菌)划线接种于pda斜面培养基上，置于 28℃培养箱中培养3-5天后，将生长好的斜面直接接入备用pdb液体培养基中，置于28℃， 180rpm摇床中培养48h，取出备用，即得供试菌液。
[0039]
②
样品溶液的配置：取1mg实施例5的菌液乙酸乙酯粗提物，加入100uldmso使其充分溶解，再用dmso定容，得到100ug/ml的样品溶液。
[0040]
③
96孔板法测定mic和mbc：取无菌96孔板，1-7孔中分别加入100μl的pdb 液体培养基，取样品溶液100μl加到1号孔中，混匀(浓度为50ug/ml)，从1号中取出 100μl加到2号孔中，混匀，依次稀释到7号孔，7号孔中取出100μl弃去。1-7号孔中样品浓度依次为50、25、12.5、6.25、3.125、1.563和0.7815ug/ml，再分别加入100μl的供试菌液。同一块96孔板上，以加100μldmso的小孔作为空白对照，以不加样品溶液只加100μl供试菌液的小孔作为阳性对照，以不加供试菌液只加100μl pdb液体培养基的小孔作为阴性对照。观察孔中培养液澄清的最低浓度为mic，取小孔液体澄清的50μl液体涂布到pda培养基上，28℃倒置培养48小时，重复三次，pda培养基上完全没有细菌生长的最低浓度为mbc。
[0041]
所述pda培养基配方：马铃薯浸粉3g/l，葡萄糖20g/l，琼脂14g/l，ph值5.6
±ꢀ
0.2。
[0042]
所述pdb液体培养基配方：马铃薯浸粉5g/l，葡萄糖15g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠 5g/l，ph值自然。
[0043]
芸苔链格孢菌xl-0010对不同病原真菌的最小抑菌浓度(mic)和最小杀菌浓度 (mbc)见表2。
[0044]
表2芸苔链格孢菌xl-0010对不同病原真菌的最小抑菌浓度(mic)和最小杀菌浓度(mbc) 选用供试真菌mic/(ug/ml)mbc/(ug/ml)nb-056.2550nb-060.781512.5yb-0512.550由表2可见，xl-0010液体培养物的乙酸乙酯粗提物对于小麦赤霉病菌、玉米大斑病菌、橘红褐斑病病原菌这3株病原真菌具有显著的抑制作用。
[0045]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。