一种胸膜肺炎放线杆菌ApxIV蛋白单克隆抗体及其阻断ELISA试剂盒的制作方法

一种胸膜肺炎放线杆菌apxiv蛋白单克隆抗体及其阻断elisa试剂盒
技术领域
1.本发明涉及胸膜肺炎技术领域，具体为一种胸膜肺炎放线杆菌apxiv蛋白单克隆抗体及其阻断elisa试剂盒。


背景技术：

2.猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，pcp)是猪的一种呼吸系统传染病。胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumoniae，app) 是一种革兰阴性短杆状细菌，是pcp的重要致病因子。
3.pcp自1957年发现以来，导致各国生猪产业蒙受很大经济损失，最急性型病例没有任何征兆突然死亡，口鼻流出带血的泡沫样分泌物；急性病例厌食，发烧，呼吸窘迫，用口呼吸，以出血性和坏死性胸膜肺炎为特征，死亡率高；慢性病例表现出较轻的症状，死亡率较低，能克服急性疾病的猪仍会受到慢性感染，虽然没有临床症状，但在鼻腔、扁桃体中带有app，成为病原携带者，溶血外毒素(actinobacillus pleuropneumoniae-rtx-toxins，apx) 是app重要的毒力因子，其中apxiv最为特殊，其仅在app感染猪时由app 所有血清型菌株产生，在体外条件下不产生，并且不会由任何其他细菌产生，自然感染了app的猪体内有针对apxiv的特异性抗体，因此apxiv elisa 检测方法被认为是最具特异性的检测方法，apxiv蛋白分子量很大，利用大肠杆菌进行原核表达易形成包涵体，而包涵体的免疫原性较差，因此，对apxiv 蛋白进行截短表达，以使其表达在上清，可以有效提高蛋白的免疫原性，利于制备针对apxiv蛋白的单克隆抗体，当前apxiv elisa检测方法多采用间接elisa，但间接elisa特异性不够好，利用单克隆抗体建立阻断elisa方法能够有效提高特异性，更为高效，灵敏。
4.为此，我们提出一种胸膜肺炎放线杆菌apxiv蛋白单克隆抗体及其阻断 elisa试剂盒。


技术实现要素：

5.鉴于上述和/或现有一种胸膜肺炎放线杆菌apxiv蛋白单克隆抗体及其阻断elisa试剂盒中存在的问题，提出了本发明。
6.因此，本发明的目的是提供一种胸膜肺炎放线杆菌apxiv蛋白单克隆抗体及其阻断elisa试剂盒，通过以截短的可溶性表达的rtapxiv蛋白作为免疫原，利用细胞融合和亚克隆技术，获得能够稳定分泌针对rtapxiv蛋白的单抗的杂交瘤细胞株，为后续rtapxiv阻断elisa方法的建立打下基础，能够解决上述提出现有包涵体的免疫原性较差和间接elisa特异性不够好的问题。
7.为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种胸膜肺炎放线杆菌apxiv蛋白单克隆抗体，由保藏编号为cctcc no:c2021112 的杂交瘤细胞株分泌产生。
8.所述胸膜肺炎放线杆菌apxiv蛋白单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
9.(1)以胸膜肺炎放线杆菌apxiv蛋白编码基因seq id no.3为模板，使用上游引物基因序列
10.5＇-cgcctcgagggtagccaaaaagataataactt-3＇(seq id no.1) 和下游引物基因序列5＇-cgcaagcttattcacatcggtaaattttaagg-3＇ (seq id no.2)对模板进行扩增获得两端带有酶切位点的胸膜肺炎放线杆菌 tapxiv蛋白基因，并将其重组到原核表达载体pcoldi-tapxiv中构建原核重组质粒，再将所述原核重组质粒转化至感受态细胞；
11.(2)将感受态细胞进行培养表达，得到tapxiv重组蛋白，并对tapxiv 重组蛋白进行纯化；
12.(3)将纯化后的tapxiv重组蛋白免疫balb/c小鼠后，测定小鼠血清效价，取其脾脏制备脾细胞悬液；将同系的sp2/0细胞与小鼠脾细胞融合制备sp2/0 杂交瘤细胞，筛选并纯化阳性的sp2/0杂交瘤细胞；
13.(4)采用体外细胞培养法培养步骤(3)所述的阳性sp2/0杂交瘤细胞，将该阳性细胞打到小鼠腹腔中获得小鼠腹水，将腹水进行纯化获得鼠单克隆抗体。
14.本发明还提出了胸膜肺炎放线杆菌apxiv蛋白单克隆抗体在胸膜肺炎放线杆菌apxiv蛋白的生物检测中的应用。
15.本发明还提出了一种检测胸膜肺炎放线杆菌的阻断elisa试剂盒，所述试剂盒包括：包被酶标版，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，所述包被酶标板以胸膜肺炎放线杆菌apxiv蛋白作为包被抗原，所述单克隆抗体是针对所述apxiv蛋白而制备的抗体；所述单克隆抗体为权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生；
16.所述apxiv蛋白的编码核苷酸序列如seq id no:3所示。
17.进一步地，所述试剂盒还包括选自血清稀释液、洗涤液、底物显色液、终止液、标准阳性血清、标准阴性血清中的一种或多种。
18.进一步地，所述包被抗原的浓度为0.25μg/ml。
19.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
20.1.pcp是猪的一种呼吸系统急性接触性传染病，临床症状包括高烧、咳嗽和流鼻涕，从急性和慢性感染中康复的猪可以持续排出病原体而没有临床症状，因此难于控制和根除，apxiv只在动物体内表达且仅由app产生，根据这一特点建立的apxiv-elisa可有效区分app疫苗接种猪与野毒感染猪，并能与副猪嗜血杆菌等呼吸道病原进行鉴别诊断，因此，以apxiv为免疫原，制备单克隆抗体，用于阻断elisa方法的建立，可以提高血清学诊断的特异性和敏感性；
21.2.单抗制备首先要有免疫原性良好的蛋白免疫小鼠，apxiv有很好的免疫原性，但是其蛋白分子量大，原核表达易形成包涵体，由于包涵体需要经过繁复的变性溶解和复性折叠过程，导致目的蛋白复性率低、损失量大，而可溶性蛋白表达则可以很好地避免这一问题，因此，本实验在蛋白抗原性和亲疏水性分析的基础上，设计了针对apxiv截短蛋白的基因扩增引物，扩增特异性基因片段，利用大肠杆菌进行原核表达，实现了rtapxiv蛋白的可溶性表达，用其作为免疫原免疫balb/c小鼠，通过细胞融合技术和亚克隆技术得到了针对rtapxiv蛋白的特异性单抗；
22.3.细胞融合是单抗制备的关键环节，细胞融合使用的sp2/0细胞应采用形态饱满、边界清楚的细胞，如果发现细胞出现皱缩，形状不规则等状况，应更换细胞，以免导致后续
细胞融合失败，在细胞融合前三天，对小鼠进行一次冲击免疫，可有效活化脾细胞，有利于提高杂交瘤细胞分泌抗体的能力， peg4000应注意避光，在加入peg4000前，应用巴氏吸管尽可能的将培养液吸取干净，可有效提高细胞融合率；
23.4.饲养细胞能够为杂交瘤细胞的生长提供足量的生长因子，腹腔巨噬细胞制备方便，而且可以吞噬清除死亡细胞，故本实验采用腹腔巨噬细胞作为饲养细胞；
24.5.筛选杂交瘤细胞应注意避免筛选到假阳性，用间接elisa检测细胞上清效价，应在全部换液后的第二天进行检测，检测3次以确认为阳性，同时，用细胞上清与无关蛋白反应，避免出现与非目的蛋白反应的情况；
25.6.筛选到的15株单抗，针对相同抗原表位，可能是由于截短表达的蛋白优势抗原表位有限，且该抗原表位优势明显；
26.7.本发明的阻断elisa方法，重复性良好，相对敏感性达96％，相对特异性达100％，临床试验阳性检出率达73％，可用于临床检测。
27.生物保藏说明
28.杂交瘤细胞株1d7于2021年05月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为cctcc no:c2021112。
附图说明
29.图1为本发明重组质粒pcoldi-tapxiv的pcr鉴定图，图中各泳道为： m、dl2000 dna maker，1、代表阴性对照，2、pcoldi-tapxiv。
30.图2为本发明重组质粒pcoldi-tapxiv的双酶切鉴定图，图中各泳道为： m、dl5000 dna maker，1、pcoldi-tapxiv双酶切产物。
31.图3为本发明重组蛋白rtapxiv的诱导表达图，图中各泳道为：m、蛋白 marker，1、rosetta/pcoldi-tapxiv诱导全菌，2、rosetta/pcoldi-tapxiv超声破碎后上清，3、rosetta/pcoldi-tapxiv超声破碎后沉淀。
32.图4为本发明重组蛋白rtapxiv的his单抗western blot鉴定与免疫反应性分析图。图a各泳道为：m、蛋白marker，1、诱导后rosetta/pcoldi-tapxiv 上清。图b各泳道为：m、蛋白marker，1、诱导后rosetta/pcoldi-tapxiv上清。
33.图5为本发明重组蛋白rtapxiv纯化结果图，图中各泳道为：m、蛋白 marker，1、代表诱导后菌液，2、代表超声破碎后上清，3、代表超声破碎后沉淀，4～6、流穿液，7～9、洗涤缓冲液，10、纯化后蛋白。
34.图6为本发明western blot分析单抗1d7特异性图，图a为单抗1d7上清为一抗与rtapxiv蛋白反应图，其各泳道为：m、蛋白marker，1、rtapxiv 蛋白，2、rosetta。图b为sp2/0上清为一抗与rtapxiv蛋白反应图，其各泳道为：m、蛋白marker，1、rtapxiv蛋白。
35.图7为本发明sds-page鉴定纯化后腹水图，图中各泳道为：m、蛋白 marker，1、纯化腹水。
36.图8为本发明阴阳性血清的western blot分析图，图中各泳道：m、蛋白 marker，1、rtapxiv蛋白；2、rtapxiv蛋白。
具体实施方式
37.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
38.实施例1杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体的制备和鉴定
39.1材料和方法
40.1.1菌株、质粒、细胞及实验动物
41.app血清2型和5型、大肠杆菌dh5α、rosetta(de3)、骨髓瘤细胞sp2/0 等由本实验室保存；pcoldi购自takara(大连)生物技术有限公司；balb/c 小鼠和icr小鼠订购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
42.1.2主要实验试剂及耗材
43.限制性核酸内切酶xhoi和hindiii购于赛默飞世尔科技(中国)公司；细菌基因组dna提取试剂盒、hrp标记山羊抗鼠igg抗体购于天根生化科技有限公司；辣根过氧化物酶(hrp)标记的金黄色葡萄球菌a蛋白购于武汉博士德公司；小鼠抗6
×
his组氨酸单克隆抗体(mab)购于南京天为公司；2
×
phantamaster mix购于诺唯赞生物科技股份有限公司；dna marker dl2000、 dna marker dl5000购于擎科生物科技有限公司；琼脂糖凝胶回收盒购自biomega；sds-page试剂盒购于雅酶公司；rpmi medium 1640basic(1x)购于gibco公司；peg4000、hat media supplement、ht media supplement购于 sigma公司；fbs血清购于science cell公司；配制lb的固体粉末购于中国台湾生工；单抗亚型鉴定试剂盒购于proteintech生物科技有限公司；细胞培养板购于nest公司；其他化学试剂由实验室现用现配，或纯度为分析纯的试剂。
44.1.3apxiv截短基因片段的扩增
45.按照tianamp bacteria dna kit说明，将app血清2型和5型菌液转接至tsb，培养过夜后，取3ml用于提取app基因组dna。根据genbank中收录的app apxiv基因序列，应用dnastar protean软件进行亲水性分析及b 细胞抗原表位预测，选取亲水性好且b细胞抗原表位集中的序列，设计引物 (表1)。pcr扩增体系和扩增条件见表2。
46.表1扩增tapxiv基因的引物
[0047][0048]
注：下划线为酶切位点；
[0049]
表2 tapxiv基因的扩增体系和条件
[0050][0051]
1.4pcoldi-tapxiv重组质粒的构建
[0052]
将1.3中获得的pcr产物跑电泳后，回收目的片段。tapxiv基因回收后的产物和pcoldi载体分别使用限制性内切酶xho i和hind iii在37℃水浴中酶切2h，酶切体系见表3。
[0053]
表3酶切体系
[0054][0055][0056]
通过核酸凝胶电泳，回收产物后进行连接，连接体系见表4，22℃连接 1h。转化连接产物进入dh5α内，经37℃1h复苏后，将菌液离心，弃去上清，用100μl lb液体培养基重悬涂板。37℃培养12-14h后，挑取单菌落在含有氨苄酶素的lb液体培养基中培养。按质粒提取试剂盒说明书提取质粒，进行双酶切鉴定同时测序，经鉴定正确的重组质粒命名为pcoldi-tapxiv。
[0057]
表4 pcoldi-tapxiv重组质粒的连接体系
[0058][0059]
1.5重组蛋白tapxiv的原核表达和可溶性分析
[0060]
将pcoldi-tapxiv转化进入rosetta(de3)感受态细胞中，经37℃1h复苏后，取100μl涂板。挑取单菌落接种于3ml的液体lb(含ampr)中，37℃200 rpm振荡培养至od
600nm
值为0.4至0.6，每管中加入终浓度为1mmol
·
l-1
的诱导剂iptg用于诱导外源目的蛋白的表达，继续培养24h后，13000rpm离心1min，弃上清，用500μl无菌pbs重悬。取100μl重悬液加入25μl 5
×
sdsloading buffer，在100℃水中煮10min。将剩余洗涤后的菌液在冰水混合物中进行超声波破碎，直至菌液澄清透光，离心沉淀后收集上清液，并用500μl 无菌pbs重悬沉淀，煮样。分别取20μl煮好的样品加入到12.5％的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。将电泳后的凝胶浸没于考马斯亮蓝中均匀染色2h，脱色后用蛋白胶曝光仪分析凝胶中的蛋白表达形式。
[0061]
1.6重组蛋白tapxiv的western blot鉴定及免疫反应性分析
[0062]
使用rosetta/pcoldi-tapxiv的诱导表达后的上清进行sds-page，将其转印到nc膜上，nc膜用5％脱脂乳室温封闭3h，pbst洗涤三次后，以1： 5000稀释的6
×
his标签单抗为一抗，室温作用1h；洗涤后，与以hrp-山羊抗鼠igg抗体在室温下孵育45min；洗涤后，将膜均匀涂布发光混合液，用 ecl曝光仪进行曝光分析。另外，以1:100稀释的临床猪阳性血清为一抗， spa作为二抗，按以上步骤进行实验。
[0063]
1.7重组蛋白tapxiv纯化方法
[0064]
将100ml经iptg诱导的菌液用pbs洗涤2次后，用结合缓冲液重悬，进行超声破碎，13000r/min离心10min后取上清用0.22μm滤器过滤后作为蛋白样品。参照ni-nta说明书，先将10倍柱体积结合缓冲液通过镍柱，然后加入蛋白样品，之后用洗涤缓冲液洗涤树脂，至流穿液中溶质含量保持稳定，最后以5倍柱体积洗脱缓冲液洗脱树脂，收集纯化样品。
[0065]
1.8免疫小鼠
[0066]
用rtapxiv蛋白皮下多点注射100μg/只，免疫6只balb/c小鼠，另取1 只作为阴性对照。首免使用fca佐剂，二免和三免使用fia佐剂，共进行3 次免疫，每次免疫相隔2周。三免10天后对所有小鼠尾尖采血，分离血清，按照倍比稀释法将血清加入包被2μg/ml rtapxiv蛋白的96孔板中，检测小鼠血清的抗体效价。选择效价最高且在1:10000以上的一只小鼠，在细胞融合前3天对其腹腔注射50μg rtapxiv蛋白进行冲击免疫，准备细胞融合。
[0067]
1.9间接elisa方法筛选抗体效价最高的小鼠
[0068]
1.9.1待检血清的准备
[0069]
对经过三次免疫的6只小鼠进行尾尖采血，经4000rpm离心5min后，吸取上层液体即为待检血清。
[0070]
1.9.2抗原包被板的准备及血清效价测定
[0071]
(1)包被：用ph＝9.6的碳酸盐缓冲液将rtapxiv蛋白浓度调整为2 μg/ml，每孔100μl，置于37℃孵育2h。用pbst将酶标孔洗涤三遍，并拍干。
[0072]
(2)封闭：往包被好的酶标孔中加入5％脱脂奶粉，每孔200μl，37℃孵育2h，pbst洗涤三次后拍干。将暂时不用的包被、封闭好的酶标板置于
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80℃冰箱保存备用，在下次实验中使用从-80℃冰箱拿出的酶标板时，先置于 37℃温箱5min复温，再进行后续实验。
[0073]
(3)一抗：将待检血清梯度稀释，酶标板上第1孔从1:100稀释度开始，直至第12孔稀释倍数为1：204800倍，稀释液为pbs，用排枪进行操作。同时设置阴性孔作为对照，与上述操作同时进行。酶标板中每孔待检稀释血清体积为100μl，37℃孵育1h，用pbst洗涤三次，拍干。
[0074]
(4)二抗：加入羊抗鼠igg-hrp抗体，每孔100μl，37℃孵育45min， pbst洗涤三次，拍干。
[0075]
(5)显色：避光操作，每孔加入100μltmb显色液，置于37℃ 10min。
[0076]
(6)终止和读数：显色完后迅速加入50μl 2m h2so4终止反应进行，立刻使用酶标仪进行读数(od
450nm
)。
[0077]
(7)结果判断：p/n值≥2.1即为阳性，其中p值为免疫小鼠的血清od
450nm
值，n值为阴性对照小鼠的od值，显示为阳性的最高稀释倍数即为该血清的效价。选择血清效价最高的一只小鼠进行后面的细胞融合实验。
[0078]
1.10细胞融合
[0079]
1.10.1准备饲养细胞
[0080]
准备进行细胞融合的前一天取健康的icr小鼠断颈处死，置于75％乙醇中转移至超净台内，固定在解剖板上，暴露腹膜。用无菌注射器吸取hat培养液(含有2％hat，1％双抗，20％fbs以及rpmi 1640)注入小鼠腹腔灌洗，获取腹腔巨噬细胞。用hat培养液补齐至70ml，铺至96孔细胞培养板中，每孔100μl，置于37℃，5％co2温箱中培养。
[0081]
1.10.2收集骨髓瘤细胞(sp2/0)
[0082]
细胞融合前准备8瓶sp2/0细胞，细胞融合时，选择形态饱满、边界清楚的细胞，用无血清的rpmi 1640洗涤2次，将细胞吹落，收集到高压灭菌的 50ml的离心管中，细胞全部收集完成后，用无血清的rpmi 1640补足至30 ml，1000rpm离心10min，弃上清，用10ml无血清的rpmi 1640重悬沉淀，进行细胞计数，置于37℃，5％co2温箱中备用。
[0083]
1.10.3收集免疫脾细胞
[0084]
将血清效价最高的小鼠断颈处死，在超净台中取出脾脏，用无血清rpmi1640冲洗后置于细胞滤网中研磨，用无血清rpmi 1640反复冲洗滤网，将滤液转移到50ml的离心管中，用无血清rpmi 1640补足30ml，1000rpm离心10min，弃上清，用10ml无血清的rpmi 1640重悬细胞，进行细胞计数，置于37℃，5％co2温箱中备用。
[0085]
1.10.4细胞融合方法
[0086]
(1)分别吸取准备好的sp2/0和脾细胞，按照细胞数为1：5～1：10的比例混合均匀至50ml离心管中，离心弃上清，轻轻抖动使细胞松散，置于 40℃水浴中。
[0087]
(2)在避光条件下用巴氏吸管吸取1ml peg4000在45s内滴入离心管，边滴边晃动离心管，加完后轻轻搅拌1min，使peg4000和细胞充分混合。再缓慢加入10ml预热的无血清
rpmi 1640。于3℃培养箱静置作用10min， 1000rpm离心10min，弃上清。
[0088]
(3)加入适量hat培养基，重悬融合后的细胞，将其铺至准备好的饲养细胞中，第1、2块板子细胞浓度为2.5
×
106个/ml；第3、4块板子细胞浓度为2
×
106个/ml；第5、6块板子细胞浓度为1.5
×
106个/ml。将细胞板移 37℃，5％co2温箱中进行培养。次日观察细胞有无污染。
[0089]
(4)将细胞板放置37℃ 5％co2温箱中培养一周后，观察细胞生长状况，记录细胞团的生长情况，计算细胞融合率。当细胞团长至细胞孔的1/10大小时，进行换液，第二天对细胞上清抗体效价进行第一次检测。
[0090]
1.10.5分泌抗体的杂交瘤细胞团筛选及亚克隆
[0091]
每次吸取细胞孔内的100μl细胞上清进行检测时，都需将孔内的培养液全部更换加入新的200μl hat营养液。使用纯化后的rtapxiv蛋白包被elisa 板，小鼠阳性血清1:100稀释后作为阳性对照；sp2/0上清为阴性对照。酶标仪设置od
450nm
读数后，当p/n≥2.1时即可判定为阳性。对阳性细胞孔换液后再检测2次，确认为阳性。阳性孔上清使用无关蛋白包被的elisa板进行无关蛋白筛选，与免疫原蛋白发生反应且与无关蛋白反应呈阴性的细胞团可进行亚克隆操作。
[0092]
亚克隆方法：当单个细胞团长至整个细胞孔的1/4至1/2时，将选定的阳性单克隆细胞吹散，用hat营养液稀释细胞至10个/ml，每孔加入100μl，每次亚克隆结束后单个细胞团长到细胞孔1/4时吸取上清进行检测。每次亚克隆均挑选只长有单个细胞团的阳性孔，当所有亚克隆的细胞团均为阳性时，可对其进行扩大培养，每隔5代冻存一批。
[0093]
1.11单抗初步鉴定
[0094]
1.11.1单抗的western-blot特异性分析
[0095]
取40μl纯化的rtapxiv蛋白与10μl 5
×
loading buffer混匀后煮样。用 12.5％凝胶进行sds-page，电泳结束后采用半干法转印，用5％脱脂乳对膜进行封闭，2h后使用pbst洗膜；洗涤后将膜剪开，分别用1d7单抗上清和 sp2/0上清孵育，放置4℃冰箱中过夜；pbst洗涤过后加入hrp标记的羊抗鼠igg二抗室温慢摇45min后洗涤，进行曝光。
[0096]
1.11.2单抗稳定性分析
[0097]
对1d7单抗进行稳定性分析，应用间接elisa方法测定前15代的单抗上清效价。
[0098]
1.11.3单抗亚型鉴定分析
[0099]
根据proteintech kmia-2试剂盒说明进行实验。
[0100]
1.11.4相加实验方法的单抗抗原结合位点分析
[0101]
采用1983年frigue等报告的叠加elisa方法鉴定多株单抗是否针对同一抗原表位。使用rtapxiv蛋白包被的elisa板，一抗为两种不同的mcab 各50μl，间接elisa方法同上述1.9.2，最后显色终止使用酶标仪读数od
450nm
， ai＝[2a1 2/(a1 a2)-1]
×
100％用于计算叠加率：ai代表叠加率，a1 2为加入两种单抗的酶标孔od
450nm
数值，a1和a2表示只加入一种单抗的酶标孔 od
450nm
值。判定几株单抗是否针对同一抗原表位的方法是计算得到的ai值是否大于50％。
[0102]
1.12单抗腹水的制备及酶标纯化
[0103]
1.12.1制备腹水
[0104]
取高压后的液体石蜡0.5ml通过腹腔注射的途径注射8周龄的balb/c 雌性小鼠。
一周后注射约3.0
×
106～5.0
×
106个杂交瘤细胞，待小鼠腹腔明显膨大时，收集腹水并将其进行分装置于-80℃冰箱保存备用。将腹水10倍倍比梯度稀释后，采用间接elisa方法检测腹水效价，操作同上述1.9.2所述。
[0105]
1.12.2腹水的纯化及hrp标记
[0106]
将采集的腹水送金斯瑞生物科技有限公司进行纯化和hrp标记，将纯化好的腹水进行sds-page，考马斯亮蓝染色鉴定。
[0107]
2结果
[0108]
2.1重组质粒pcoldi-tapxiv的鉴定
[0109]
2.1.1重组质粒pcoldi-tapxiv的pcr鉴定
[0110]
pcr扩增结果如图1所示，出现大小为1500bp左右的条带，符合预期。
[0111]
2.1.2重组质粒pcoldi-tapxiv的双酶切鉴定
[0112]
重组质粒pcoldi-tapxiv经xho i和hind iii双酶切，得到约1500bp的目的基因片段和约4400bp的pcoldi片段，如图2所示，测序正确，表明重组表达质粒pcoldi-tapxiv构建成功。
[0113]
2.2重组蛋白tapxiv的sds-page鉴定
[0114]
将pcoldi-tapxiv转化至rosetta(de3)诱导表达，进行sds-page分析，在54kda大小左右的位置出现目的条带，符合预期。将诱导后的细菌洗涤后超声波破碎裂，收集上清和沉淀，经sds-page及染色分析， rosetta/pcoldi-tapxiv在上清中有表达，如图3所示。
[0115]
2.3rtapxiv蛋白的western blot鉴定及免疫反应性分析
[0116]
rtapxiv蛋白经sds-page，以小鼠抗6
×
his组氨酸igg为一抗，hrp
‑ꢀ
羊抗鼠igg为二抗，进行westernblot鉴定，在约54kda位置处出现抗原抗体结合带(如图4中的a所示)。同时，以临床app阳性猪血清作为一抗，以 spa为二抗进行westernblot鉴定，rtapxiv蛋白可与app天然抗体特异性结合(如图4中的b所示)。
[0117]
2.4重组蛋白的纯化
[0118]
使用ni-nta亲和层析纯化，在20mmol/l咪唑结合缓冲液、60mmol/l 咪唑洗涤缓冲液的条件下能够较好纯化rtapxiv(如图5所示)。
[0119]
2.5细胞融合、阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆结果
[0120]
细胞融合率为93.58(539/576)，经过3次亚克隆得到15株单抗，分别命名为1e3、1d7、1g6、3h7、3f8、4c5、4d9、4a11、5d2、5h2、5e3、 5g7、6c3、6d4、6h8，扩大培养至细胞瓶后第一代上清效价分别为1:100、 1:3200、1:100、1:3200、1:100、1:200、1:100、1:400、1:200、1:200、1:100、1:400、1:100、1:1600、1:100。
[0121]
2.6单抗1d7上清的westernblot特异性分析
[0122]
单抗1d7上清可与rtapxiv蛋白发生特异性反应，不与rosetta反应(如图6 中的a所示)，同时阴性对照sp2/0上清与重组蛋白不发生特异性反应(如图6中的b所示)。
[0123]
2.7单抗1d7免疫球蛋白亚型鉴定分析
[0124]
使用proteintech
tm kmia-2mouse单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行单抗的亚型鉴定，结果表明单抗1d7属igg2b、轻链为κ链见下表5；
[0125]
表5单抗亚型检测
[0126][0127]
2.8单抗1d7稳定性分析
[0128]
对单抗1d7进行扩大培养和传代，选取第1、5、10和15代单抗使用间接elisa方法测定上清抗体效价，单抗1d7效价保持不变，稳定性良好，见下表6；
[0129]
表6不同代次1d7单抗细胞培养上清效价
[0130][0131]
2.9十五株单抗抗原表位针对性分析
[0132]
计算15株单抗通过叠加elisa得到的ai值，均小于50％，可得15株单抗针对同一抗原表位；
[0133]
2.10腹水效价检测及酶标纯化结果
[0134]
使用浓度为1μg/ml的rtapxiv蛋白包被检测板，通过间接elisa方法检测，纯化后抗体的效价》1：512000，纯化效果良好(如图7所示)。
[0135]
apxiv只在动物体内表达且仅由app产生，根据这一特点建立的 apxiv-elisa可有效区分app疫苗接种猪与野毒感染猪，并能与副猪嗜血杆菌等呼吸道病原进行鉴别诊断。因此，以apxiv为免疫原，制备单克隆抗体，用于阻断elisa方法的建立，可以提高血清学诊断的特异性和敏感性。
[0136]
单抗制备首先要有免疫原性良好的蛋白免疫小鼠，apxiv有很好的免疫原性，但是其蛋白分子量大，原核表达易形成包涵体。由于包涵体需要经过繁复的变性溶解和复性折叠过程，导致目的蛋白复性率低、损失量大，而可溶性蛋白表达则可以很好地避免这一问题。因此，本发明实施例在蛋白抗原性和亲疏水性分析的基础上，设计了针对apxiv截短蛋白的基因扩增引物，扩增特异性基因片段，利用大肠杆菌进行原核表达，实现了rtapxiv蛋白的可溶性表达，用其作为免疫原免疫balb/c小鼠，通过细胞融合技术和亚克隆技术得到了针对rtapxiv蛋白的特异性单抗。
[0137]
细胞融合是单抗制备的关键环节，细胞融合使用的sp2/0细胞应采用形态饱满、边界清楚的细胞，如果发现细胞出现皱缩，形状不规则等状况，应更换细胞，以免导致后续细胞融合失败。在细胞融合前三天，对小鼠进行一次冲击免疫，可有效活化脾细胞，有利于提高杂交瘤细胞分泌抗体的能力。 peg4000应注意避光，在加入peg4000前，应用巴氏吸管尽可能的将培养液吸取干净，可有效提高细胞融合率。
[0138]
饲养细胞能够为杂交瘤细胞的生长提供足量的生长因子。腹腔巨噬细胞制备方便，而且可以吞噬清除死亡细胞，故本发明实施例采用腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。
[0139]
筛选杂交瘤细胞应注意避免筛选到假阳性，用间接elisa检测细胞上清效价，应在全部换液后的第二天进行检测，检测3次以确认为阳性，同时，用细胞上清与无关蛋白反应，避免出现与非目的蛋白反应的情况。
[0140]
筛选到的15株单抗，针对相同抗原表位，可能是由于截短表达的蛋白优势抗原表位有限，且该抗原表位优势明显。
[0141]
本发明实施例应用原核表达并纯化的rtapxiv蛋白，免疫balb/c小鼠，通过细胞融合、亚克隆，得到了针对rtapxiv蛋白的特异性单抗。经鉴定，单抗1d7具有良好的特异性和稳定性，该单抗的制备成功为建立rtapxiv阻断 elisa检测方法以及后续开发试剂盒奠定基础。
[0142]
实施例2胸膜肺炎放线杆菌apxiv截短蛋白阻断elisa检测方法的建立
[0143]
1材料和方法
[0144]
1.1主要实验试剂及耗材
[0145]
酶标板购于nest公司；tmb购于上海碧云天公司；液体石蜡，其它化学试剂为国产分析纯。
[0146]
1.2抗原蛋白与阴阳性血清的准备
[0147]
1.2.1抗原蛋白的准备
[0148]
参照实施例1中的1.5和1.7诱导表达并纯化rtapxiv蛋白。
[0149]
1.2.2标准阳性血清的制备
[0150]
取临床猪血清，用pbst 100倍稀释后加入包被2μg/ml rtapxiv蛋白的 elisa板条，进行间接elisa，酶标仪测定od
450nm
值，》2.0作为标准阳性血清，《0.2作为标准阴性血清，并以猪血清为一抗，hrp-spa为二抗进行 western blot验证。
[0151]
1.3酶标单抗的准备
[0152]
用单抗1d7制备腹水后进行纯化及hrp标记，参照实施例1中的1.12。
[0153]
1.4阻断elisa术式
[0154]
(1)包被：通过抗原包被液即碳酸盐缓冲液(ph：9.6)稀释纯化的rtapxiv 蛋白至一定浓度后，以100μl/孔的剂量加入酶标板，4包被过夜；
[0155]
(2)洗涤：用pbst洗涤酶标板，5min/次，洗涤三次后甩干板内残余液体；
[0156]
(3)封闭：加入200μl/孔含5％脱脂乳的pbst，37封闭3h；
[0157]
(4)洗涤同上，加入100μl/孔用pbst稀释至一定浓度的待检血清，37孵育2h；
[0158]
(5)洗涤后，将100μl按一定比例稀释过的酶标单抗加入酶标孔内，37孵育1h；
[0159]
(6)显色：避光操作，每孔加入100μltmb显色液，置于37 10min；
[0160]
(7)终止：显色完后迅速加入50μl 2m h2so4终止反应进行，立刻使用酶标仪进行读数(od
450nm
)。
[0161]
阻断率计算公式如下：阻断率＝(阴性血清od
450nm
值-被检血清od
450nm
值)/阴性血清od
450nm
值
×
100％。
[0162]
1.5阻断elisa最佳反应条件
[0163]
1.5.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的选择
[0164]
以2μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml四组浓度包被的板条，每组板条检测梯度稀释的阴、阳性血清样品(血清稀释度分别为1:1、1:5、1:10、 1:50、1:100)，被检血清的
每个稀释度做2个重复孔，其他步骤按阻断elisa 术式进行操作，最后根据od
450nm
值计算阻断率。阻断率最高对应的点，为最佳抗原包被浓度和血清稀释度。
[0165]
1.5.2封闭液的选择
[0166]
本实验分为五组，以封闭液种类为单一变量，分别为5％脱脂乳、2％明胶、2％bsa、1％bsa、0.5％bsa。将1.5.1中筛选的最佳抗原包被浓度和血清稀释度应用至本实验，其他步骤依照阻断elisa术式进行，每组使用一份阴性和三份阳性血清进行检测，每孔做三个重复。计算阻断率的平均值后筛选出pi值最大时使用的封闭液。
[0167]
1.5.3封闭时间的选择
[0168]
将本实验分为三组，以封闭时间为单一变量，分别为3h、2h、1h，其他步骤依据阻断elisa术式操作，每组使用一份阴性和三份阳性血清进行检测，每孔重复三次。计算阻断血清的平均阻断率，pi值最大时为最佳封闭时间。
[0169]
1.5.4血清最佳作用时间的选择
[0170]
应用上述优化后的反应条件，将本实验分为四组，以血清作用时间为单一变量，分别为2h、1.5h、1h、0.5h。每组使用一份阴性和三份阳性血清进行阻断elisa检测，每孔重复三次，计算阻断率的平均值。pi值最大时为血清最佳作用时间。
[0171]
1.5.5酶标单抗最佳稀释度浓度的选择
[0172]
应用上述实验优化后的反应条件，将本实验分为四组，以酶标单抗稀释度为单一变量，分别为1:2000、1:1500、1:1000、1:500。每个稀释度组使用一份阴性和三份阳性血清进行阻断elisa检测，每孔做三次重复，计算pi值，筛选出pi值最大时使用的酶标单抗稀释度。
[0173]
1.5.6酶标单抗最佳反应时间的选择
[0174]
将本实验分为四组，以酶标单抗作用为单一变量，分别为2h、1.5h、1h、 0.5h，每组使用一份阴性和三份阳性血清进行阻断elisa检测，每孔重复三次，计算阻断率的平均值。筛选出pi值最大时使用的单抗作用时间。
[0175]
1.5.7底物最佳反应时间的选择
[0176]
将本实验分为四组，以底物显色时间为单一变量，分别为20min、15min、 10min、5min。每个显色时间使用一份阴性和三份阳性血清进行阻断elisa 检测，每孔做三次重复，计算血清的平均pi值，确定最佳底物显色时间。
[0177]
1.5.8阻断elisa的临界值
[0178]
选用50份app阴性血清，经优化的阻断elisa程序进行检测并统计阻断率(pi)、统计平均值(x)、标准差(sd)，pi值≥x 3sd认定是阳性；当pi值＜x 2sd认定是阴性；pi值在两者之间判定结果可疑。
[0179]
1.6阻断elisa的可重复性
[0180]
1.6.1批内重复实验
[0181]
取同一批次制备的rtapxiv蛋白按照抗原最佳包被浓度包被elisa板，其他步骤同优化后的阻断elisa程序。选用app阳性、弱阳性和阴性血清，每份血清5个重复，计算变异系数。
[0182]
1.6.2批间重复实验
[0183]
取5批纯化的rtapxiv蛋白按照抗原最佳包被浓度包被elisa板，其他步骤同优化
后的阻断elisa程序。选用app阳性、弱阳性和阴性血清，每份血清，每批蛋白3个重复，计算变异系数。
[0184]
1.7阻断elisa的敏感性
[0185]
取临床筛选的50份app阳性猪血清，利用已建立的阻断elisa检测方法测定样品中app阴性、阳性血清个数，判定方法敏感性。
[0186]
1.8阻断elisa的特异性
[0187]
以最佳包被浓度包被重组蛋白，取实验室保存的大肠杆菌、波氏杆菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、链球菌、猪瘟病毒、伪狂犬病毒阳性猪血清，利用阻断elisa检测方法检测其阴、阳性，判定方法特异性。
[0188]
1.9阻断elisa对临床部分样品的检测
[0189]
选取临床85份血清，应用建立的rtapxiv阻断elisa抗体检测方法对样本进行检测，并计算阳性检出率。
[0190]
2结果
[0191]
2.1rtapxiv蛋白的纯化
[0192]
rtapxiv纯化的sds-page分析见实施例1的图5。
[0193]
2.2单抗1d7的纯化及酶标
[0194]
单抗1d7制备腹水纯化后的sds-page分析见实施例1的图7。
[0195]
2.3阴阳性血清的westernblot分析
[0196]
分别将经elisa筛选得到的阴性和阳性血清作为一抗，hrp-spa为二抗，进行westernblot实验，表明筛选得到的阴性血清不与rtapxiv反应(图8第 1泳道)，筛选得到的阳性血清可以与rtapxiv反应(图8第2泳道)。
[0197]
2.4探索阻断elisa最佳反应条件的结果
[0198]
由表7可知，当rtapxiv蛋白以0.25μg/ml包被elisa检测板，待检样品稀释度为1:1时，pi值最大。由表8至表13结果可得，rtapxiv建立阻断 elisa检测方法的优化方案为：5％脱脂乳作为封闭液，37封闭3h；血清37 作用2h；1:2000稀释的酶标单抗孵育0.5h；tmb避光显色10min。
[0199]
表7抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的选择
[0200][0201]
表8封闭液的选择
[0202]
[0203]
表9封闭时间的选择
[0204][0205]
表10血清最佳作用时间的选择
[0206][0207]
表11酶标单抗最佳稀释度浓度的选择
[0208][0209]
表12酶标单抗最佳反应时间的选择
[0210][0211]
表13底物最佳反应时间的选择
[0212][0213]
2.5阻断elisa临界值
[0214]
对临床50份已确定为阴性的血清进行检测，结果见表14，根据公式计算得到pi≤16.04％(x 2sd)的样本被视为阴性，pi≥19.37％(x 3sd)的样本被视为阳性。
[0215]
表14阻断elisa临界值的确定
[0216][0217]
2.6阻断elisa的可重复性
[0218]
由表15、16可知，批间、批内重复变异系数＜10％，重复性均良好。
[0219]
2.6.1批内重复实验
[0220]
表15阻断elisa的批内重复实验结果
[0221][0222]
2.6.2批间重复实验
[0223]
表16阻断elisa的批间重复实验结果
[0224][0225]
2.7阻断elisa敏感性
[0226]
利用rtapxiv ielisa方法在临床上筛选50份阳性血清，经阻断elisa 检测其阴、阳性，有2份血清显示阴性，本方法相对敏感性为96％。
[0227]
2.8阻断elisa的特异性
[0228]
在确定阻断elisa的临界值后，通过检测猪其它细菌、病毒抗体的反应性来评价阻断elisa的特异性。如表17所示均为阴性，该方法特异性良好。
[0229]
检测50份取自临床阴性的猪血清样本，阻断elisa检测方法检测均为阴性，本方法相对特异性为100％。
[0230]
表17阻断elisa的交叉反应实验结果
[0231][0232]
2.9阻断elisa对临床部分样品的检测
[0233]
共检测临床血清85份，阳性62份，阳性检出率为73％，该方法可用于临床检测。
[0234]
市场上在售的app-elisa检测试剂盒中，国外的试剂盒价格昂贵，国内的试剂盒采用的是间接elisa检测方法，特异性较差。本发明实施例利用 apxiv特异性单克隆抗体建立了高效、灵敏的阻断elisa方法。
[0235]
本发明实施例建立了以rtapxiv蛋白作为包被抗原，hrp-1d7单抗作为检测抗体的
阻断elisa方法。确定本方法的判定标准，验证了敏感性和特异性，并证明该方法可用于临床检测。
[0236]
本发明的阻断elisa方法，重复性良好，相对敏感性达96％，相对特异性达100％，临床试验阳性检出率达73％，可用于临床检测。
[0237]
本发明的阻断elisa试剂盒，使用辣根过氧化物酶标记的胸膜肺炎放线杆菌apxiv蛋白单克隆抗体作为阻断抗体，由于单克隆抗体具有非常良好的特异性，该试剂盒比以apxiv蛋白作为包被抗原建立的间接elisa方法具有更好的特异性。
[0238]
本发明的试剂盒用于检测胸膜肺炎放线杆菌，具有高效、灵敏特异性和重复性均良好的优点，适合于在临床应用中进行推广，为胸膜肺炎放线杆菌的快速检测提供可靠的技术手段。
[0239]
虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。