一种基于二代测序技术检测Y-SNP单倍群的引物组合物、试剂盒和方法及其应用与流程

ms通过直接检测分子质量差异，准确性和成本上都非常可观。但以上技术通量有限，能检测的y-snp数目在50个以内，无法同时对多达几百个y-snp位点进行检测。因此一个通量高又适宜在法医领域推广的检测方法非常重要。ngs技术在准确性和通量方面具有巨大优势，适用于多样本、多y-snp的检测。将其作为技术手段在构建高分辨率y染色体进化树时，不会受到检测y-snp数量的限制，从而在每一次的检测中都保证了体系的完整性，避免分型错误。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术中的缺陷，并构建一个适用于中国人群的、高分辨率的完整y染色体进化树，本发明根据各个地区和群体的y染色体遗传结构特点，基于二代测序技术提供了一个用于y-snp单倍群复合扩增检测的引物组合物、试剂盒和方法。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明的第一方面是提供一种基于二代测序技术检测y-snp单倍群的引物组合物，该引物组合物包括381个y-snp位点的扩增引物；
9.上述381个y-snp位点包括af6、p305、p108、m60、m91、m130、f3393、cts11043、m8、m356、m38、m217、l1373、f3447、f1699、f3918、fgc28881.2、f1756、f3830、y10420、m48、m86、b90、m504、f3796、f9992、f1067、z1338、z1300、cts2657、cts11990、cts8579、m407、f3850、z12209、f1319、cts3385、fgc45548、f845、cts10923、mf2091、p143、m168、m294、cts3946、jst021355、m174、cts11577、m15、n1、z27269、ph4979、ph1991、y7820、sk541、z31625、z31584、p99、p47、m533、z34359、ph97、z42599、z42600、z42601、z42602、m116.1、m145、m96、m89、m427、m201、p287、p15、cts4367、l30、p303、l140、f1329、l901、m69、m52、m82、m578、m170、m429、m522、m304、m267、m172、m410、l26、m47、m67、m9、m526、m20、m22、m27、m317、p326、p256、m231、f3373、cts3750、cts11499、f1206、tat、m178、l708、p298、l392、cts10760、z1936、b197、m2019、f1008、m128、b523、p63、b525、f2930、cts582、m1819、f549、m214、m175、f265、m119、b384、p203.1、f446、f140、cts3265、f78、f81、f533、f492、f656、sk1568、z23406、m101、z23392、cts8423、cts52、cts701、z23266、cts716、cts352、z23271、m50、f1036、p31、m268、f2320、m1470、pk4、m95、f1252、m88、f2758、f2890、cts5854、z23810、z23781、f789、f838、cts1456、f993、f417、cts9996、m176、p49、m122、m324、f113、l127.1、kl1、l467、f1876、f2159、f1867、f852、f2266、l599、z43961、z43963、f854、z43966、f915、ims-jst002611、f240、f18、f117、cts5820、f13、f11、f632、f110、f17、f377、f856、f1095、f1418、f1495、cts7501、f793、y20951、y20932、f38、f12、f196、f930、f2685、f1365、f3232、y15976、y26383、fgc54486、cts12877、f2527、f723、f1422、cts2154、sk1691、ph203、f449、f238、f134、f1273、f724、f1266、cts498、fgc3750、p201、m188、f2588、cts445、cts201、m159、m7、f2680、f1276、cts6489、f1275、m113、n5、z25400、f1863、f1134、f1262、y26403、f1837、f862、f879、f1226、f2859、p164、m134、f450、m117、m133、f42、f438、y17728、f155、f813、y20928、f1754、f2137、f1442、f1123、f1369、f310、f402、f1531、z25853、cts5492、cts6987、z42620、cts4658、z25928、sk1730、z26010、a9462、cts7634、f317、f3039、y29861、cts5488、cts10738、cts9678、z39663、a9457、yp4864、z44068、f5524、f5525、z44071、z44091、cts4960、f122、f114、f444、f79、f629、f46、fgc16847、f48、f2505、f242、cts4266、z26108、f2887、f3607、f3525、cts3763、a9472、fgc16863、l1360、fgc16889、sk1768、f4249、fgc23868、cts335、
cts53、cts6373、a9473、f3386、y29828、fgc34973、f1739、f743、f748、am01822、n6、am01856、n7、f4110、f4068、f4124、am01845、f717、a16433、f742、f1150、f837、f1025、f1055、f3021、p295、m45、m242、f903、m346、m3、m207、m173、m420、sry10831.2、m17、z645、m458、z91、z93、f3105、y7、z2124、z2123、s4576、f1345、m343、l754、l389、p297、m269、m479、m124、fgc21706、b254、m184。
10.进一步地，上述扩增引物组合物包括核苷酸序列为seq id no.1～746的引物。
11.本发明的第二方面是提供一种包括上述引物组合物的基于二代测序技术检测y-snp单倍群的试剂盒。
12.进一步地，上述试剂盒还包括多重pcr反应所需的其他试剂、接头序列pcr反应所需的试剂和磁珠纯化所需要的的试剂。
13.进一步地，上述试剂盒检测的样本来源于血液(血斑)、精液(精斑)、唾液(唾液斑)、骨骼、毛发、人体组织，然后采用血液(血斑)、精液(精斑)、唾液(唾液斑)、骨骼、毛发或人体组织基因组dna(gdna)。
14.本发明的第三方面是提供采用上述试剂盒的基于二代测序技术检测y-snp单倍群的方法，包括如下步骤：
15.步骤一，多重pcr反应：以稀释好的gdna为模板，并配制扩增反应体系进行多重片段扩增；
16.步骤二，对pcr扩增产物进行磁珠纯化，然后进行接头序列pcr反应；
17.步骤三，对步骤二的扩增产物进行磁珠纯化构建成文库；然后对文库进行浓度、片段长度和纯度进行测量；
18.步骤四，将文库混合、变性后加入illumina miseq测序平台进行测序；将测序结果与参考基因组序列比对，采用samtools、gatk等软件寻找snp和indel，然后运用annovar软件对snp、indel位点进行注释、确定突变位点对应的基因信息等。
19.进一步地，步骤一的多重pcr反应体系为25μl，包括10μl ddh2o、4μl enhancer buffer jp(2n)、4μl引物混合物(2μm)、1μl gdna以及6μl igt-em101 polymerase mixture。
20.进一步地，步骤一的多重pcr反应条件为：预热105℃；95℃3分钟30秒；14个循环：98℃20秒，60℃3分30秒；72℃5分钟。
21.进一步地，上述接头序列pcr反应体系为25μl，包括17μl pcr磁珠纯化的产物，1μl igt-i5 index(10μm)、1μl igt-i7 index(10μm)和6μligt-em101 polymerase mixture。
22.进一步地，上述接头序列pcr反应条件为：预热105℃；95℃3分钟30秒；9个循环：98℃20秒，58℃1分钟，72℃30秒；72℃5分钟。
23.本发明的第四方面是提供上述引物组合物或者试剂盒在家系排查和对未知样本地理来源的父系族源推断中的应用。
24.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
25.(1)本发明基于二代测序技术构建了一个包含381个y-snp的扩增引物的引物组合物和试剂盒，选择位点时参考了中国人群单倍群频率，针对中国人群可获得高分辨率的单倍群结果，单倍群划分细致，推断准确。
26.(2)本发明采用多重pcr扩增子捕获技术进行引物设计和建库，结合热
力学稳定性的算法进行特异性引物设计，采用两步pcr扩增方法来完成目标区域扩增和建库，节省了大量的时间和成本；
27.(3)本发明可以采用多种样本类型进行文库构建，如口腔拭子、指甲、带毛囊的毛发和精斑等的基因组dna；由于设计的扩增子片段短，该体系对于降解检材也很友好。
附图说明
28.图1为本发明一实施例中复合扩增体系所涉及的y-dna单倍群基本树(2019年)及选取的y-snp数目情况；
29.图2为本发明一实施例中基于100个样本计算的每个y-snp位点的平均测序深度；
30.图3为本发明一实施例中复合扩增方法的灵敏度测试结果。
具体实施方式
31.本发明涉及一种基于二代测序技术高分辨率检测y-snp单倍群的引物组合物，其包括381个y-snp位点的扩增引物；
32.其中，其中，所述的381个y-snp位点均为根据中国人群各主要单倍群所占比例，结合各群体人口数，从y染色体进化树中选取的下游分支y-snp遗传标记，为了保证树的完整结构性，同时加入了许多重要节点主干单倍群，具体包括af6、p305、p108、m60、m91、m130、f3393、cts11043、m8、m356、m38、m217、l1373、f3447、f1699、f3918、fgc28881.2、f1756、f3830、y10420、m48、m86、b90、m504、f3796、f9992、f1067、z1338、z1300、cts2657、cts11990、cts8579、m407、f3850、z12209、f1319、cts3385、fgc45548、f845、cts10923、mf2091、p143、m168、m294、cts3946、jst021355、m174、cts11577、m15、n1、z27269、ph4979、ph1991、y7820、sk541、z31625、z31584、p99、p47、m533、z34359、ph97、z42599、z42600、z42601、z42602、m116.1、m145、m96、m89、m427、m201、p287、p15、cts4367、l30、p303、l140、f1329、l901、m69、m52、m82、m578、m170、m429、m522、m304、m267、m172、m410、l26、m47、m67、m9、m526、m20、m22、m27、m317、p326、p256、m231、f3373、cts3750、cts11499、f1206、tat、m178、l708、p298、l392、cts10760、z1936、b197、m2019、f1008、m128、b523、p63、b525、f2930、cts582、m1819、f549、m214、m175、f265、m119、b384、p203.1、f446、f140、cts3265、f78、f81、f533、f492、f656、sk1568、z23406、m101、z23392、cts8423、cts52、cts701、z23266、cts716、cts352、z23271、m50、f1036、p31、m268、f2320、m1470、pk4、m95、f1252、m88、f2758、f2890、cts5854、z23810、z23781、f789、f838、cts1456、f993、f417、cts9996、m176、p49、m122、m324、f113、l127.1、kl1、l467、f1876、f2159、f1867、f852、f2266、l599、z43961、z43963、f854、z43966、f915、ims-jst002611、f240、f18、f117、cts5820、f13、f11、f632、f110、f17、f377、f856、f1095、f1418、f1495、cts7501、f793、y20951、y20932、f38、f12、f196、f930、f2685、f1365、f3232、y15976、y26383、fgc54486、cts12877、f2527、f723、f1422、cts2154、sk1691、ph203、f449、f238、f134、f1273、f724、f1266、cts498、fgc3750、p201、m188、f2588、cts445、cts201、m159、m7、f2680、f1276、cts6489、f1275、m113、n5、z25400、f1863、f1134、f1262、y26403、f1837、f862、f879、f1226、f2859、p164、m134、f450、m117、m133、f42、f438、y17728、f155、f813、y20928、f1754、f2137、f1442、f1123、f1369、f310、f402、f1531、z25853、cts5492、cts6987、z42620、cts4658、z25928、sk1730、z26010、a9462、cts7634、f317、f3039、y29861、cts5488、
cts10738、cts9678、z39663、a9457、yp4864、z44068、f5524、f5525、z44071、z44091、cts4960、f122、f114、f444、f79、f629、f46、fgc16847、f48、f2505、f242、cts4266、z26108、f2887、f3607、f3525、cts3763、a9472、fgc16863、l1360、fgc16889、sk1768、f4249、fgc23868、cts335、cts53、cts6373、a9473、f3386、y29828、fgc34973、f1739、f743、f748、am01822、n6、am01856、n7、f4110、f4068、f4124、am01845、f717、a16433、f742、f1150、f837、f1025、f1055、f3021、p295、m45、m242、f903、m346、m3、m207、m173、m420、sry10831.2、m17、z645、m458、z91、z93、f3105、y7、z2124、z2123、s4576、f1345、m343、l754、l389、p297、m269、m479、m124、fgc21706、b254、m184。
33.下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
34.实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
35.实施例1
36.本实施例提供一种基于二代测序技术高分辨率检测y-snp单倍群的引物组合物和方法，具体的y-snp位点筛选、引物设计以及检测方法的步骤如下：
37.1.y-snp位点筛选及引物设计；
38.根据中国人群各主要单倍群所占比例，结合各群体人口数，从y染色体进化树中选取不同数量的下游分支y-snp遗传标记。为了保证树的完整结构性，同时加入了许多重要节点主干单倍群。参照2019年isogg网站(version:15.58)(https://isogg.org/tree/haplogrouptr2019.html)，总共筛选出针对中国人群381个y-snp位点，构成359个单倍群。将所选的381个y-snp位点的人类参考基因组37(grch37/hg19)的染色体位置等详细信息上传至引物设计网站(https://design.igenetech.com/)进行多重引物设计。为了获得更好的覆盖度(coverage)，对引物进行两轮设计和优化。
39.本实施例所述的扩增引物在y染色体上的位置及引物序列如表1所示。
40.表1复合扩增检测体系中扩增子及扩增引物序列
41.42.43.44.45.46.47.48.49.50.51.52.53.54.55.56.57.[0058][0059]
2.建库；
[0060]
选择多重pcr扩增子捕获技术采用两步pcr扩增方法来完成目标区域扩增和建库。文库构建流程包括：多重pcr反应、磁珠纯化合并产物、接头序列pcr反应、磁珠纯化和文库浓度测量与质检，具体过程如下：
[0061]
(1)多重pcr：以稀释好的gdna为模板，使用ai-mito-multi panel试剂盒进行多重片段扩增，扩增反应的总体积为25μl，配置表见表2。
[0062]
表2.多重pcr反应体系
[0063]
[0064][0065]
pcr反应条件：预热105℃；95℃3分钟30秒；14个循环：98℃20秒，60℃3分30秒；72℃5分钟。
[0066]
(2)利用ampure xp磁珠纯化pcr产物。
[0067]
(3)接头序列pcr反应：反应体系见表3。
[0068]
表3.接头序列pcr反应体系
[0069][0070]
pcr反应条件：预热105℃；95℃3分钟30秒；9个循环：98℃20秒，58℃1分钟，72℃30秒；72℃5分钟。
[0071]
(4)进行第二轮磁珠纯化，随后取2μl文库使用3.0 fluorometer进行浓度测定，记录文库浓度；取1μl文库样本使用agilent 2100 bioanalyzer system(high sensitivity dna kit)进行文库片段长度和纯度测量。
[0072]
(5)将文库混合、变性后加入illumina miseq测序平台进行测序。将测序结果与参考基因组序列比对，采用samtools、gatk等软件寻找snp和indel，然后运用annovar软件对snp、indel位点进行注释、确定突变位点对应的基因信息等。
[0073]
其中，上述复合扩增体系所涉及的y-dna单倍群基本树(2019年)及选取的y-snp数目情况如图1所示。
[0074]
实施例2
[0075]
本实施例为实施例1提供的基于二代测序技术高分辨率检测y-snp单倍群的方法的法医学验证工作。
[0076]
按照dna分析方法科学工作组(scientific working group for dna analysis methods,swgdam)要求对实施例1构建的方法的测序质量、灵敏度、重复性、准确性、案件检材适用性进行评估并计算法医学参数。
[0077]
基于100个样本计算的每个y-snp位点的平均测序深度如图2所示，文库构建顺利，测序质量较好。
[0078]
法医学验证的结果显示，该方法的建议dna投入量至少在1.25ng，但应用于法医实践中dna浓度极小的微量样本仍有可能获得有意义的单倍群结果，灵敏度测试结果如图3所示；重复性好；特异性好，动物样本和女性样本利用该方法均不能得到有效扩增；准确性高；适用于多种类型检材的dna分型；在200例汉族人群中共发现7个主干单倍群，其中主流单倍群仍然是o、c、n和d，这与中国人群频率分布一致。细分之下的单倍群可达到93个末端单倍群，hd值高达0.9883。
[0079]
由上述实施例可知，本发明所述的基于二代测序技术高分辨率检测y-snp单倍群的方法可应用于家系排查和对未知样本地理来源的父系族源推断中，为法医学实践提供一种灵敏度高、分辨率高和系统效能强的族源推断技术。
[0080]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。