环肽、细胞支架材料、细胞分离材料及培养基的制作方法

1.本发明涉及一种环肽、细胞支架材料、细胞分离材料及培养基。


背景技术：

2.整联蛋白是细胞粘附分子，是由α链和β链的两个亚基组成的异质二聚体的蛋白质。整联蛋白不仅对细胞粘附发挥作用，还发挥与细胞伸展、细胞移动、细胞增殖、组织形成、癌症转移、组织修复、血液凝固等相关的重要作用。
3.日本特表2005-507376号公报中公开了一种通过与整联蛋白键合的二硫化物键进行环状化的环肽。对整联蛋白具有亲和性的环肽还已知例如，日本特表平6-509551号公报中作为血小板凝聚抑制剂，记载了使tyr-arg-gly-asp环状化的环肽作为对gp iibiiia具有高特异性的血小板凝聚抑制剂。并且，bioconju gate chem,1995,6,p.269-277中记载了使用(溴乙酰基)二氨基丙酸进行肽的环化和/或与载体蛋白质或玻璃盖滑片的键合的技术。


技术实现要素：

4.发明要解决的技术课题
5.本发明所涉及的实施方式要解决的课题在于，提供一种与整联蛋白的键合性优异，且分子稳定性，例如耐碱性优异的环肽、以及含有上述环肽的细胞支架材料、细胞分离材料及培养基。
6.用于解决技术课题的手段
7.用于解决上述课题的方案包括以下方式。
8.＜1＞一种环肽，其包含含有rgd序列且氨基酸残基数为8～14的环状链段，
9.在位于上述环状链段的最n末端侧的氨基酸残基xa与位于上述环状链段的最c末端侧的氨基酸残基xb之间形成有硫醚键，
10.其中，当上述氨基酸残基xa和上述氨基酸残基xb中的一个是半胱氨酸残基时，上述氨基酸残基xa和上述氨基酸残基xb中的另一个氨基酸残基的α碳与上述半胱氨酸残基的硫原子被5个以上的原子隔开。
11.＜2＞根据＜1＞所述的环肽，其还包含上述环状链段与上述环肽的n末端之间的第1链段及上述环状链段与上述环肽的c末端之间的第2链段中的至少一个，上述第1链段及上述第2链段中的至少一个包含侧链上具有固定化官能团的氨基酸残基。
12.＜3＞根据＜2＞所述的环肽，其中，上述固定化官能团是氨基或硫醇基。
13.＜4＞根据＜2＞所述的环肽，其中，上述侧链上具有固定化官能团的氨基酸残基选自由l-赖氨酸残基、d-赖氨酸残基、l-半胱氨酸残基、d-半胱氨酸残基、l-高半胱氨酸残基及d-高半胱氨酸残基组成的组中。
14.＜5＞根据＜2＞至＜4＞中任一项所述的环肽，其中，当所述第1链段及所述第2链段各自存在时长度为1～20的氨基酸残基。
15.＜6＞根据＜1＞至＜5＞中任一项所述的环肽，其中，
16.上述氨基酸残基xa和上述氨基酸残基xb中的一个是以下(p)或(q)的氨基酸残基，
17.[化学式编号1]
[0018][0019]
其中，式中，*是与相邻的氨基酸残基的键合位置，**是与硫醚键的配位氨基酸残基的硫原子的键合位置，x1是0以上的整数，x1个碳原子及β位的碳原子也可以被选自由-nh2、-sh、-cooh、c
1-c
10
的烷基及c
6-c
14
的芳基组成的组中的一个以上的取代基取代，
[0020]
**-l是**-(ch2)
y1-c(＝o)-或**-(ch2)
y1-c(＝o)-nh-，y1表示0以上且10以下的整数，
[0021]
上述氨基酸残基xa和上述氨基酸残基xb中的另一个是以下(t)或(u)的残基，
[0022]
[化学式编号2]
[0023][0024]
其中，式中，*是与相邻的氨基酸残基的键合位置，***是与硫醚键的配位氨基酸残基的碳原子的键合位置，x2是0以上的整数，x2个碳原子及β位的碳原子也可以被选自由-nh2、-sh、-cooh、c
1-c
10
的烷基及c
6-c
14
的芳基组成的组中的一个以上的取代基取代，
[0025]
其中，当上述氨基酸残基xa和上述氨基酸残基xb中的一个是上述(p)或(q)中x1为0的氨基酸残基时，上述氨基酸残基xa和上述氨基酸残基xb中的另一个不是l-半胱氨酸残基或d-半胱氨酸残基。
[0026]
＜7＞根据＜6＞所述的环肽，其中，氨基酸残基xa是上述(p)或(q)的氨基酸残基。
[0027]
＜8＞根据＜6＞所述的环肽，其中，氨基酸残基xb是上述(p)或(q)的氨基酸残基。
[0028]
＜9＞根据＜6＞至＜8＞中任一项所述的环肽，其中，
[0029]
上述(p)或(q)的氨基酸残基是选自以下(a)～(h)中的残基，
[0030]
[化学式编号3]
[0031][0032]
其中，式中，*是与相邻的氨基酸残基的键合位置，**是与硫醚键的配位氨基酸残基的硫原子的键合位置，
[0033]
上述(t)或(u)的氨基酸残基选自由l-高半胱氨酸残基、d-高半胱氨酸残基、l-青霉胺残基、d-青霉胺残基、l-半胱氨酸残基及d-半胱氨酸残基组成的组中，
[0034]
其中，不包括上述(a)或(b)的残基与l-半胱氨酸残基或d-半胱氨酸残基的组合。
[0035]
＜10＞根据＜1＞至＜9＞中任一项所述的环肽，其包含多个上述环状链段，各环状链段的氨基酸序列可以彼此相同也可以不同。
[0036]
＜11＞根据＜10＞所述的环肽，其中，上述多个环状链段彼此通过1～20氨基酸残基长度的连结部彼此连结。
[0037]
＜12＞根据＜1＞至＜11＞中任一项所述的环肽，其中，总氨基酸残基数为8～50。
[0038]
＜13＞根据＜1＞至＜9＞中任一项所述的环肽，其由式ii表示：
[0039]rn-x
v0-x
6t0-x
p0-x
a-x
m-r-g-d-x
n-x
b-x
q0-x
7u0-x
w0-rc(式ii)
[0040]
式ii中，
[0041]
xa表示氨基酸残基xa，xb表示氨基酸残基xb，
[0042]
x表示任意的氨基酸残基，在x为多个的情况下，多个x可以彼此相同也可以不同，
[0043]rn
表示n末端基，rc表示c末端基，
[0044]
x6及x7分别独立地表示侧链上具有固定化官能团的氨基酸残基，在x6或x7为多个的情况下，多个x6或x7可以彼此相同也可以不同，
[0045]
m及n是同时满足0≤m≤9、0≤n≤9及3≤m n≤9的整数，
[0046]
p0及q0分别是满足0≤p0≤15及0≤q0≤15的整数，
[0047]
t0及u0分别是满足0≤t0≤5及0≤u0≤5的整数，
[0048]
v0及w0分别是满足0≤v0≤5及0≤w0≤5的整数，
[0049]
而且，p0、q0、t0、u0、v0及w0满足0≤p0 q0 t0 u0 v0 w0≤39。
[0050]
＜14＞根据＜13＞所述的环肽，其中，
[0051]
式ii中的x
a-x
m-r-g-d-x
n-xb是x
a-x
tv5-x
1-x
2-r-g-d-x
3-x
4-x
5v6-x
tv7-xb，
[0052]
x
t
表示任意的氨基酸残基，在x
t
存在多个的情况下，多个x
t
可以彼此相同也可以不同，
[0053]
x1表示i、v、d、e、y、l、t或高酪氨酸，
[0054]
x2表示p、t或s，
[0055]
x3表示n、s、t、v、a或高丝氨酸，
[0056]
x4表示f、y或p，
[0057]
x5表示r、d、e、a、t、s或g，
[0058]
v5及v7分别独立地表示0～6的整数，
[0059]
v6表示0或1。
[0060]
＜15＞根据＜14＞所述的环肽，其满足以下(i)～(v)中的至少一个：
[0061]
(i)由x1表示的氨基酸残基是i、v或t；
[0062]
(ii)由x2表示的氨基酸残基是p；
[0063]
(iii)由x3表示的氨基酸残基是s或t；
[0064]
(iv)由x4表示的氨基酸残基是f：
[0065]
(v)v6表示1，由x5表示的氨基酸基为a。
[0066]
＜16＞根据＜1＞至＜15＞中任一项所述的环肽，其中，由上述氨基酸残基xa和上述氨基酸残基xb夹持的区域的氨基酸序列与iprgdnfr(序列号1)的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性，或者与iprgdsfa(序列号170)、vprgdtfa(序列号171)及tprgdtfa(序列号172)中的任一个氨基酸序列具有70％以上的序列同源性。
[0067]
＜17＞一种细胞支架材料，其包含基材及＜1＞至＜16＞中任一项所述的环肽。
[0068]
＜18＞一种细胞分离材料，其包含保持材料及＜1＞至＜16＞中任一项所述的环肽。
[0069]
＜19＞一种培养基，其含有培养成分及＜1＞至＜16＞中任一项所述的环肽。
[0070]
发明效果
[0071]
根据本发明所涉及的实施方式，提供一种与整联蛋白的键合性优异，且分子稳定性，例如耐碱性优异的环肽、以及含有上述环肽的细胞支架材料、细胞分离材料及培养基。
具体实施方式
[0072]
以下，对本发明所涉及的环肽、细胞支架材料、细胞分离材料及培养基进行说明。但是，本发明所涉及的实施方式并不限定于以下实施方式，能够适当变更来实施。
[0073]
在本发明中，使用“～”表示的数值范围表示将记载于“～”前后的数值分别作为最小值及最大值而包含的范围。
[0074]
在本发明中阶段性地记载的数值范围中，在某个数值范围中记载的上限值或下限值可以替换为其他阶段性的记载的数值范围的上限值或下限值。并且，在本发明中记载的数值范围中，在某个数值范围中记载的上限值或下限值也可以替换为在实施例中所示的值。
[0075]
在本发明中，两个以上的优选的方式的组合为更优选的方式。
[0076]
在本发明中，在存在多种对应于各成分的物质的情况下，只要没有特别说明，则各成分的量是指多种物质的总量。
[0077]
在本发明中，术语“工序”不仅包括独立的工序，只要可实现工序的所期望的目的，还包括无法与其他工序明确区分的工序。
[0078]
本发明所涉及的环肽包含含有rgd序列且氨基酸残基数为8～14的环状链段，
[0079]
在位于上述环状链段的最n末端侧的氨基酸残基xa与位于上述环状链段的最c末端侧的氨基酸残基xb之间形成有硫醚键，
[0080]
其中，当上述氨基酸残基xa和上述氨基酸残基xb中的一个是半胱氨酸残基时，上述氨基酸残基xa和上述氨基酸残基xb中的另一个氨基酸残基的α碳与上述半胱氨酸残基的硫原子被5个以上的原子隔开。
[0081]
整联蛋白键合性环肽具有与作为细胞粘附分子的整联蛋白的键合能力。由于整联蛋白键合性环肽具有与细胞表面的整联蛋白的键合能力，因此能够用作用于细胞培养的支架材料、用作用于分离细胞的细胞分离材料及用作培养基等，是有用的分子。然而，环肽与直链肽相比，有时具有高键合性、特异性，另一方面，环肽的分子稳定性具有比直链肽低的倾向。
[0082]
例如，环肽具有耐碱性；耐酸性；对x射线、γ射线等活化光线的耐性等低的倾向。整联蛋白键合性环肽由于分子稳定性低，因此长期使用或反复使用期间分解，也无法长期得到所期望的效果。而且，环肽并不总是具有比直链肽高的键合性，根据其氨基酸序列，与整联蛋白的键合性会发生变化。因此，不容易得到兼具优异的分子稳定性和优异的整联蛋白键合性这两者的整联蛋白键合性环肽。
[0083]
然而，本发明所涉及的特定结构的环肽兼具优异的分子稳定性和优异的整联蛋白键合性这两者。本发明所涉及的特定结构的环肽包含含有rgd序列且氨基酸残基数为8～14的环状链段，在位于上述环状链段的最n末端侧的氨基酸残基xa与位于上述环状链段的最c末端侧的氨基酸残基xb之间形成有硫醚键。其中，当上述氨基酸残基xa和上述氨基酸残基xb中的一个是半胱氨酸残基时，上述氨基酸残基xa和上述氨基酸残基xb中的另一个氨基酸残基的α碳与上述半胱氨酸残基的硫原子被5个以上的原子隔开。根据该特定结构，本发明所涉及的特定结构的环肽具有优异的分子稳定性和优异的整联蛋白键合性。日本特表2005-507376号公报、日本特表平6-509551号公报及bioconjugate chem,1995,6,p.269-277中未公开通过以满足上述规定的方式设定环状链段区域，并且以满足上述规定的方式设定环肽
中的与硫醚键相关的氨基酸残基，从而兼顾优异的分子稳定性和优异的整联蛋白键合性。
[0084]
〈氨基酸及氨基酸残基〉
[0085]
在本发明中，氨基酸原则上使用由基于国际纯化学与应用化学联盟和国际生物化学与分子生物学联盟的共同命名委员会(international union of pure and applied chemistry and international union of biochemistry and molecular biology iupac-iub joint commission on biochemical nomenclature(jcbn))采用的名称、缩写等来表示。并且，氨基酸残基使用衍生该氨基酸残基的氨基酸的缩写来表示。
[0086]
只要没有特别说明，肽或蛋白质的氨基酸序列(也称为“1级结构”。)从左端到右端，以成为从n末端到c末端的方式排列1列氨基酸残基来表示。在包括位置在内确定肽或蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸残基的情况下，有时在氨基酸残基的缩写的右侧标注表示从n末端侧开始的第几个氨基酸残基的数字来表示。例如，有时将从n末端起第二个赖氨酸表示为lys2。
[0087]
并且，在使用其名称表示氨基酸的情况下，且存在处于对映体关系的异构体，即l体及d体时，除了明确表示l体及d体的区别的情况以外，原则上可以是l体，也可以是d体。例如，“异亮氨酸”表示“l-异亮氨酸”或“d-异亮氨酸”，对于氨基酸残基也相同。同样地，在使用其缩写(3字符缩写或1字符缩写)表示氨基酸的情况下，且存在处于对映体关系的异构体，即l体及d体的情况下，除了明确表示l体及d体的区别的情况以外，原则上可以是l体，也可以是d体。例如，“lys”均表示“l-赖氨酸”或“d-赖氨酸”，对于氨基酸残基也相同。并且，对于各氨基酸、各氨基酸残基，能够分别独立地选择l体和d体。其中，关于存在于环状链段中的rgd序列，全部为l体的氨基酸残基。关于上述rgd序列以外的序列，存在于环肽中的氨基酸残基可以全部为l体的氨基酸残基，也可以全部为d体的氨基酸残基，也可以存在l体的氨基酸残基和d体的氨基酸残基这两者。
[0088]
并且，在使用其名称表示氨基酸的情况下，且存在处于非对映体关系的异构体的情况下，不包含在由其名称确定的氨基酸中。非对映体使用前缀“别(al lo)”作为不同种类的氨基酸进行处理。例如，“苏氨酸”不包括“别苏氨酸”。对于氨基酸残基也相同。
[0089]
将官方认可1字符缩写及3字符缩写的氨基酸的名称及缩写(1字符缩写、3字符缩写)示于表1中。
[0090]
[表1]
[0091]
1字符缩写3字符缩写名称aala丙氨酸basx天冬氨酸或天冬酰胺ccys半胱氨酸dasp天冬氨酸eglu谷氨酸fphe苯丙氨酸ggly甘氨酸hhis组氨酸iile异亮氨酸klys赖氨酸
lleu亮氨酸mmet甲硫氨酸nasn天冬酰胺opyl吡咯赖氨酸ppro脯氨酸qgln谷氨酰胺rarg精氨酸sser丝氨酸tthr苏氨酸usec硒代半胱氨酸vval缬氨酸wtrp色氨酸xxaa任意的氨基酸ytyr酪氨酸zglx谷氨酸或谷氨酰胺
[0092]
本发明所涉及的环肽中可使用的氨基酸并不限定于表1中所举出的氨基酸，也能够使用异常氨基酸。在以下表2中举出异常氨基酸的例子，但异常氨基酸并不限定于此。
[0093]
[表2]
[0094][0095]
本发明所涉及的环肽中所包含的任意的氨基酸残基也可以受到化学修饰。作为对氨基酸残基的化学修饰的例子，可举出对存在于氨基酸残基中的氨基的n-乙酰化、n-甲酰化、n-酰化、peg化等，对存在于氨基酸残基中的羧基的酰胺化、peg化等。
[0096]
本发明所涉及的环肽包含含有rgd序列且氨基酸残基数为8～14的环状链段，通过在位于环状链段的最n末端侧的氨基酸残基xa与位于环状链段的最c末端侧的氨基酸残基xb之间进行交联而形成环。本发明所涉及的环肽可以仅由环状链段构成，也可以在环状链段的n末端侧及c末端侧中的至少一个上进一步具有氨基酸残基。
[0097]
并且，在本发明所涉及的环肽中，上述环状链段的数量并不限定于1，上述环状链段也可以存在多个，即两个以上。在环状链段存在多个的情况下，本发明所涉及的环肽中的环状链段的数量可以是2～4，也可以是2或3，或也可以是2。多个环状链段的氨基酸序列可以彼此相同，也可以不同。并且，环状链段与相邻的环状链段可以直接连结，或也可以在环状链段与相邻的环状链段之间存在作为连结部的氨基酸序列。在存在作为连结部的氨基酸序列的情况下，作为连结部的氨基酸序列没有特别限定，各连结部的长度可以是1～20氨基酸残基，也可以是2～10氨基酸残基，也可以是3～5氨基酸残基。
[0098]
上述环状链段中包含rgd序列。另外，在本发明中，“环状链段”的术语用于含有上述rgd序列且氨基酸残基数为8～14的环状链段，但也可以追加存在不属于含有rgd序列且氨基酸残基数为8～14的环状链段的环状部，例如不含有rgd序列的环状部、氨基酸残基数为8～14的范围外的环状部等。
[0099]
由于rgd序列是与整联蛋白的键合所需的序列，因此上述环状链段以含有rgd序列的方式构成环肽。然而，为了使rgd序列充分地发挥与整联蛋白的键合能力，在rgd序列的周围也需要存在氨基酸残基，环状链段构成为氨基酸残基数为8～14。存在于一个环状链段内的rgd序列的数量可以是一个，或也可以存在两个、三个或四个rgd序列。环状链段内的rgd序列的位置优选为与氨基酸残基xa和氨基酸残基xb均不相邻的位置。换言之，优选在rgd序列与氨基酸残基xa之间存在一个以上的氨基酸残基，优选在rgd序列与氨基酸残基xb之间也存在一个以上的氨基酸残基。例如，从提高与整联蛋白的键合性的观点出发，将氨基酸残基xa作为第1个氨基酸残基向c末端侧计数氨基酸残基时，rgd序列优选对应于第3～5个氨基酸残基，或对应于第4～6个氨基酸残基。
[0100]
环状链段的氨基酸残基数如上所述为8～14。环状链段的氨基酸残基数可以是9～13，也可以是10～12。若环状链段的氨基酸残基数在该范围内，则环肽的分子内应变不会变得过大，α螺旋等高级结构稳定，因此本发明所涉及的环肽具有优异的整联蛋白键合性。
[0101]
关于环状链段中的rgd序列、由xa表示的氨基酸残基及除了由xb表示的氨基酸残基以外的氨基酸残基，只要不损害与整联蛋白的键合性，则没有特别限定。环状链段中的rgd序列、由xa表示的氨基酸残基及除了由xb表示的氨基酸残基以外的氨基酸残基也可以分别是选自例如异亮氨酸残基、缬氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、酪氨酸残基、亮氨酸残基、苏氨酸残基、高酪氨酸残基、脯氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基、丙氨酸残基、高丝氨酸残基、苯丙氨酸残基、精氨酸残基及甘氨酸残基中的氨基酸残基。在环状链段中所包含的rgd序列为一个的情况下，环状链段中的rgd序列、由xa表示的氨基酸残基及除了由xb表示的氨基酸残基以外的氨基酸残基的数量为3～9，可以是4～8，也可以是5～7。
[0102]
例如，环状链段也可以是由x
a-x
tv5-x
11-x
21-r-g-d-x
31-x
41-x
51v6-x
tv7-xb(式iii)表示的环状链段。
[0103]
在式iii中，xa表示位于环状链段的最n末端侧的氨基酸残基xa，xb表示位于环状链段的最c末端侧的氨基酸残基xb，
[0104]
x
t
表示任意的氨基酸残基，在x
t
存在多个的情况下，多个x
t
可以彼此相同也可以不同，
[0105]
x
11
、x
21
、x
31
、x
41
及x
51
分别独立地表示任意一个氨基酸残基，
[0106]
v5及v7分别独立地表示0～6的整数，
[0107]
v6表示0或1，
[0108]
其中，满足以下(a)～(e)中的至少一个。
[0109]
(a)x
11
表示i、v、d、e、y、l、t或高酪氨酸。
[0110]
(b)x
21
表示p、t或s。
[0111]
(c)x
31
表示n、s、t、v、a或高丝氨酸。
[0112]
(d)x
41
表示f、y或p。
[0113]
(e)v6为1，x
51
表示r、d、e、a、t、s或g。
[0114]
关于式(iii)中的xa及xb的优选例在后面叙述。v5及v7可以分别独立地是0～4，也可以是0～2，也可以是0或1，也可以是0。并且，x
t
可以分别独立地是选自由a、f、g、i、l、m、p、v及w组成的组中的氨基酸残基，也可以是选自由a、g、i、l、p及v组成的组中的氨基酸残基，也可以是a。
[0115]
更具体而言，例如，环状链段也可以是由x
a-x
tv5-x
1-x
2-r-g-d-x
3-x
4-x
5v6-x
tv7-xb(式iv)表示的环状链段。
[0116]
在式iv中，xa表示位于环状链段的最n末端侧的氨基酸残基xa，xb表示位于环状链段的最c末端侧的氨基酸残基xb，
[0117]
x
t
表示任意的氨基酸残基，在x
t
存在多个的情况下，多个x
t
可以彼此相同也可以不同，
[0118]
x1表示i、v、d、e、y、l、t或高酪氨酸，
[0119]
x2表示p、t或s，
[0120]
x3表示n、s、t、v、a或高丝氨酸，
[0121]
x4表示f、y或p，
[0122]
x5表示r、d、e、a、t、s或g，
[0123]
v5及v7分别独立地表示0～6的整数，
[0124]
v6表示0或1。
[0125]
关于xa及xb的优选例在后面叙述。v5及v7可以分别独立地是0～4，也可以是0～2，也可以是0或1，也可以是0。并且，x
t
可以分别独立地是选自由a、f、g、i、l、m、p、v及w组成的组中的氨基酸残基，也可以是选自由a、g、i、l、p及v组成的组中的氨基酸残基，也可以是a。
[0126]
由x1表示的氨基酸残基也可以是i、v或t。由x2表示的氨基酸残基也可以是p。由x3表示的氨基酸残基也可以是s或t。由x4表示的氨基酸残基也可以是f。当v6表示1时，由x5表示的氨基酸基也可以是a。并且，关于x1～x5的这些氨基酸残基的候补的例示性规定可以满足至少一个，也可以组合两个以上，也可以组合全部。
[0127]
在环状链段中，由氨基酸残基xa和氨基酸残基xb夹持的区域的氨基酸序列可以是与iprgdnfr(序列号1)相同的氨基酸序列，或也可以是对序列号1的氨基酸序列加成、缺失或取代了氨基酸残基的氨基酸基。其中，序列号1中的rgd区域不得改变。在序列号1的氨基酸序列的内部进行氨基酸残基的加成的情况下，所加成的氨基酸残基的总数优选为1～5，更优选为1～3，进一步优选为1或2。在对序列号1的氨基酸序列的外部，即氨基酸残基xa与序列号1的n末端的i残基之间及氨基酸残基xb与序列号1的c末端的r残基之间中的至少一者进行氨基酸残基的加成的情况下，所加成的氨基酸的总数优选为1～10，更优选为1～5，进一步优选为1～3。在使序列号1的氨基酸序列的内部的氨基酸残基缺失的情况下，缺失的
氨基酸残基的总数优选为1～3，更优选为1或2，进一步优选为1。在用其他氨基酸残基取代序列号1的氨基酸序列的内部的氨基酸残基的情况下，取代的氨基酸残基的总数优选为1～5，更优选为1～3，进一步优选为1或2。
[0128]
在环状链段中，由氨基酸残基xa和氨基酸残基xb夹持的区域的氨基酸序列与序列号1的氨基酸序列进行比较时，可以包含氨基酸残基的加成、缺失及取代中的2种以上。加成、缺失或取代的氨基酸残基的总数优选为1～15，更优选为1～10，进一步优选为1～5，更进一步优选为1～3。并且，在存在氨基酸残基的加成或缺失的情况下，优选在序列号1的氨基酸序列的末端具有加成或缺失。对于后述的序列号2～166的氨基酸序列中的环状链段中的两个交联氨基酸残基(即，氨基酸残基xa及xb)所夹持的区域的序列也相同。
[0129]
例如，氨基酸残基的缺失优选在序列号1的氨基酸序列中的c末端的r残基中发生。
[0130]
在环状链段中，由氨基酸残基xa和氨基酸残基xb夹持的区域的氨基酸序列优选与iprgdnfr(序列号1)的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性。由氨基酸残基xa和氨基酸残基xb夹持的区域的氨基酸序列优选与iprgdnfr(序列号1)的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性，更优选具有80％以上的序列同源性，进一步优选具有85％以上的序列同源性。另外，与iprgdnfr(序列号1)的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列的范围也包含iprgdnfr(序列号1)的氨基酸序列本身。
[0131]
在本发明中，如下求出两个氨基酸序列的序列同源性。
[0132]
(i)进行两个氨基酸序列的对准。
[0133]
例如，使用能够在初始设定中使用的fasta、blast等对准算法和/或程序，能够进行两个序列之间的对准。
[0134]
(ii)计算序列同源性。
[0135]
根据所得到的对准，通过下式计算序列同源性。
[0136]
序列同源性[％]＝(一致位置数/总位置数)
×
100[％]
[0137]
总位置数是对准的长度，一致位置数是氨基酸的种类一致的位置的数量。
[0138]
(iii)序列同源性的计算例
[0139]
例如，考虑以下氨基酸序列。
[0140]
序列a ayhrgelvwe
[0141]
序列b sawhgelvw
[0142]
若在上述条件下对其进行对准，则变成如下。其中，在序列a、b之间氨基酸(残基)的种类一致的部位，为了便于观察，标注符号“|”。并且，
“‑”
表示没有对应的氨基酸的部位。
[0143][0144]
在该例子中，总位置数为11，一致位置数为7，因此按照上述式计算出的序列同源性为7/11
×
100＝63.6％。
[0145]
在上述中，记载了对序列号1的氨基酸序列的加成、缺失或取代的氨基酸残基数及对序列号1的氨基酸序列的序列同源性，但对上述氨基酸序列的加成、缺失或取代的氨基酸残基数的规定及序列同源性的规定也能够同样地适用于将序列号2～166的氨基酸序列(即，环肽1～165的氨基酸序列)中的环状链段中的两个交联氨基酸残基(即，氨基酸残基xa及xb)所夹持的区域的序列作为基准序列的情况。例如，对于作为环肽10中的高半胱氨酸残基与2-氨基-4-乙酰氨基-丁酸残基之间的区域的iprgdnf(序列号169)的氨基酸序列也能够同样地适用对上述氨基酸序列的加成、缺失或取代的氨基酸残基数的规定及序列同源性的规定。
[0146]
例如，在环状链段中，由氨基酸残基xa和氨基酸残基xb夹持的区域的氨基酸序列可以是与iprgdsfa(序列号170)、vprgdtfa(序列号171)及tprgdtfa(序列号172)中的任一个相同的氨基酸序列，或也可以是对序列号170～172中的任一个氨基酸序列加成、缺失或取代了氨基酸残基的氨基酸基。其中，序列号170～172中的rgd区域不得改变。在序列号170～172中的任一个氨基酸序列的内部进行氨基酸残基的加成的情况下，所加成的氨基酸残基的总数优选为1～5，更优选为1～3，进一步优选为1或2。在对序列号170～172中的任一个氨基酸序列的外部，即氨基酸残基xa与序列号170～172中的任一个n末端残基之间及氨基酸残基xb与序列号170～172中的任一个c末端残基之间中的至少一者进行氨基酸残基的加成的情况下，所加成的氨基酸的总数优选为1～10，更优选为1～5，进一步优选为1～3。在使序列号170～172中的任一个氨基酸序列的内部的氨基酸残基缺失的情况下，缺失的氨基酸残基的总数优选为1～3，更优选为1或2，进一步优选为1。在用其他氨基酸残基取代序列号170～172中的任一个氨基酸序列的内部的氨基酸残基的情况下，取代的氨基酸残基的总数优选为1～5，更优选为1～3，进一步优选为1或2。
[0147]
在环状链段中，由氨基酸残基xa和氨基酸残基xb夹持的区域的氨基酸序列与序列号170～172中的任一个氨基酸序列进行比较时，可以包含氨基酸残基的加成、缺失及取代中的2种以上。加成、缺失或取代的氨基酸残基的总数优选为1～15，更优选为1～10，进一步优选为1～5，更进一步优选为1～3。并且，在存在氨基酸残基的加成或缺失的情况下，优选在序列号170～172中的任一个氨基酸序列的末端具有加成或缺失。
[0148]
例如，氨基酸残基的缺失优选在序列号170～172中的任一个氨基酸序列中的c末端残基中发生。
[0149]
在环状链段中，由氨基酸残基xa和氨基酸残基xb夹持的区域的氨基酸序列优选与iprgdsfa(序列号170)、vprgdtfa(序列号171)及tprgdtf a(序列号172)中的任一个氨基酸序列具有70％以上的序列同源性。由氨基酸残基xa和氨基酸残基xb夹持的区域的氨基酸序列优选与序列号170～172中的任一个氨基酸序列具有70％以上的序列同源性，更优选具有80％以上的序列同源性，进一步优选具有85％以上的序列同源性。另外，与序列号170～172中的任一个氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列的范围也包含序列号170～172中的任一个氨基酸序列本身。
[0150]
包含环状链段的本发明所涉及的环肽的全长(总氨基酸残基数)可以是8～50氨基酸残基，也可以是9～30氨基酸残基，也可以是10～20氨基酸残基，也可以是11～15氨基酸残基。全长越短，肽合成越容易。
[0151]
本发明所涉及的环肽的n末端与环状链段的n末端(在环肽中包含多个环状链段的情况下，最n末端侧的环状链段的n末端)之间的区域在本发明中有时被称为环肽n末端区域或第1链段，本发明所涉及的环肽的c末端与环状链段的c末端(在环肽中包含多个环状链段的情况下，最c末端侧的环状链段的c末端)之间的区域在本发明中有时被称为环肽c末端区域或第2链段。
[0152]
环肽的n末端区域的存在是任意的，也可以不存在。在不存在环肽n末端区域的情况下，环状链段的n末端也对应于环肽的n末端。同样地，环肽的c末端区域的存在是任意的，也可以不存在。在不存在环肽c末端区域的情况下，环状链段的c末端也对应于环肽的c末端。
[0153]
环肽的n末端的氨基也可以受到n-乙酰化、n-甲酰化、n-酰化、peg化等n末端修饰。并且，环肽的c末端的羧基也可以受到酰胺化、peg化等c末端修饰。
[0154]
本发明所涉及的环肽也可以是由以下式ii表示的环肽。
[0155]rn-x
v0-x
6t0-x
p0-x
a-x
m-r-g-d-x
n-x
b-x
q0-x
7u0-x
w0-rcꢀꢀꢀ
(式ii)
[0156]
式ii中，
[0157]
xa表示位于环状链段的最n末端侧的氨基酸残基，xb表示位于环状链段的最c末端侧的氨基酸残基，在氨基酸残基xa与氨基酸残基xb之间形成有硫醚键，
[0158]
x表示任意的氨基酸残基，在x为多个的情况下，多个x可以彼此相同也可以不同，
[0159]rn
表示n末端基，rc表示c末端基，
[0160]
x6及x7分别独立地表示侧链上具有固定化官能团的氨基酸残基，在x6或x7为多个的情况下，多个x6或x7可以彼此相同也可以不同，
[0161]
m及n是同时满足0≤m≤9、0≤n≤9及3≤m n≤9的整数，
[0162]
p0及q0分别是满足0≤p0≤15及0≤q0≤15的整数，
[0163]
t0及u0分别是满足0≤t0≤5及0≤u0≤5的整数，
[0164]
v0及w0分别是满足0≤v0≤5及0≤w0≤5的整数，
[0165]
而且，p0、q0、t0、u0、v0及w0满足0≤p0 q0 t0 u0 v0 w0≤39。
[0166]
在式ii及后述的式v中，下标字符是表示存在几个由之前记载的符号表示的氨基酸残基的整数。例如，x
p0
的标记中的p0表示排列存在p0个由x表示的氨基酸残基。在下标字符表示2以上的整数的情况下，由之前记载的符号表示的氨基酸残基存在多个，但只要满足其定义，则多个氨基酸残基彼此可以彼此相同，也可以不同。
[0167]
在由式ii表示的环肽中，x
a-x
m-r-g-d-x
n-xb对应于环状链段。关于xa及xb的优选例在后面叙述。
[0168]
《x
6t0
及x
7u0
》
[0169]
在式ii中，x6及x7分别独立地表示侧链上具有固定化官能团的氨基酸残基。
[0170]
在x6或x7为多个的情况下，多个x6或x7可以彼此相同，也可以不同。
[0171]
(固定化官能团)
[0172]
上述“固定化官能团”是指能够与后述的基材或保持材料上的官能团反应而形成共价键的官能团。
[0173]
作为固定化官能团，例如可举出氨基、羧基、羟基、硫醇基、醛基(甲酰基)、氨基甲酰基、叠氮基、炔基等。
[0174]
作为本发明所涉及的环肽所具有的固定化官能团与基材或保持材料上的官能团的组合，可举出氨基与羧基的组合、氨基与醛基的组合、氨基与环氧基的组合、羟基与环氧基的组合、羧基与羟基的组合、硫醇基与环氧基的组合、叠氮基与炔基的组合等。
[0175]
通过本发明所涉及的环肽所具有的固定化官能团与基材或保持材料上的官能团反应而形成共价键，本发明所涉及的环肽固定在基材或保持材料上。另外，只要本发明所涉
及的环肽所具有的固定化官能团中的至少一部分与基材或保持材料上的官能团反应而形成共价键即可，所有的固定化官能团也可以不与基材或保持材料上的官能团反应。
[0176]
在上述侧链上具有固定化官能团的氨基酸中，固定化官能团优选为选自由氨基、硫醇基及醛基组成的组中的至少一个，更优选为选自由氨基及硫醇基组成的组中的至少一个。
[0177]
(侧链上具有固定化官能团的氨基酸)
[0178]
上述侧链上具有固定化官能团的氨基酸优选为选自由l-赖氨酸、d-赖氨酸、l-半胱氨酸、d-半胱氨酸、l-高半胱氨酸及d-高半胱氨酸组成的组中的至少一种氨基酸。
[0179]
在将氨基用作固定化官能团的情况下，氨基能够经由酰胺键与基材或保持材料上的羧基键合，并且能够将本发明所涉及的环肽容易地固定在基材或保持材料上。
[0180]
并且，在将硫醇基用作固定化官能团的情况下，硫醇基能够经由共价键与基材或保持材料上的环氧基键合，并且能够将本发明所涉及的环肽容易地固定在基材或保持材料上。
[0181]
作为侧链上具有氨基的氨基酸残基，可举出l-赖氨酸残基、d-赖氨酸残基等，作为侧链上具有硫醇基的氨基酸残基，可举出l-半胱氨酸残基、d-半胱氨酸残基等。这些氨基酸残基能够相对廉价地导入，因此能够抑制本发明所涉及的环肽的制造成本。因此，从经济的观点出发，优选使用上述氨基酸残基。
[0182]
在式ii中，t0及u0分别是满足0≤t0≤5及0≤u0≤5的整数。
[0183]
t0优选满足0≤t0≤3，更优选满足0≤t0≤2。
[0184]
u0优选满足0≤u0≤3，更优选满足0≤u0≤2。
[0185]
《x
p0
、x
q0
、x
v0
及x
w0
》
[0186]
x
p0
、x
q0
、x
v0
及x
w0
中的x表示任意的氨基酸残基，在x为多个的情况下，多个x可以彼此相同，也可以不同。
[0187]
x只要是氨基酸残基，则没有特别限定，优选为源自选自由表1所示的氨基酸(不包括b、z及x。)及表2所示的氨基酸组成的组中的氨基酸的氨基酸残基，更优选源自选自由表1所示的氨基酸(不包括b、z及x。)组成的组中的氨基酸的氨基酸残基。并且，在存在的情况下，也可以是源自这些氨基酸的对映体或非对映体的氨基酸残基。
[0188]
上述p0及上述q0分别是满足0≤p0≤15及0≤q0≤15的整数。
[0189]
p0优选满足0≤p0≤10，更优选满足0≤p0≤5，进一步优选满足0≤p0≤3，更进一步优选满足0≤p0≤2。
[0190]
q0优选满足0≤q0≤10，更优选满足0≤q0≤5，进一步优选满足0≤q0≤3，更进一步优选满足0≤q0≤2。
[0191]
上述v0及上述w0分别是满足0≤v0≤5及0≤w0≤5的整数。
[0192]
v0优选满足0≤v0≤3，更优选满足0≤v0≤2。
[0193]
w0优选满足0≤w0≤3，更优选满足0≤w0≤2。
[0194]
《xm及xn》
[0195]
xm及xn中的各x可以是任意的氨基酸残基，例如也可以是异亮氨酸残基、缬氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、酪氨酸残基、亮氨酸残基、苏氨酸残基、高酪氨酸残基、脯氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基、丙氨酸残基、高丝氨酸残基、苯丙氨酸残基、精氨酸残
基或甘氨酸残基。
[0196]
上述m及上述n是同时满足0≤m≤9、0≤n≤9及3≤m n≤9的整数。
[0197]
m优选满足0≤m≤5，更优选满足0≤m≤3，进一步优选满足0≤m≤2。
[0198]
n优选满足1≤n≤5，更优选满足2≤n≤4。n也可以是满足2≤n≤3的整数。
[0199]
《rn及rc》
[0200]rn
表示n末端基。
[0201]
作为上述n末端基，例如可举出氨基，作为n末端基的氨基也可以受到n-乙酰化、n-甲酰化、n-酰化、peg化等n末端修饰。
[0202]
rc表示c末端基。
[0203]
作为上述c末端基，例如可举出羧基，作为c末端基的羧基也可以受到酰胺化、peg化等c末端修饰。
[0204]
在式ii中，rn记载于x
v0
的左侧，例如，若v0、t0及p0均为0，则rn对应于由xa表示的氨基酸残基的氨基或修饰氨基。同样地，在式ii中，rc记载于x
w0
的右侧，例如，若q0、u0及w0均为0，则rc对应于由xb表示的氨基酸残基的羧基或修饰羧基。
[0205]
上述式ii中的x
a-x
m-r-g-d-x
n-xb的部分也可以是由上述式iii(x
a-x
tv5-x
11-x
21-r-g-d-x
31-x
41-x
51v6-x
tv7-xb)或上述式iv(x
a-x
tv5-x
1-x
2-r-g-d-x
3-x
4-x
5v6-x
tv7-xb)表示的部分。通过环状链段为由式iii或式iv表示的部分，可以得到可靠性更高的整联蛋白键合性。此时，环肽还可以是由x
j1g1-(环状链段)-x
j2g2
表示的结构的环肽。其中，x
j1
分别独立地表示任意的氨基酸残基，x
j2
也分别独立地表示任意的氨基酸残基，g1表示0～8的整数，g2表示0～8的整数。x
j1
优选分别独立地表示k、a、g、d、e或β丙氨酸。x
j2
优选分别独立地表示k、a、g、d、e或β丙氨酸。x
j1
及x
j2
中的至少一个可以含有(k)
g3
(g3个连续的k残基)，其中，g3表示2～6的整数，优选表示3或4。g1及g2分别独立地更优选表示0～6的整数，可以表示0～4的整数，也可以表示0～2的整数，也可以表示0或1，也可以表示0。x
j1g1
例如可以是kkka，x
j2g2
例如可以是a。
[0206]
在包含两个以上的环状链段部分的情况下，本发明所涉及的环肽也可以是由以下式v表示的环肽。
[0207]rn-x
v0-x
6t0-x
p0-x
a-x
m-r-g-d-x
n-x
b-(x
e0-x
a-x
m-r-g-d-x
n-xb)
d0-x
q0-x
7u0-x
w0-rc(式v)
[0208]
在式v中，rn、x、v0、x6、t0、p0、xa、m、n、xb、q0、x7、u0、w0及rc的含义分别与式(ii)中的rn、x、v0、x6、t0、p0、xa、m、n、xb、q0、x7、u0、w0及rc相同，其优选例及范围也与式ii中的相同。
[0209]
e0表示0以上的整数。e0可以表示0～20的整数，也可以表示1～10的整数，进一步优选可以表示2～5的整数。d0表示1以上的整数。d0可以表示1～3的整数，也可以表示1或2，也可以表示1。xa、xm、xn及xb分别出现多次，出现多次的xa可以彼此相同，也可以不同，出现多次的xb可以彼此相同，也可以不同，出现多次的xm可以彼此相同，也可以不同，出现多次的xn可以彼此相同，也可以不同。其中，xm彼此相同是指x的m个排列与x的m个排列完全相同，xm彼此不同是指x的m个排列与x的m个排列对于至少一个x不同。对于xn也相同。
[0210]
环状链段的数量没有特别限定，但具有环状链段的数量越多，越能够提高整联蛋白键合性的倾向，环状链段的数量越少，越能够减少总氨基酸残基数，因此具有能够抑制抗
原性的倾向。从环肽的合成成本的观点出发，优选氨基酸残基数少，优选环状链段的数量少。
[0211]
氨基酸残基xa及氨基酸残基xb是在xa与xb之间形成硫醚键的氨基酸残基。硫醚键是由r
1-s-r2表示的二价连结结构，其中，r1及r2是有机基团，通常均为碳原子。通过用硫醚键交联氨基酸残基xa及氨基酸残基xb，与通过二硫化物键交联时相比，能够得到更高的键合稳定性。在本发明中，用于形成硫醚键的方案没有特别限定，例如，通过使硫醇基与具有卤素的有机基团反应，能够伴随卤化氢的生成的同时形成硫醇基的硫原子与有机基团键合而成的硫醚键。作为具有卤素的有机基团，例如可举出卤代乙酰基。卤代乙酰基的卤原子也可以是氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等中的任一个。其中，从反应性及容易形成硫醚键和安全性的观点出发，优选为溴原子或氯原子，更优选为氯原子。
[0212]
在氨基酸残基xa为源自α氨基酸的氨基酸残基的情况下，硫醚键优选存在于源自α氨基酸的氨基酸残基的侧链上，而不是存在于与α氨基酸的α碳键合的氨基或修饰氨基上。同样地，在氨基酸残基xb中，在氨基酸残基xb为源自α氨基酸的氨基酸残基的情况下，硫醚键优选存在于源自α氨基酸的氨基酸残基的侧链上，而不是存在于与α氨基酸的α碳键合的羧基或修饰羧基上。
[0213]
为了如上所述在氨基酸残基的侧链上形成硫醚键，优选将硫醚键形成前的氨基酸残基xa及氨基酸残基xb中的一个作为在侧链上具有硫醇基的氨基酸残基，将另一个作为在侧链上具备具有卤素的有机基团的氨基酸残基。作为在侧链上具有硫醇基的氨基酸残基，可举出由以下结构式(t-2)或(u-2)表示的氨基酸残基。
[0214]
[化学式编号4]
[0215][0216]
结构式(t-2)及(u-2)中，*是与相邻的氨基酸残基的键合位置，x2是0以上的整数，x2个碳原子及β位的碳原子也可以被选自由-nh2、-sh、-coo h、c
1-c
10
的烷基及c
6-c
14
的芳基组成的组中的一个以上的取代基取代。x2可以是0～10的整数，也可以是0～6的整数，也可
以是1～4的整数。作为c
1-c
10
的烷基，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。并且，作为c
6-c
14
的芳基，可举出苯基、萘基、蒽基、菲基等。
[0217]
作为在侧链上具有硫醇基的氨基酸残基的更具体的例子，可举出半胱氨酸残基、青霉胺残基、高半胱氨酸残基(源自2-氨基-4-巯基丁酸的残基)、源自2-氨基-5-巯基戊酸的残基等。
[0218]
作为在侧链上具备具有卤素的有机基团的氨基酸残基，可举出由以下结构式(p-2)或(q-2)表示的氨基酸残基。
[0219]
[化学式编号5]
[0220][0221]
结构式(p-2)及(q-2)中，*是与相邻的氨基酸残基的键合位置，halogen是任意的卤原子，例如f、cl、br、i等，x1是0以上的整数，x1个碳原子及β位的碳原子也可以被选自由-nh2、-sh、-cooh、c
1-c
10
的烷基及c
6-c
14
的芳基组成的组中的一个以上的取代基取代，
[0222]
halogen-l是卤原子-(ch2)
y1-c(＝o)-或卤原子-(ch2)
y1-c(＝o)-nh-，y1表示0以上且10以下的整数。x1可以是0～10的整数，也可以是1～6的整数，也可以是2～4的整数。y1可以是0～10的整数，也可以是1～6的整数，也可以是1～3的整数。作为c
1-c
10
的烷基，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。并且，作为c
6-c
14
的芳基，可举出苯基、萘基、蒽基、菲基等。
[0223]
作为在侧链上具备具有卤原子的有机基团的氨基酸残基的更具体的例子，可举出源自2-氨基-3-[(2-卤代乙酰基)氨基]丙酸、2-氨基-4-[(2-卤代乙酰基)氨基]丁酸、n-δ-卤代乙酰基鸟氨酸、n-ε-卤代乙酰基赖氨酸及n-ζ-卤代乙酰基高赖氨酸等的氨基酸残基，但并不限定于此。作为这些氨基酸残基中的卤原子，可举出氟原子、氯原子、溴原子、碘原子
等，其中优选氯原子、溴原子，更优选氯原子。
[0224]
在某个例示性实施方式中，硫醚键形成后的氨基酸残基xa和氨基酸残基xb中，不供给硫醚键的硫原子的一方的氨基酸残基是由以下(p)或(q)表示的氨基酸残基。
[0225]
[化学式编号6]
[0226][0227]
其中，式(p)及式(q)中，*是与相邻的氨基酸残基的键合位置，**是与硫醚键的配位氨基酸残基的硫原子的键合位置，x1是0以上的整数，x1个碳原子及β位的碳原子也可以被选自由-nh2、-sh、-cooh、c
1-c
10
的烷基及c
6-c
14
的芳基组成的组中的一个以上的取代基取代，
[0228]
**-l是**-(ch2)
y1-c(＝o)-或**-(ch2)
y1-c(＝o)-nh-，y1表示0以上且10以下的整数。x1可以是0～10的整数，也可以是1～6的整数，也可以是2～4的整数。y1可以是0～10的整数，也可以是1～6的整数，也可以是1～3的整数。
[0229]
作为c
1-c
10
的烷基，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。并且，作为c
6-c
14
的芳基，可举出苯基、萘基、蒽基、菲基等。
[0230]
作为不供给硫醚键的硫原子的氨基酸残基的更具体的例子，可举出源自2-氨基-3-[乙酰氨基]丙酸、2-氨基-4-[乙酰氨基]丁酸、n-δ-乙酰鸟氨酸、n-ε-乙酰赖氨酸、或n-ζ-乙酰高赖氨酸等的氨基酸残基的乙酰基的ch3部分的氢原子中的一个被与硫醚键的配位氨基酸残基的键取代的氨基酸残基。
[0231]
在某个例示性实施方式中，硫醚键形成后的氨基酸残基xa和氨基酸残基xb中，供给硫醚键的硫原子的一方的氨基酸残基是由以下(t)或(u)表示的氨基酸残基。
[0232]
[化学式编号7]
[0233][0234]
其中，式(t)及式(u)中，*是与相邻的氨基酸残基的键合位置，***是与硫醚键的配位氨基酸残基的碳原子的键合位置，x2是0以上的整数，x2个碳原子及β位的碳原子也可以被选自由-nh2、-sh、-cooh、c
1-c
10
的烷基及c
6-c
14
的芳基组成的组中的一个以上的取代基取代，
[0235]
其中，当上述氨基酸残基xa和上述氨基酸残基xb中的一个是上述(p)或(q)中x1为0的氨基酸残基时，上述氨基酸残基xa和上述氨基酸残基xb中的另一个不是l-半胱氨酸残基或d-半胱氨酸残基。x2可以是0～10的整数，也可以是0～6的整数，也可以是1～4的整数。
[0236]
作为c
1-c
10
的烷基，可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。并且，作为c
6-c
14
的芳基，可举出苯基、萘基、蒽基、菲基等。
[0237]
作为供给硫醚键的硫原子的氨基酸残基的更具体的例子，可举出半胱氨酸残基、青霉胺残基、高半胱氨酸残基(源自2-氨基-4-巯基丁酸的残基)、或源自2-氨基-5-巯基戊酸的残基中的硫醇基的氢原子被与硫醚键的配位氨基酸残基的键取代的氨基酸残基。
[0238]
优选为，氨基酸残基xa和氨基酸残基xb中的一个是(p)或(q)的氨基酸残基，氨基酸残基xa和氨基酸残基xb中的另一个是(t)或(u)的残基，其中，当氨基酸残基xa和氨基酸残基xb中的一个是(p)或(q)中x1为0的氨基酸残基时，氨基酸残基xa和氨基酸残基xb中的另一个不是l-半胱氨酸残基或d-半胱氨酸残基。
[0239]
(p)或(q)的氨基酸残基等不供给硫醚键的硫原子的氨基酸残基可以是存在于环状链段的n末端的，即氨基酸残基xa，也可以是存在于环状链段的c末端的，即氨基酸残基xb。与此相对应，(t)或(u)的氨基酸残基等的供给硫醚键的硫原子的氨基酸残基可以是存
在于环状链段的c末端的，即氨基酸残基xb，也可以是存在于环状链段的n末端的，即氨基酸残基xa。
[0240]
(p)或(q)的氨基酸残基也可以是选自以下(a)～(h)中的残基。
[0241]
[化学式编号8]
[0242][0243]
其中，式中，*是与相邻的氨基酸残基的键合位置，**是与硫醚键的配位氨基酸残基的硫原子的键合位置。
[0244]
(t)或(u)的氨基酸残基也可以选自由l-高半胱氨酸残基、d-高半胱氨酸残基、l-青霉胺残基、d-青霉胺残基、l-半胱氨酸残基及d-半胱氨酸残基组成的组中。
[0245]
在本发明中，发现即使通过能够得到比二硫化物键高的键合稳定性的硫醚键使氨基酸残基彼此交联而制作整联蛋白键合性环肽，根据硫醚键周边的结构，环肽的分子稳定性也不同。在本发明中，发现当氨基酸残基xa和氨基酸残基xb中的一个是半胱氨酸残基时，通过设计成氨基酸残基xa和氨基酸残基xb中的另一个氨基酸残基的α碳与半胱氨酸残基的硫原子被5个以上的原子隔开，能够得到更良好的分子稳定性。能够得到更良好的分子稳定
性的理由尚不明确，但推测为通过延长从交联部到环肽主链的碳链长，硫醚键的电子配置稳定，得到更高的键合稳定性。
[0246]
因此，例如，从氨基酸残基xa和氨基酸残基xb的可能组合中，去除上述(a)或(b)的氨基酸残基与l-半胱氨酸残基或d-半胱氨酸残基的组合。
[0247]
上述(a)的氨基酸残基与l-半胱氨酸残基键合的情况如下所示。
[0248]
[化学式编号9]
[0249][0250]
其中，式中，*是与相邻的氨基酸残基的键合位置。在(a)的氨基酸残基与l-半胱氨酸残基键合的情况下，α碳与半胱氨酸残基的硫原子被4个原子，即1个窒素原子及3个碳原子隔开。如此，将硫醚键的配位氨基酸残基的α碳与半胱氨酸残基的硫原子隔开的原子的数量是指连结α原子与硫原子的链上的原子数，不对与链上的原子键合的氢原子等未参加上述链的原子进行计数。
[0251]
氨基酸残基xa和氨基酸残基xb中，供给硫醚键的硫原子的一方的氨基酸残基也可以是具有硫原子的侧链上的碳原子数(存在分支的情况下，也包括分支部的总碳原子数)为1～10的氨基酸残基。其中，从得到更高的分子稳定性的观点出发，氨基酸残基xa和氨基酸
残基xb中，供给硫醚键的硫原子的一方的氨基酸残基优选为具有硫原子的侧链上的碳原子数(存在分支的情况下，也包括分支部的总碳原子数)为2～10的氨基酸残基。供给硫醚键的硫原子的氨基酸残基的侧链上的碳原子数可以是2～6，也可以是2～3。从该观点出发，供给硫醚键的硫原子的氨基酸残基例如也可以是青霉胺(侧链上的碳原子数为3)、高半胱氨酸(侧链上的碳原子数为2)等。另外，半胱氨酸残基的侧链上的碳原子数为1。对于青霉胺时的侧链上的碳原子数的计数如下所示。另外，在以下结构式中，*表示与相邻的氨基酸残基的键合位置。
[0252]
[化学式编号10]
[0253][0254]
氨基酸残基xa和氨基酸残基xb中，供给硫醚键的硫原子的一方的氨基酸残基也可以是主链与侧链上的硫原子之间被1～10的碳原子隔开的氨基酸残基。其中，从更稳定地得到整联蛋白键合性的观点出发，氨基酸残基xa和氨基酸残基xb中，供给硫醚键的硫原子的一方的氨基酸残基优选为主链与侧链上的硫原子之间被2～10的碳原子隔开的氨基酸残基。即，在源自α氨基酸的氨基酸残基的情况下，优选α碳与硫原子被2～10的碳原子隔开。主链与侧链上的硫原子之间可以被2～6的碳原子隔开，也可以被2～4的碳原子隔开。其中，“也可以是主链与侧链上的硫原子之间被x个碳原子隔开的氨基酸残基”是指作为侧链的起点的环肽主链上的碳原子与侧链上的硫原子之间通过由x个碳原子组成的链连结的氨基酸残基，不对从链分支的枝部分的碳原子数进行计数。并且，在由于环结构的存在等而存在多个路径的连结作为侧链的起点的环肽主链上的碳原子与侧链上的硫原子的链的情况下，对最短的链中的碳原子数进行计数。
[0255]
例如，青霉胺残基的α碳与硫原子被一个碳原子隔开。这是因为，在青霉胺残基中，如以下结构式所示，α碳与硫原子由-c(ch3)
2-连结，但未包含在连接α碳与硫原子的链中的两个甲基的碳原子不被计数。半胱氨酸残基也同样地，α碳与硫原子被一个碳原子隔开。在高半胱氨酸残基中，α碳与硫原子被两个碳原子隔开。
[0256]
另外，半胱氨酸及青霉胺的消旋化倾向比高半胱氨酸等其他含硫原子的氨基酸更强。因此，使用高半胱氨酸残基等满足对于碳原子数的上述规定的氨基酸时，与使用半胱氨酸、青霉胺等时相比，在立体结构的控制上有利，且能够减少整联蛋白键合性低的或不具有整联蛋白键合性的立体异构体的比例，因此具有能够提高每单位量的整联蛋白键合性的倾
向。
[0257]
另外，在以下结构式中，*表示与相邻的氨基酸残基的键合位置。
[0258]
[化学式编号11]
[0259][0260]
另外，即使在供给硫醚键的硫原子的氨基酸残基不是半胱氨酸残基的情况下，从得到更高的分子稳定性的观点出发，也优选氨基酸残基xa和氨基酸残基xb中的不供给硫醚键的硫原子的氨基酸残基的α碳与供给硫醚键的硫原子的氨基酸残基的硫原子被5个以上的原子隔开。例如，不管供给硫醚键的硫原子的氨基酸残基是否为半胱氨酸残基，不供给硫醚键的硫原子的氨基酸残基的α碳与供给硫醚键的硫原子的氨基酸残基的硫原子可以被5个～9个原子隔开，也可以被5个～7个原子隔开。
[0261]
在侧链上具有硫醇基的氨基酸残基与在侧链上具备具有卤素的有机基团的氨基酸残基之间，通过使硫醇基与具有卤素的有机基团反应而形成硫醚键的情况下，能够通过使环状化前的线状肽在中性、碱性的缓冲液中反应而形成硫醚键。例如，将含有线状肽的水溶液缓慢地滴加到tris-hcl(ph 8.5)缓冲液中并静置即可。由于硫醚键形成反应的反应性高，因此即使不特别加热，反应也在室温条件下迅速地进行。在环化反应中，根据反应条件，除了环肽以外，有时形成多个非环肽通过分子间键合连结的低聚物。因此，为了仅得到环肽，优选通过反相高效液相色谱等提纯环化反应后的肽。
[0262]
本发明所涉及的环肽可以包含环肽的n末端区域(第1链段)及环肽的c末端区域(第2链段)中的至少一个，第1链段及第2链段中的至少一个也可以具有含有侧链上具有固定化官能团的氨基酸残基的结构。固定化官能团也可以是氨基或硫醇基。侧链上具有固定化官能团的氨基酸残基也可以选自由l-赖氨酸残基、d-赖氨酸残基、l-半胱氨酸残基、d-半胱氨酸残基、l-高半胱氨酸残基及d-高半胱氨酸残基组成的组中。侧链上具有固定化官能团的氨基酸残基的细节能够参考由上述式ii中的x6或x7表示的氨基酸残基的说明。
[0263]
在本发明中，环肽的n末端区域及环肽的c末端区域中的至少一个也可以含有赖氨酸残基作为侧链上具有固定化官能团的氨基酸残基。更具体而言，环肽的n末端区域及环肽的c末端区域中的至少一个可以含有1个赖氨酸残基作为侧链上具有固定化官能团的氨基酸残基，或者可以连续含有2个以上，也可以连续含有2～10个，也可以连续含有2～5个。
[0264]
具有上述固定化官能团的氨基酸残基优选存在于本发明所涉及的环肽的第1链段
的n末端及第2链段的c末端中的至少一个中。例如，具有固定化官能团的氨基酸残基也可以连续地存在于本发明所涉及的环肽的第1链段的n末端及第2链段的c末端中的至少一个，具有固定化官能团的连续的氨基酸残基的数量例如可以是2～10残基，或2～5残基。更具体而言，赖氨酸残基也可以连续地存在于本发明所涉及的环肽的第1链段的n末端及第2链段的c末端中的至少一个，连续的赖氨酸残基的数量例如可以是2～10残基，或2～5残基。此时，第1链段或第2链段可以仅由连续的赖氨酸残基构成，也可以任意含有其他氨基酸残基。例如，在第1链段或第2链段中，在连续的赖氨酸残基与环状链段之间的区域可以不存在其他氨基酸残基，或者连续的赖氨酸残基与环状链段之间的区域也可以由选自1～20个、1～10个、1～5个、或1～3个丙氨酸残基、β丙氨酸残基、谷氨酸残基、天冬氨酸残基及甘氨酸残基中的氨基酸残基构成。或者，也可以在选自上述丙氨酸残基、β丙氨酸残基、谷氨酸残基、天冬氨酸残基及甘氨酸残基中的氨基酸残基与环状链段之间进一步夹持赖氨酸残基。
[0265]
第1链段可以由1～20个、1～10个、1～5个、或1～3个任意的氨基酸残基构成。第1链段可以含有或不含有赖氨酸残基。在不含有赖氨酸残基的情况下，也可以由选自1～20个、1～10个、1～5个、或1～3个丙氨酸残基、β丙氨酸残基、谷氨酸残基、天冬氨酸残基及甘氨酸残基中的至少一种氨基酸残基构成。同样地，第2链段可以由1～20个、1～10个、1～5个、或1～3个任意的氨基酸残基构成。第2链段可以含有或不含有赖氨酸残基。在不含有赖氨酸残基的情况下，也可以由选自1～20个、1～10个、1～5个、或1～3个丙氨酸残基、β丙氨酸残基、谷氨酸残基、天冬氨酸残基及甘氨酸残基中的至少一种氨基酸残基构成。
[0266]
关于本发明所涉及的环肽，通过实施例中的“(2)环肽的固定”及“(3)整联蛋白键合性的评价”中记载的方法测定的解离常数(关于与整联蛋白的键合的解离常数)优选为200nm以下，更优选为100nm以下，进一步优选为50nm以下。解离常数越接近0nm越优选，从实际上的观点出发，作为能够与上述上限值组合的下限值，例如可举出0.1nm或0.5nm。并且，关于本发明所涉及的环肽，通过实施例中的“(4)分子稳定性的评价”中记载的方法测定的残留率优选为30％以上，更优选为50％以上，进一步优选为70％以上。残留率越接近100％越优选，因此作为能够与上述下限值组合的上限值，可举出100％。
[0267]
只要是识别rgd序列的整联蛋白，本发明中的整联蛋白没有特别限定。在实施例中，使用整联蛋白αvβ5进行整联蛋白键合性的评价，但整联蛋白并不限定于此，本发明所涉及的环肽也能够与识别整联蛋白αvβ3等rgd序列的整联蛋白键合。
[0268]
并且，在本发明中，将耐碱性作为指标测定了环肽的分子稳定性，但环肽的分子稳定性在对于碱以外的刺激的耐性，例如在x射线耐性、γ射线耐性、紫外线耐性、耐热性、耐化学性方面也同样地发挥。这是因为，分子稳定性基本上表示分子在自由能方面更稳定。例如，由于耐碱性优异，在细胞提纯中使用将本发明所涉及的环肽用作亲和配体的亲和色谱用担体时，即使反复用碱清洗，也维持整联蛋白键合性，能够减少细胞分离成本。
[0269]
在以下表3～表7中记载本发明所涉及的环肽的例子。表3～表7中记载的环肽1～165均为所有的氨基酸残基不具有l-氨基酸残基或甘氨酸等光学异构体的氨基酸残基。表中，hcy表示高半胱氨酸残基，pen表示青霉胺残基。dab(acetyl：乙酰基)表示2-氨基-4-乙酰氨基-丁酸残基，dap(acetyl)表示2-氨基-3-乙酰氨基-丙酸残基，orn(acetyl)表示n-δ-乙酰基-鸟氨酸残基，lys(acetyl)表示n-ε-乙酰基-赖氨酸残基。含有这些乙酰基的氨基酸残基中的乙酰基中的甲基上的氢原子中的一个被作为硫醚键的键合对象的氨基酸残基中
的与硫原子的键取代，形成基于硫醚键的分子内交联。并且，在交联部氨基酸残基的栏中，省略记载乙酰基。尽管未在表中记载，但环肽49～环肽53具有c末端的羧酸与nh2酰胺键合而成的酰胺化结构的c末端。并且，环肽51中的βa表示β-丙氨酸残基，环肽68的hmy表示高酪氨酸残基，环肽73的hms表示高丝氨酸残基。在表3～表7中，括号内记载的氨基酸残基表示与基于硫醚键的分子内交联相关的氨基酸残基。
[0270]
[表3]
[0271]
[0272]
[表4]
[0273][0274]
[表5]
[0275][0276]
[表6]
[0277][0278]
[表7]
[0279][0280]
这些环肽中，从分子稳定性的观点出发，优选环肽1～137及环肽144～165。并且，从分子稳定性及整联蛋白键合性的平衡的观点出发，更优选环肽1～127及环肽144～165。进一步优选环肽1、92、108及160，更进一步优选环肽92、108及160。在适用上述加成、缺失或取代的氨基酸残基的规定，或上述序列同源性的规定时，也优选将上述优选的环肽中的环状链段的交联部氨基酸之间的区域适用于基准序列。
[0281]
另外，序列的变化也可以将环肽整体视为基准序列来适用。因此，对序列号2～序列号166中的任一个氨基酸序列加成、缺失或取代了氨基酸残基的氨基酸基只要满足本发明所涉及的环肽的必要条件，也能够使用。其中，环状链段中的rgd区域不得改变。在对序列号2～序列号166中的任一个氨基酸序列进行氨基酸残基的加成、缺失或取代的情况下，加成、缺失或取代的氨基酸残基的总数优选为1～15，更优选为1～10，进一步优选为1～5，更进一步优选为1～3，更加进一步优选为1或2。
[0282]
本发明所涉及的环肽优选与序列号2～序列号166中的任一个氨基酸序列具有70％以上的序列同源性，更优选具有80％以上的序列同源性，进一步优选具有90％以上的序列同源性。另外，例如与序列号2的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列的范围也包含序列号2的氨基酸序列本身。
[0283]
本发明还提供基材及包含本发明所涉及的环肽的细胞支架材料(以下，也称为本发明所涉及的细胞支架材料)。由于细胞在生体内由细胞外基质支承，因此通过使用再现相同的状态的细胞支架材料，能够更良好地培养细胞。作为用于细胞培养的上述基材，可举出
由聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯等生物可降解性聚酯类、胶原蛋白或其热变性体的明胶、纤连蛋白等糖蛋白质、或透明质酸、甲壳素、藻酸等多糖类构成的基质。例如，通过使本发明所涉及的环肽中的固定化官能团与基材中的官能团反应，能够使本发明所涉及的环肽与基材键合。例如，在本发明所涉及的环肽具有赖氨酸残基的氨基作为固定化官能团的情况下，通过使氨基与基材上的羧基反应而形成酰胺键，能够将环肽固定在基材上。通过使用这种方法，能够得到本发明所涉及的环肽与基材的表面键合而成的细胞支架材料。本发明所涉及的环肽的量没有特别限定，相对于基材，可以是0.01质量％～100质量％，也可以是0.1质量％～50质量％。
[0284]
本发明所涉及的细胞支架材料能够赋予到培养皿、烧瓶、板(例如，聚苯乙烯孔板)、培养袋、中空纤维膜、珠等任意的培养工具上。由于本发明所涉及的细胞支架材料含有本发明所涉及的环肽，因此与整联蛋白具有良好的键合性，细胞能够良好地粘附在细胞支架材料上。其中，作为成为培养对象的细胞，只要是表现整联蛋白的生物的细胞，则没有特别限定，可以是任意的动物细胞，也可以是任意的脊椎动物细胞，也可以是任意的哺乳类细胞，也可以是人的细胞或人以外的哺乳类细胞。作为细胞的例子，可举出胚胎干(es)细胞、人工多能性干(ips)细胞、围产期干细胞、源自羊水的干细胞(afs c)、任意起源的间叶系干细胞(msc)、任意组织型的已确定分化方向的前体细胞或成人细胞、成熟细胞、正常细胞、患病细胞、肿瘤细胞等。作为更具体的例子，可举出肝脏细胞、实质细胞、星形细胞、内皮细胞、肝细胞、胆管细胞、胆树细胞、胰腺细胞等。这些细胞的例示对于后述的细胞分离材料及培养基也相同。
[0285]
本发明还提供保持材料及包含本发明所涉及的环肽的细胞分离材料(以下，也称为本发明所涉及的细胞分离材料)。由于本发明所涉及的细胞分离材料包含本发明所涉及的环肽，因此能够与细胞表面的整联蛋白键合，捕捉细胞。因此，通过将本发明所涉及的细胞分离材料例如用作亲和色谱，能够有效地从细胞悬浊液中分离细胞。
[0286]
例如，通过使本发明所涉及的环肽中的固定化官能团与保持材料中的官能团反应，能够使本发明所涉及的环肽与保持材料键合。例如，在本发明所涉及的环肽具有赖氨酸残基的氨基作为固定化官能团的情况下，通过使氨基与保持材料上的羧基反应而形成酰胺键，能够将环肽固定在保持材料上。
[0287]
保持材料例如可以由选自琼脂糖、葡聚糖、淀粉、纤维素、普鲁兰多糖、甲壳素、壳聚糖、三乙酸纤维素及二乙酸纤维素等多糖类及其衍生物、以及聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚烷基乙烯醚及聚乙烯醇等乙烯系聚合物等中的材料构成。这些材料也可以形成交联结构。交联结构具有提高机械强度的倾向。保持材料优选由上述材料中的一种或两种以上的材料组成。
[0288]
并且，保持材料优选为多孔质，更优选为多孔膜或多孔粒子，进一步优选为多孔粒子。
[0289]
也能够将在水不溶性的保持材料上固定本发明所涉及的环肽的细胞分离材料用于亲和色谱。作为水不溶性的保持材料，例如可举出结晶性纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖及交联普鲁兰多糖等多糖类、丙烯酸酯系聚合物及苯乙烯系聚合物等有机保持材料、玻璃珠及硅胶等无机保持材料、以及通过它们的组合而得到的有机-有机、有机-无机等复合保持材料等。作为水不溶性保持材料，从耐碱性的观点出发，更优选多糖类或丙
烯酸酯系聚合物，进一步优选琼脂糖或纤维素等多糖类。作为能够用作水不溶性保持材料的市售品，例如可举出作为多孔纤维素凝胶的cellufine gcl2000(jnc corporation制造)(cellufine为注册商标)、cellufine max(jnc corporation制造)、通过共价键将烯丙基葡聚糖与亚甲基双丙烯酰胺交联而成的sephacryl s-1000sf(ge healthcare制造)(sephacryl为注册商标)、作为丙烯酸酯系保持材料的toyopearl(tosoh corporation制造)(toyopearl为注册商标)、toyopearl af-carboxy-650(tosoh corporation制造)、toyope arl gigacap cm-650(tosoh corporation制造)、作为琼脂糖系交联保持材料的sepharose cl4b(ge healthcare制造)(sepharose为注册商标)及作为用环氧基活化的聚甲基丙烯酰胺的eupergit c250l(sigma-aldrich co.llc制造)(eupergit为注册商标)等。其中，本发明中的水不溶性保持材料并不仅限定于这些保持材料或活化保持材料。并且，本发明中使用的水不溶性保持材料从本吸着材料的使用目的及方法来看，优选表面积大，优选为具有多个适当的大小的细孔的多孔质。作为保持材料的形态，没有特别限定，可以是珠状、纤维状、膜状及中空丝状等任意形状，能够选择任意的形态。
[0290]
作为将本发明所涉及的环肽固定在水不溶性保持材料上的方法，如上所述，可举出使用赖氨酸残基的氨基的固定化方法，但并不限定于此。通常能够采用将蛋白质或多肽固定在保持材料上时采用的方法。例如，可举出使保持材料与溴化氰、环氧氯丙烷、二缩水甘油醚、甲苯磺酰氯、三氟代乙烷磺酰氯及肼等反应而使保持材料活化或将反应性官能团导入到保持材料表面，与本发明所涉及的环肽反应、固定的方法、并且在保持材料和本发明所涉及的环肽存在的系统中加入如碳二亚胺那样的稠合试剂或如甘油醛那样在分子中具有多个官能团的试剂进行稠合、交联的固定化。
[0291]
在将本发明所涉及的环肽固定在保持材料上时，优选将本发明所涉及的环肽溶解(分散)在水系溶剂(水系分散介质)或有机系溶剂(有机系分散介质)中。作为水系溶剂(水系分散介质)，没有特别限定，例如能够举出hep es(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid；羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲液、乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、三盐酸缓冲液等。有机系溶剂(有机系分散介质)没有特别限定，优选为极性有机溶剂，尤其优选dmso(dimethyl sulfoxide；二甲基亚砜)、dmf(n,n-dimethylformamide；n,n二甲基甲酰胺)或醇，例如可举出甲醇、乙醇、ipa(isopropyl alcohol；异丙醇)、tfe(2,2,2-trifluoroethanol；2,2,2-三氟乙醇)及hfip(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol；1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇)等。
[0292]
使本发明所涉及的环肽固定化时的ph条件没有特别限定，可以是酸性、中性及碱性中的任一种，例如能够根据所使用的溶剂(分散介质)适当设定。
[0293]
例如，在设为碱性的情况下，也可以将dbu(diazabicycloundecene；二氮杂二环)或tea(triethylamine；三乙基胺)等碱添加到dmso(dimethyl sulf oxide；二甲基亚砜)或醇中。
[0294]
将上述细胞分离材料设为亲和色谱用填充剂时的本发明所涉及的环肽的密度没有特别限定，优选为0.1～1000mmol/填充剂1l，更优选为0.1～100mmol/填充剂1l，进一步优选为0.5～20mmol/填充剂1l。若在该范围内，则本发明所涉及的环肽的使用量与细胞分离性能的平衡良好，能够以更低成本有效地分离细胞。
[0295]
只要是表现整联蛋白的生物的细胞，由本发明所涉及的细胞分离材料分离的细胞
没有特别限定，可以是任意的动物细胞，也可以是任意的脊椎动物细胞，也可以是任意的哺乳类细胞，也可以是人的细胞或人以外的哺乳类细胞。
[0296]
本发明还提供培养成分及包含本发明所涉及的环肽的培养基(以下，也称为本发明所涉及的培养基)。通过在培养基中含有本发明所涉及的环肽，产生在培养基中培养的细胞的整联蛋白与环肽的键合，通过传递来自整联蛋白的信号，能够得到经由凋亡抑制的细胞生存率上升等效果。培养成分是指用于培养细胞的培养基成分。其中，作为成为培养对象的细胞，只要是表现整联蛋白的生物的细胞，则没有特别限定，可以是任意的动物细胞，也可以是任意的脊椎动物细胞，也可以是任意的哺乳类细胞，也可以是人的细胞或人以外的哺乳类细胞。作为培养成分使用的培养基只要根据培养的细胞的种类选择适当的培养基即可，例如能够举出dmem(达尔贝科改变伊格尔培养基)、mem(伊格尔最小必须培养基)、f12、ham、rpmi1640、mcdb(mcdb102、104、107、131、153、199等)、l15、skbm(注册商标)、ritc80-7、mesenpro(life technologies corporation)等。
[0297]
作为培养成分，可以将上述培养基等培养基直接以标准的组成(例如，以市售的状态)使用，也可以根据细胞种类或细胞条件适当变更其组成。因此，培养成分并不限定于公知的组成的成分，也可以是追加、去除、增量或减量一种或两种以上的成分的成分。
[0298]
作为培养成分中所包含的氨基酸，没有特别限定，例如可举出l-精氨酸、l-胱氨酸、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-组氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸、l-缬氨酸等。
[0299]
作为培养成分中所包含的维生素类，没有特别限定，例如可举出d-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、核黄素、硫胺、吡哆醇、生物素、硫辛酸、维生素b12、腺嘌呤、胸苷等。
[0300]
作为培养成分中所包含的电解质，没有特别限定，例如可举出cacl2、kcl、mgso4、nacl、nah2po4、nahco3、fe(no3)3、feso4、cuso4、mnso4、na2sio3、(nh4)6mo7o
24
、navo3、nicl2、znso4等。
[0301]
关于培养成分，除了这些成分以外，还可以含有d-葡萄糖等糖类、丙酮酸钠、酚红等ph指示剂、腐胺、抗生素等。
[0302]
培养成分可以含有血清，也可以不含有血清。本发明所涉及的培养基中的血清的含量优选为0容量％以上且30容量％以下，更优选为0容量％以上且10容量％以下，进一步优选为0容量％以上且5容量％以下，尤其优选为0容量％以上且2容量％以下。
[0303]
本发明所涉及的培养基中的本发明所涉及的环肽的含量没有特别限定，例如是0.01ng/ml～10mg/ml，也可以是0.1ng/ml～1mg/ml。在本发明所涉及的培养基中，与细胞支架材料、细胞分离材料的情况不同，不需要固定环肽。
[0304]
如以上说明，根据本发明，能够提供一种与整联蛋白的键合性优异，且分子稳定性，例如耐碱性优异的环肽、以及含有上述环肽的细胞支架材料、细胞分离材料及培养基。
[0305]
实施例
[0306]
通过以下实施例对本发明所涉及的实施方式进一步具体地进行说明，但实施方式并不限定于此。
[0307]
(1)环肽的合成
[0308]
使用全自动肽合成装置(pssm-8，shimadzu corporation制造)分别合成了表3～
表7中记载的环肽1～146、以及以下表8中记载的环肽147及148。另外，当对于在实施例中制作的环肽中所包含的氨基酸残基存在光学异构体时，氨基酸残基均为l体。即，例如，在实施例中制作的肽中的d的标记表示l-天冬氨酸残基。在表8中，括号内记载的氨基酸残基表示与基于硫醚键的分子内交联相关的氨基酸残基。
[0309]
[表8]
[0310][0311]
(2)环肽的固定
[0312]
在ge healthcare制造的表面等离子体激元共振装置即biacore3000中设置市售的cm5(羧甲基葡聚糖导入型，ge healthcare制造))传感器芯片，使spr(surface plasmon resonance；表面等离子体激元共振)用hepes(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid；羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲液(20mm hepes-hcl、150mm nacl、ph7.4)以10μl/分钟的流速稳定，添加0.2m的edc(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide；1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和0.04m的nhs(n-hydroxysuccinimide；n-羟基琥珀酰亚胺)混合水溶液70μl。其中，浓度的单位m表示mol/l，以下相同。然后，将用hepes缓冲液稀释至0.2g/l的上述各环肽的试样液20μl供给到传感器芯片，然后，用乙醇胺溶液实施封闭处理，用氢氧化钠水溶液清洗，进行了固定。其中，仅对于具有作为固定化官能团的氨基的赖氨酸残基数为0的环肽125、126及127，将供给到传感器芯片时的试样液的量设为500μl，而不是20μl。而且，在该传感器芯片的其他流路中不固定试样，添加0.2m的edc和0.04m的nhs混合水溶液70μl后，进行了封闭处理和清洗处理。以下将所得到的固定化传感器芯片称为“固定化传感器芯片a”。
[0313]
(3)整联蛋白键合性的评价
[0314]
在上述(1)中制作的固定化传感器芯片a的各流路中，在25℃下，添加10分钟使用加入氯化镁以达到5mm的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes)缓冲液稀释到30nm的人整联蛋白αvβ5后，将上述羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(含有5mm的氯化镁)作为运行缓冲液流动30分钟，利用biacore3000进行了测定。然后，通过使0.5m的edta水溶液在各流路中流动10分钟，进行了去除人整联蛋白αvβ5的再生处理。进一步也对100nm的人整联蛋白αvβ5、300nm的人整联蛋白αvβ5及1000nm的人整联蛋白αvβ5同样地进行由上述添加整联蛋白10分钟、使运行缓冲液流动30分钟、通过biacore3000进行测定及通过0.5m的edta水溶液进行再生处理组成的测定处理。根据使各浓度的人整联蛋白αvβ5流动时的已固定环肽的流路中的基于biacore3000的测定值与未固定环肽的流路中的基于biacore3000的测定值的差分，计算环肽与人整联蛋白αvβ5的解离常数，按照下述的评价基准，对整联蛋白键合性进行了评价。优选为评价基准a、b或c。
[0315]
(解离常数的评价基准)
[0316]a……
解离常数为50nm以下。
[0317]b……
解离常数超过50nm，且为100nm以下。
[0318]c……
解离常数超过100nm，且为200nm以下。
[0319]d……
解离常数超过200nm。
[0320]
将评价结果示于表9～表13的对应栏。
[0321]
通过使用显示等级a～c的整联蛋白键合性的环肽，能够进行环肽与整联蛋白的特异性键合，能够进行更有效的细胞控制。
[0322]
(4)分子稳定性的评价
[0323]
环肽的分子稳定性通过利用lc/ms(liquid chromatography mass spectro scopy；液相色谱质谱法)分析进行碱处理的环肽水溶液来进行了评价。
[0324]
碱处理通过以下方法进行。制备500μm的环肽水溶液，在该水溶液中加入当量的1m氢氧化钠水溶液，在15℃下温育3小时，由此得到碱处理环肽水溶液。将碱处理前的环肽的lc/ms中的所有峰的总面积设为100％，通过求出碱处理环肽水溶液的lc/ms中的所有峰的总面积的比例，计算环肽残留率，按照以下的评价基准，评价了分子稳定性。优选为评价基准a、b或c。
[0325]
(环肽的残留率的评价基准)
[0326]a……
环肽的残留率为70％以上
[0327]b……
环肽的残留率为50％以上且小于70％
[0328]c……
环肽的残留率为30％以上且小于50％
[0329]d……
环肽的残留率小于30％
[0330]
另外，在分子稳定性的评价中使用的lc/ms设为以下条件。
[0331]
·
lc装置：prominence系列(泵、柱烘箱、自动取样器、检测器)(shimadzu corporation制造)
[0332]
·
ms检测器：lc/ms2010ev(shimadzu corporation制造)
[0333]
·
柱：cadenza cd-c18，内径2.0mm
×
长度250mm，粒径3μm(intact corporation制造)
[0334]
·
洗脱液a：含有10mm甲酸铵作为溶解物，溶剂为水100％的溶液(ph3)
[0335]
·
洗脱液b：含有10mm甲酸铵作为溶解物，溶剂为乙腈/水＝90/10的溶液(ph3)
[0336]
·
流速：0.2ml/分钟
[0337]
·
注入量：4μl
[0338]
·
梯度：0-30％：洗脱液b(0-30分钟)、100％：洗脱液b(30-40分钟)、0％：洗脱液b(40-60分钟)
[0339]
·
柱温度：45℃
[0340]
·
离子化法：esi(electrospray ionization；电喷雾电离)正，esi负
[0341]
将评价结果示于表9～表13的对应栏。
[0342]
通过使用显示等级a～c的分子稳定性的环肽，即使长期或反复使用环肽也能够与细胞特异性地键合，即使在长期或反复的工艺中使用时也能够控制细胞，能够进一步减少成本。
[0343]
将环肽1～167的整联蛋白键合性的评价结果及分子稳定性的评价结果汇总示于以下表9～表13中。另外，与表3～表7同样地，在交联部氨基酸残基的栏中，省略记载乙酰基。
[0344]
[表9]
[0345][0346]
[表10]
[0347][0348]
[表11]
[0349][0350]
[表12]
[0351][0352]
[表13]
[0353][0354]
由表9～表13的结果可知，本发明所涉及的环肽1～165具有实用上充分的整联蛋白键合性及实用上充分的分子稳定性。本发明所涉及的环肽1～165在分子稳定性的评价中的残留率的值均高于35％。另一方面，在半胱氨酸残基的硫原子与其他氨基酸残基的α碳由4个以下的原子隔开的环肽166及环肽167中，未得到实用上充分的分子稳定性。尤其，环肽166及环肽167在分子稳定性的评价中的残留率的值均小于25％。
[0355]
并且，具有硫原子的侧链上的碳原子数(存在分支的情况下，也包括分支部的总碳原子数)为2～10的氨基酸残基是分子内交联的一个氨基酸残基的环肽1～137及环肽144～165具有比具有硫原子的侧链上的碳原子数为1的半胱氨酸残基是分子内交联的一个氨基酸残基的环肽138～143更提高的分子稳定性。并且，例如从环肽116与环肽131的比较可知，在主链的碳原子与侧链上的硫原子之间由2～10的碳原子隔开的氨基酸残基是分子内交联的一个氨基酸残基的环肽与在主链的碳原子与侧链上的硫原子之间由1个碳原子隔开的青霉胺残基等氨基酸残基是分子内交联的一个氨基酸残基的情况相比，具有显示提高的整联蛋白键合性的倾向。
[0356]
接着，使用所得到的肽制作细胞支架材料，进行了ips细胞培养实验。
[0357]
(聚苯乙烯板的表面处理)
[0358]
使用等离子体处理装置(sakigake-semiconductor co.,ltd.制造scb-106)，在氨气中，在气体压力10pa、输出700w、处理时间5分钟的条件下，实施了聚苯乙烯制6孔板(corning incorporated制造)的表面处理。
[0359]
(cmd涂层孔的制作)
[0360]
在羧甲基葡聚糖钠(meito sangyo co.,ltd.制造，商品名：“cmd”，分子量：100万，以后也称为“cmd”)0.5g中加入蒸馏水9.5g，通过搅拌使cmd充分地溶解，制备出5重量％的cmd溶液。
[0361]
接着，在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(nacalai tesque,inc.制造，以后也称为“edc”)383.4mg中加入蒸馏水1ml，制备出edc溶液。接着，在n-羟基琥珀酰亚胺(fujifilm wako pure chemical corporation制造，以后也称为“nhs”)57.5mg中加入蒸馏水1ml，制备出nhs溶液。
[0362]
接着，在上述中制备的cmd溶液10g中加入上述edc溶液0.05ml及上述nhs溶液0.05ml并搅拌，将所得到的含cmd的涂层液1ml立即滴加到上述中表面处理的聚苯乙烯板的一个孔中。将聚苯乙烯板在室温下静置1小时后，用蒸馏水充分地清洗孔，去除含cmd的涂层液，得到cmd涂层孔。
[0363]
(配体涂层孔的制作)
[0364]
在0.2mg的环肽92中加入hbs-n缓冲液(ge yokogawa medical systems ltd.制造)1ml，制备出环肽溶液。接着，在76.7mg的edc中加入蒸馏水1ml，制备出edc溶液。接着，在11.5mg的nhs中加入蒸馏水1ml，制备出nhs溶液。接着，在乙醇胺(bio rad公司制造，商品名“proteon乙醇胺hcl”)1ml中加入蒸馏水1ml，制备出乙醇胺溶液。
[0365]
接着，在上述中制备的edc溶液0.5ml中加入上述nhs溶液0.5ml并搅拌，将所得到的混合液1ml立即滴加到上述cmd涂层孔。将聚苯乙烯板静置7分钟后，用蒸馏水充分地清洗孔，从孔中去除混合液。而且，将上述环肽溶液1ml滴加到孔中，静置25分钟后，用蒸馏水充分地清洗孔，去除环肽溶液。而且，将乙醇胺溶液1ml滴加到孔中，静置7分钟后，用蒸馏水充分地清洗孔，去除乙醇胺溶液，得到具有环肽92固定在作为基材的cmd上的细胞支架材料的孔(以下，称为“配体涂层孔”)。
[0366]
(γ射线灭菌处理)
[0367]
将在上述中制作的配体涂层孔密闭到灭菌袋中，通过radia industryco.,ltd.的照射设施1号机在剂量25kgy的条件下实施了γ射线灭菌处理。由此，得到已照射γ射线的细胞支架材料(以下，称为“已照射的细胞支架材料a”)。
[0368]
(肽的ips细胞培养性能的评价)
[0369]
ips细胞使用了由fujifilm cellular dynamics,inc.建立的01434克隆。以split rate＝1:6将ips细胞播种到表面具有已照射的细胞支架材料a的培养聚苯乙烯板上，在无饲养细胞的es及ips细胞培养用培养基(stem cell technologies制造，产品名：mtesr1)中培养3天后，通过利用细胞解离试剂(thermo fisher公司制造，产品名tryple select)的处理将ips细胞单细胞剥离并回收。从所得到的细胞悬浊液中，使用生死细胞自动分析仪(beckman coulter制造，产品名：vi-cell xr)测量细胞数，判定细胞是否增殖。按照以下判定基准评价了所得到的结果。将评价结果示于表14中。另外，表14中，hcy表示高半胱氨酸残基，dab(acetyl)表示2-氨基-4-乙酰氨基-丁酸残基，dap(acetyl)表示2-氨基-3-乙酰氨
基-丙酸残基。
[0370]
ips细胞培养性能的评价基准
[0371]
a：确认了ips细胞的增殖。
[0372]
b：未确认到ips细胞的增殖。
[0373]
[表14]
[0374][0375]
由表14所示的结果可知，在使用含有相当于本发明所涉及的环肽的环肽92的细胞支架材料的情况下ips细胞增殖，与此相对，在使用含有环肽167(比较例)的环肽的细胞支架材料的情况下，ips细胞未增殖。这表示，与比较例的含有环肽的细胞支架材料相比，含有本发明所涉及的环肽的细胞支架材料对γ射线等的稳定性高，即使在进行了利用γ射线的灭菌处理等的情况下，也具有良好的细胞增殖能力。
[0376]
于2019年6月11日申请的日本专利申请2019-108962号的公开的全部内容通过参考而引入本说明书中。
[0377]
本说明书所记载的全部文献、专利申请以及技术标准，与具体且分别地记载将各个文献、专利申请以及技术标准通过参考而引入的情况相同程度地，通过参考而引入本说明书中。