使用改进的氧化方案制备寡核苷酸的方法与流程

使用改进的氧化方案制备寡核苷酸的方法
1.本发明涉及一种生产混合的p＝o/p＝s主链寡核苷酸的新方法，包括根据方案将式i的中间体亚磷酸三酯化合物氧化成式ii的磷酸二酯化合物
[0002][0003]
其中氧化遵循特定的氧化方案。
[0004]
寡核苷酸合成在原理上是将核苷酸残基逐步添加到生长链的5'-末端，直到组装出所需的序列。
[0005]
通常，每次添加都称为合成循环，且在原理上由化学反应组成
[0006]
a1)将固相支持物上受保护的羟基基团解封，
[0007]
a2)将作为活化亚磷酰胺的第一个核苷与固相支持物上的游离羟基偶联，
[0008]
a3)氧化或硫化相应的p-连接核苷(亚磷酸三酯)以形成相应的磷酸二酯(p＝o)或相应的硫代磷酸酯(p＝s)；
[0009]
a4)任选地，将固相支持物上的任何未反应的羟基封端；
[0010]
a5)使附着在固相支持物上的第一个核苷的5'羟基解封；
[0011]
a6)将作为活化的亚磷酰胺的第二个核苷偶联以形成相应的p-连接的二聚体；
[0012]
a7)氧化或硫化相应的p-连接的二核苷酸(亚磷酸三酯)以形成相应的磷酸二酯(p＝o)或相应的硫代磷酸酯(p＝s)；
[0013]
a8)任选地，将任何未反应的5'羟基封端；
[0014]
a9)重复前面的步骤a5到a8，直到组装出所需的序列。
[0015]
寡核苷酸合成的原理在本领域中是众所周知的(参见例如寡核苷酸合成；维基百科，免费百科全书；https://en.wikipedia.org/wiki/oligonucleotide synthesis，2016年3月15日)。
[0016]
氧化步骤通常用包含碘、有机溶剂(通常是吡啶)和水的氧化溶液进行。
[0017]
然而，观察到当应用新制备的氧化溶液时，不仅发生了所需的式i的中间体亚磷酸三酯化合物氧化成式ii的磷酸二酯化合物，而且作为副反应，存在于分子中的硫代磷酸酯核苷酸间键合可能受位于核苷酸间键合处的p＝s到p＝o转化的影响，这导致式ii的化合物中磷酸二酯键合的含量高于预期。
[0018]
因此，本发明的目的是找到一种氧化方案，其允许将式i的亚磷酸三酯化合物选择
性地氧化成式ii的磷酸二酯化合物而不影响硫代磷酸酯核苷酸间键合。
[0019]
已发现，可以通过生产混合的p＝o/p＝s主链寡核苷酸的方法达到本发明的目的，该方法包括使用由碘、有机溶剂和水混合获得的氧化溶液，根据以下方案使式i的中间体亚磷酸三酯化合物氧化成式ii的磷酸二酯化合物，
[0020][0021]
其特征在于氧化溶液已经熟化一个时间段，该时间段足以使式i的亚磷酸三酯化合物选择性地氧化成式ii的磷酸二酯化合物而不氧化硫代磷酸酯核苷酸间键合。
[0022]
在此，阐述以下定义以说明和定义用于描述本发明的各种术语的含义和范围。
[0023]
术语“c
1-6-烷基”表示具有1至6个碳原子且在更具体的实施方案中具有1至4个碳原子的一价直链或支链饱和烃基。典型的例子包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，优选地甲基或乙基。
[0024]
本文中所使用的术语寡核苷酸被定义为技术人员通常将其理解为包含两个或更多个共价连接的核苷酸的分子。为了用作具有治疗价值的寡核苷酸，寡核苷酸通常被合成为长度为10至40个核苷酸，优选地为10至25个核苷酸。
[0025]
寡核苷酸可包括任选地经修饰的dna或rna核苷单体或其组合。
[0026]
如本文所用，任选地修饰是指与等效dna或rna核苷相比，通过引入糖部分或核碱基部分的一种或多种修饰而修饰的核苷。
[0027]
典型的修饰可以是糖部分或锁核酸(lna)中的2'-o-(2-甲氧基乙基)-取代(2'-moe)取代，这是一种修饰的rna核苷酸，其中核糖部分通过连接2'氧和4'碳的额外桥修饰。
[0028]
术语经修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或经修饰的“单元”或经修饰的“单体”互换使用。
[0029]
dna或rna核苷酸通常由将两个核苷酸共价偶联在一起的磷酸二酯(p＝o)或硫代磷酸酯(p＝s)核苷酸间键合连接。
[0030]
根据本发明，至少一个核苷酸间键合必须由硫代磷酸酯(p＝s)组成。因此，在一些寡核苷酸中，所有其他核苷酸间键可以由磷酸二酯(p＝o)组成，或者在其他寡核苷酸中，核苷酸间键的序列不同并且包含磷酸二酯(p＝o)和硫代磷酸酯(p＝s)核苷酸间键合两者。
[0031]
因此，术语混合的p＝o/p＝s主链寡核苷酸是指其中至少一个核苷酸间键合必须由硫代磷酸酯(p＝s)组成的寡核苷酸。
[0032]
核碱基部分可以由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如a、t、g、c或u，其中每一个字母可以任选地包括具有同等功能的经修饰的核碱基。例如，在示例的寡核苷酸中，对于lna核苷，核碱基部分用大写字母a、t、g和
me
c(5-甲基胞嘧啶)描述，对于dna核苷，核碱基
部分用小写字母a、t、g、c和
me
c描述。修饰的核碱基包括但不限于带有保护基团的核碱基，例如叔丁基苯氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、乙酰基、异丁酰基或二甲基甲脒基(dimethylformamidino)(参见维基百科，phosphoramidit-synthese,https://de.wikipedia.org/wiki/phosphoramidit-synthese,2016年3月24日)。
[0033]
优选地，寡核苷酸由任选地修饰的dna或rna核苷单体或其组合组成，长度为10至40，优选10至25个核苷酸。
[0034]
寡核苷酸合成的原理在本领域中是众所周知的(参见例如寡核苷酸合成；维基百科，免费百科全书；https://en.wikipedia.org/wiki/oligonucleotide synthesis，2016年3月15日)。
[0035]
如今，更大规模的寡核苷酸合成是使用计算机控制的合成仪以自动化方式进行的。
[0036]
通常，寡核苷酸合成是一种固相合成，其中正在组装的寡核苷酸通过其3'-末端羟基共价结合至固相支持物材料，并在整个链组装过程中与其保持附接。合适的支持物是市售的大孔聚苯乙烯支持物，如ge healthcare的primer support 5g或kinovate的hl支持物。
[0037]
随后的从树脂上的裂解可以用浓氨水进行。磷酸酯和核苷酸碱基上的保护基团也在此裂解过程中被去除。
[0038]
如上文所述，用于生产混合的p＝o/p＝s主链寡核苷酸的生产方法包括使用由碘、有机溶剂和水混合获得的氧化溶液，根据方案将式i的中间体亚磷酸三酯化合物氧化成式ii的磷酸二酯化合物，
[0039][0040]
其特征在于其特征在于氧化溶液已经熟化一个时间段，该时间段足以使式i的亚磷酸三酯化合物选择性地氧化成式ii的磷酸二酯化合物而不氧化硫代磷酸酯核苷酸间键合。
[0041]
混合的p＝o/p＝s主链寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键合。
[0042]
氧化溶液通常是可以通过混合碘、有机溶剂和水而获得的溶液。
[0043]
有机溶剂可以选自吡啶或选自c
1-6
烷基取代的吡啶，例如二甲基吡啶，但优选地来自吡啶。可以存在另外的有机溶剂，例如四氢呋喃。
[0044]
氧化溶液可商购获得，例如来自sigma aldrich(merck)的氧化剂溶液。可替代地，可以使用市售碘和吡啶制备新鲜溶液。
[0045]
吡啶或c
1-6
烷基取代的吡啶与水的体积比可从1:1至20:1范围内变化，优选地从5:
1至15:1范围内变化，但更优选地9:1。
[0046]
氧化溶液中的碘浓度可以在10mm至100mm的范围内，更优选地在20mm至50mm之间的范围内。
[0047]
熟化的最佳时间很大程度上取决于氧化溶液的熟化温度。低熟化温度会导致较长的熟化时间，而较高的熟化温度会显着缩短熟化时间。
[0048]
已发现，氧化溶液的熟化可在20℃至100℃的温度发生，但优选地在30℃至60℃的温度发生。
[0049]
氧化溶液熟化所需的时间段必须足以将式i的亚磷酸三酯化合物选择性地氧化为式ii的磷酸二酯化合物，而不氧化硫代磷酸酯核苷酸间键合。
[0050]
通常，氧化溶液可以熟化的时间段为至少1天、3天、5天、10天、15天或至少20天。
[0051]
如上所述，时间段可能会因熟化温度而有很大差异，并且对于30℃至35℃的熟化温度，可在10天到150天之间变化，更典型地在20天到60天之间变化，而对于60℃至65℃的熟化温度，可在1天到30天之间变化，通常在2到15天之间变化。
[0052]
熟化通常伴随着电导率(μs/cm)的增加和ph的降低。在本发明的另一个实施方案中，本发明的方法包括监测参数ph和电导率，以确定该时间段是否足以使式i的亚磷酸三酯化合物选择性地氧化成式ii的磷酸二酯化合物而不氧化硫代磷酸酯核苷酸间键合。
[0053]
用于氧化反应的氧化剂的量可以在1.1当量和15当量之间，更优选地在1.5当量和4.5当量之间，最优选地在2当量和4当量之间选择。
[0054]
通常，氧化反应温度在15℃和27℃之间，更优选地在18℃和24℃之间进行。
[0055]
通过举例说明，寡核苷酸可以选自：
[0056]5′‑
mecs meuo mecoaogs
t
sasas mecsas
tst
sgsas mecsao meco mecoas me
c-3
′
[0057]
下划线的残基是2'-moe核苷。硫代磷酸酯和磷酸二酯键合的位置分别用s和o表示。应该注意的是，2'-o-(2-甲氧基乙基)-5-甲基尿苷(2'-moe meu)核苷有时被称为2'-o-(2-甲氧基乙基)核苷(2'-moe t).
[0058]
本文公开的化合物具有以下核碱基序列
[0059]
seq id no.1:cucagtaacattgacaccac
[0060]
实例
[0061]
实例1
[0062]5′‑
mecs meuo mecoaogs
t
sasas mecs astst
sgsas mecsao meco mecoas me
c-3
′
的合成
[0063]
通过标准亚磷酰胺化学法，使用akta oligopilot 100和primer support unylinker(nittophase lh unylinker 330)以2.20mmol的规模在固相上生产寡核苷酸。通常使用1.4当量的dna/2'-moe-亚磷酰胺。其他试剂(二氯乙酸、1-甲基咪唑、4,5-二氰基咪唑、乙酸酐、苯乙酰二硫化物、吡啶、三乙胺)以从市售来源的原样使用，并制备适当浓度的试剂溶液(见下表1)，并使用氢氧化铵实现裂解和脱保护得到粗制寡核苷酸。
[0064]
表1：
[0065]
标准试剂溶液
[0066][0067]
实例2
[0068]
氧化剂熟化实验
[0069]
实例2.1
[0070]
用购买的氧化剂溶液
[0071]
表2：
[0072][0073]1是指从市售溶液中取出一份等分试样用于使用测试(use-test)并开始对剩余溶液进行热处理的时间点。这与溶液的制备时间不同。
[0074]2溶液未在30
–
35℃熟化，而是在1-15℃从t＝0开始储存。
[0075]3指相对于在质谱中测定的所需化合物的分子质量，具有16da的质量差的分子的百分比，即其中1个p＝s键合已转化为p＝o键合的分子的百分比。
[0076]
实例2.2
[0077]
使用新鲜制备的氧化剂溶液：
[0078]
a)碘溶液的制备
[0079]
在室温将1.00kg水加入到8.00kg吡啶中。添加127g碘。加入0.827kg吡啶进行漂洗，在干燥氮气正压下搅拌混合物1h。
[0080]
b)碘溶液的熟化
[0081]
·
在30
–
35℃熟化：
[0082]
800ml等分试样在30
–
35℃储存在琥珀色玻璃瓶中直至使用。
[0083]
·
在60
–
65℃熟化：
[0084]
该材料在干燥氮气的正压下保持在60-65℃的夹套玻璃反应器中直至使用。
[0085]
表3：(在30℃
–
35℃熟化)
[0086][0087][0088]
表4(在60℃
–
65℃熟化)
[0089][0090]1是指溶液制备完成的时间点。
[0091]2指相对于在质谱中测定的所需化合物的分子质量，具有16da的质量差的分子的百分比，即其中1个p＝s键合已转化为p＝o键合的分子的百分比。