非洲猪瘟病毒A137R基因的实时荧光PCR引物、检测试剂盒及应用的制作方法

非洲猪瘟病毒a137r基因的实时荧光pcr引物、检测试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒a137r基因荧光 pcr引物、检测试剂盒及应用。


背景技术：

2.非洲猪瘟(asf)是由非洲猪瘟病毒(asfv)引起的一种急性、烈性、高度接触性动物传染病，世界动物卫生组织(oie)把asf列为法定报告的动物疫病，我国也将其列为重点防范的一类动物疫情。该病发病过程短，感染范围广，发病率和死亡率可高达100％，对生猪产业危害巨大，严重影响了我国养猪业的发展和国际民生，目前尚无有效的方法控制非洲猪瘟，检测和清除感染动物是控制和根除asf的唯一方法。
3.asfv的a137r基因可编码p11.5蛋白，是asfv重要的结构蛋白。有研究表明，在感染asfv的三种易感细胞系中p11.5蛋白高丰度表达，表明其在病毒复制周期中具有重要作用。荧光定量pcr方法与传统的定量技术(如半定量pcr、竞争定量pcr等)相比，具有重复性好、特意灵敏、定量准确、操作简便，以及对样品污染小和自动化程度高等优点。目前已报道的荧光定量方法主要是针对非洲猪瘟病毒vp72、p54和k205r基因设计而成，然而最近有研究表明oie推荐的常规pcr敏感性和特异性降低，推测可能是由于引物和病毒靶基因之间的核苷酸不匹配导致的。
4.因此，亟待建立一种新的asfv荧光定量pcr检测试剂产品和方法，使得该检测试剂产品和方法能够实现对目前流行的asfv毒株进行可靠的检测。而用于检测非洲猪瘟病毒a137r基因的荧光检测试剂产品及其使用方法，还未见报道。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了引物对。
6.本发明还要解决的技术问题是提供了检测非洲猪瘟病毒的试剂盒。
7.本发明最后要解决的技术问题是一种非诊断目的的基于asfv p11.5蛋白的编码基因a137r的实时荧光定量pcr检测方法。
8.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供了一种asfv荧光定量pcr检测的引物对，扩增目标长度为116bp，所述引物对的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示。具体如下：
9.正向引物：p11.5-f：5
’‑
cttaccaaactcgaccaggagg-3’；(seq id no.1)
10.反向引物：p11.5-r：5
’‑
gtgcatcgttcctcagggatt-3’；(seq id no.2)
11.进一步地，提供一种asfv pcr扩增引物对，用于asfv p11.5蛋白的编码基因a137r全长的扩增，扩增目标产物的长度为414bp，所述目标产物序列如 seq id no.9所示，所述引物对的核苷酸序列如seq id no.3-seq id no.4所示。具体如下：
12.正向引物：p11.5-f2：5
’‑
atggaagcagttcttaccaaactcg-3’；(seq id no.3)
13.反向引物：p11.5-r2：5
’‑
ttagccttctttgatattcatcttgcc-3’；(seqidno.4)
14.本发明的第二方面，提供上述引物对在制备检测非洲猪瘟病毒的试剂盒中的应用。
15.本发明的第三方面，提供一种荧光定量pcr检测的试剂盒，所述荧光定量pcr检测的试剂盒含有上述的引物对。
16.进一步地，所述荧光定量pcr检测试剂盒中还包括：荧光定量pcr反应试剂，标准品和对照品。
17.其中，所述荧光定量pcr反应试剂包括sybr-green荧光染料和rnasefreedh2o。
18.其中，所述标准品由如下方法制备而成：以非洲猪瘟病毒的dna为模板，运用seqidno.3和seqidno.4所示的引物进行pcr扩增，得到扩增产物，扩增产物的长度为414bp，所述目标产物序列如seqidno.9所示，将扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收纯化，纯化后的扩增产物与pgem-t载体连接，转化至dh5α感受态细胞，筛选阳性克隆并提取质粒dna，即制备得到标准品。
19.其中，所述对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有asfvdna的dna样品，阴性对照为无asfvdna的dna样品。
20.本发明的第四方面，提供上述荧光定量pcr检测试剂盒在如下(1)-(3)中任意一种中的应用：
21.(1)对非洲猪瘟病毒进行流行病学调查；
22.(2)对血液或血清制品中的非洲猪瘟病毒污染进行监控；
23.(3)精确检测非洲猪瘟病毒拷贝数，明确非洲猪瘟病毒的感染进程。
24.本发明的第五方面，本发明提供了一种非诊断目的的利用上述荧光定量pcr试剂盒检测非洲猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：
25.(1)将标准品进行梯度稀释，之后进行荧光定量pcr反应，根据标准品的浓度和ct值，绘制荧光定量标准曲线；
26.(2)提取待测样品基因组dna，进行荧光定量pcr反应，收集待测样品荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到ct值及扩增曲线，对待测样品进行定性和定量检测，具体判定方法：若待测样品荧光信号超过阈值且ct≤35.0判为阳性，否则判为阴性。
27.优选的，步骤(1)和步骤(2)中，荧光定量pcr反应的程序为：95℃预变性30sec，95℃5sec，60℃30sec，40个循环。
28.有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
29.(1)针对非洲猪瘟病毒，本发明设计了可以对该病毒进行检测的荧光定量pcr试剂盒，该试剂盒的特异性强，只与非洲猪瘟病毒特异性结合，与其他常见的猪源病毒，如猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪轮状病毒(porv)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪圆环病毒2型(pcv2)以及猪瘟病毒(csfv)等都没有交叉反应。
30.(2)本发明的检测的灵敏度，在标准品为1
×
101～1
×
108拷贝范围内都有极好的线性关系，可以高效检测非洲猪瘟病毒病猪组织以及无临床症状的病毒携带猪，提高了检测效率。
31.(3)采用本发明的试剂盒能够对非洲猪瘟病毒感染进行监测，以便及早发现感染猪群对其采取隔离或扑杀措施，以减少非洲猪瘟病毒感染所带来的损失；还可以对非洲猪
瘟病毒进行流行病学调查，以及对血液或血清制品中的非洲猪瘟病毒污染进行监控。
附图说明
32.图1为实时荧光定量pcr标准品的扩增曲线。
33.图2为实时荧光定量pcr标准曲线。
34.图3为实时荧光定量pcr方法的特异性试验。
具体实施方式
35.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
36.对于荧光定量pcr检测而言，如何设计引物序列是保证检测有效性的关键。虽然现有技术中有诸多引物设计的软件和引物设计原则等，但要设计得到特异性强、灵敏度高的引物，并非是通过引物设计软件就可以简单获得的，这需要技术人员利用其专业知识不断的选择优化靶标区域，再根据优化的靶标区域进行引物设计，以及对设计的引物进行反复的筛选、优化、再设计。本发明在试验过程中对进行引物设计的靶标区域进行了优化，以该非洲猪瘟病毒的a137r基因的序列保守区进行引物设计，可以实现对该病毒的特异性检测。本发明的非洲猪瘟病毒来自中国农业科学院长春兽医研究所动物生物安全三级实验室。
37.本发明在设计过程中进一步充分考虑了普通pcr以及荧光定量pcr的反应条件，避免引物之间的相互干扰，最终设计了本技术引物。其中，荧光定量pcr检测引物：
38.正向引物：p11.5-f：5
’‑
cttaccaaactcgaccaggagg-3’；(seqidno.1)
39.反向引物：p11.5-r：5
’‑
gtgcatcgttcctcagggatt-3’；(seqidno.2)
40.另外，普通pcr扩增引物：
41.正向引物：p11.5-f2：5
’‑
atggaagcagttcttaccaaactcg-3’；(seqidno.3)
42.反向引物：p11.5-r2：5
’‑
ttagccttctttgatattcatcttgcc-3’；(seqidno.4)
43.本发明在试验过程中，还通过非洲猪瘟病毒a137r基因的其它保守区序列以及其他的引物设计原则设计了多组不同的引物对，经反应后分别检测其特异性和扩增效率，以筛选最优的可用于临床检测的引物。例如：
44.第一组：
45.正向引物：f：5
’‑
tgaaatccctgaggaacgatgcac-3’；(seqidno.5)
46.反向引物：r：5
’‑
aacttcatgccaggcggtgtg-3’；(seqidno.6)
47.第二组：
48.正向引物：f：5
’‑
catttcgggacatcgagtgg-3’；(seqidno.7)
49.反向引物：r：5
’‑
atcttgccgatgagatttccct-3’；(seqidno.8)
50.结果发现，以采用本发明的引物(seqidno.1和seqidno.2)对该非洲猪瘟病毒进行检测的特异性和灵敏度最优。而其他的引物对(seqidno.5、6、7、8)则不能对非洲猪瘟病毒和其它猪源病毒进行有效的区分，容易出现假阳性或假阴性，如上述第一组引物(seqidno.5、6)在检测猪轮状病毒(porv)时出现了扩增曲线，第二组引物(seqidno.7、8)的溶解曲线有杂峰，产物非特异。所以选择seqidno.1和seqidno.2作为本试剂盒的
检测引物。
51.本发明在试验过程中还优化了荧光定量条件，在试剂盒的临床应用中最大限度减少操作，既保证灵敏度，又最大限度降低各种污染，确保结果的科学、精确。
52.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
53.本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；d.l斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。
54.实施例1：实时荧光定量pcr引物的设计
55.针对asfv p11.5蛋白的编码基因a137r的序列保守区设计特异性的引物序列，序列设计如下：
56.正向引物：p11.5-f：5
’‑
cttaccaaactcgaccaggagg-3’；(seq id no.1)
57.反向引物：p11.5-r：5
’‑
gtgcatcgttcctcagggatt-3’；(seq id no.2)
58.实施例2：荧光定量pcr检测方法的建立
59.(1)病毒基因组dna的提取：
60.采用商品化试剂盒提取待测样品基因组dna。
61.(2)荧光定量pcr反应体系建立：
62.所用荧光定量试剂盒采用来自takara公司的货号为rr820a的tb premix ex taq
tm ii试剂，在200μl荧光反应管中依次加入tb green premix ex taqii 10μl，pcr forward primer(10μm)0.8μl，pcr reverse primer(10μm)0.8μl，步骤(1)中提取的待测样品基因组dna 2μl，使用rnase free dh2o补充至20μl 体系。置于light96(roche diagnostics)荧光定量pcr仪中进行反应，反应条件为95℃预变性30sec，95℃5sec，60℃30sec，40个循环。
63.(3)标准曲线的制备：
64.为了准确定量样本中病毒的拷贝数，制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线。首先设计a137r基因的正向和反向引物(seq id no.3-seqid no.4所示)，扩增非洲猪瘟病毒基因组得到414bp的扩增产物(seq id no.9 所示)，按照经典的分子克隆操作方法，将其连接到pgem-t载体上，命名为 p11.5-t，筛选阳性克隆并提取质粒dna，利用分光光度计测量质粒浓度，即为标准品。对标准品进行10倍梯度稀释，之后进行荧光定量pcr反应，根据标准品的浓度和ct值，绘制荧光定量标准曲线；具体为：y＝-3.276x 37.08，相关系数r2＝0.9987，呈现良好的线性关系；其中，x代表样品的拷贝数对数，y代表 ct值。
65.(4)检测结果的判定：
66.根据荧光定量pcr反应收集荧光信号，再利用仪器软件处理数据，得到扩增曲线、ct值。以标准品最低浓度对应的ct值及扩增曲线作为判定依据。
67.结果判定方法：若待测样品荧光信号超过阈值且ct≤35.0，同时扩增曲线为平滑的“s”型，则可以判定待测样品中含有非洲猪瘟病毒。
68.根据荧光定量标准曲线，可以对样品中非洲猪瘟病毒进行定量测定。
69.实施例3：试剂盒的组成、实验参数的优化及特异性、灵敏性和重复性考察
70.1.试剂盒的组成：
71.本实施例的试剂盒为荧光定量试剂盒，用于检测非洲猪瘟病毒。试剂盒中含有：实施例1设计的seq id no.1所示的正向引物(10μm)，实施例1设计的 seq id no.2所示的反向引物(10μm)，荧光定量pcr反应试剂，标准品和对照品。
72.标准品由如下方法制备而成：
73.采用seq id no.3和seq id no.4所示的引物扩增非洲猪瘟病毒的基因组，得到的414bp的扩增产物(seq id no.9)，将扩增产物连接到pgem-t载体上，筛选阳性克隆并提取质粒dna，即制备得到标准品。
74.荧光定量pcr反应试剂包括：sybr-green荧光染料和rnase free dh2o。
75.对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有asfv dna的dna 样品，阴性对照为无asfv dna的dna样品。
76.2.实验参数的优化
77.对试剂盒中的引物(seq id no.1和seq id no.2)的荧光定量pcr反应条件进行了优化探索，引物终浓度分别采用0.2μm、0.4μm、0.6μm和0.8μm进行扩增，结果显示，引物终浓度为0.4μm时扩增效率最高，最接近100％，故选择0.4μm为最佳引物终浓度。退火温度分别采用58℃、60℃和62℃进行扩增，结果显示，退火温度为60℃特异性最好，故选择60℃为最佳退火温度。最终反应条件为95℃预变性30sec，95℃ 5sec，60℃ 30sec，40个循环，试剂盒敏感性、检测效果最好。
78.3.试剂盒的特异性、灵敏性和重复性考察
79.(1)特异性试验
80.应用该试剂盒，进行该试剂盒的特异性试验，分别以猪流行性腹泻病毒 (pedv)、猪轮状病毒(porv)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、猪瘟病毒(csfv)、本发明所检测的非洲病毒以及无asfv dna的dna样品为模板，采用该试剂盒进行荧光定量，结果发现猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪轮状病毒(porv)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、猪瘟病毒(csfv)以及无asfv dna的dna样品均不能有效扩增；只有非洲猪瘟病毒能够有效扩增。
81.以上试验结果表明，本发明试剂盒的特异性为100％，具有较强的特异性，试剂盒中引物与非洲猪瘟病毒特异性结合，与其他猪源病毒都没有交叉反应。
82.(2)重复性试验
83.应用该试剂盒，进行该试剂盒的重复性试验。取1
×
101～1
×
108copies/μl 8 个稀释度的质粒标准品进行批内与批间重复试验，每次取3个重复样本，批内与批间重复试验的变异系数(cv)均小于1％，说明其具有极高的重复性。
84.(3)灵敏性试验
85.将标准品稀释成不同浓度，采用该试剂盒进行检测，同时以普通pcr检测作为对比。结果发现，本发明的试剂盒能够检测10个拷贝数的标准品，而且在 101～108拷贝范围内都有极好的线性关系。而普通pcr最低只能检测到104个拷贝数的标准品。表明该试剂盒进行荧光定量pcr的灵敏度是普通pcr的至少 1000倍，具有较高的灵敏度。
86.实施例4：本发明试剂盒的临床应用实验
87.从待检猪的60份棉拭子样本，提取病毒基因组dna(中国农业科学院长春兽医研究所动物生物安全三级实验室)，用实施例2建立的荧光定量pcr方法进行检测并分析结果。
88.结果判定方法：若待测样品荧光信号超过阈值且ct≤35.0，同时扩增曲线为平滑的“s”型，则可以判定待测样品中含有非洲猪瘟病毒。
89.同时与oie推荐的针对p72基因的荧光定量pcr方法进行比较。
90.结果表明，使用本发明中的试剂盒60份样本中有35份样本含有非洲猪瘟病毒，阳性率为58％。而使用oie推荐的针对p72基因的荧光定量pcr方法进行检测60份样本中有33份样本含有非洲猪瘟病毒，阳性率为50％，其中两份阴性样本使用本发明pcr检测ct值分别为33.21和30.70，结果为阳性，并通过测序分析确定该样本为阳性。使用本发明中的试剂盒检测结果的准确度比oie推荐的针对p72基因的荧光定量pcr方法高出6％，表明了本发明pcr方法更可靠，适用于临床使用。