GhAOC4基因敲除创造棉花雄性不育和保持两用系的方法与流程

ghaoc4基因敲除创造棉花雄性不育和保持两用系的方法
技术领域
1.本发明属于作物分子育种技术领域，具体涉及ghaoc4基因敲除创造棉花雄性不育和保持两用系的方法。


背景技术：

2.棉花是重要的经济作物，具有明显的杂交优势。陆地棉品种间杂交种的强优势组合可增产20％～30％。在上个世纪90年代我国就培育出一大批抗虫优质的常规杂交棉品种，例如中国农业科学院棉花研究所的培育的“中棉所”系列，华中农业大学培育的的“华杂棉”系列，山东省棉花研究中心培育的“鲁棉研”系列，湖南省棉花研究所培育的“湘杂棉”系列等等，这些品种在生产上都有大面积推广应用。在棉花雄性不育利用方面，细胞质雄性不育系存在胞质对产量有不利影响、育性恢复源狭窄而导致杂种优势不够强等问题，因此未能实现大面积的推广应用。而生态敏感型雄性不育，在棉花中也鉴定了一系列，如：特棉s-1和中9106等。特棉s-1是温敏不育系类型，材料在日平均温度高于27℃生长时表现为不育(刘志等，2007)。马建辉等将中040029材料通过航天诱变育种获得了具有芽黄标记的光敏雄性不育材料中9106，所得航天育种材料在光照周期为13至14.5小时的长日照条件下生长时表现为不育(马建辉,2013)。虽然生态敏感型的雄性不育较稳定，但由于环境复杂难以随意控制，目前在棉花中进行大规模制种还存在较大的问题和困难。相比而言，细胞核雄性不育系是棉花杂种优势利用的主要类型，目前棉花杂种优势主要利用的是洞a和ms5ms6两种类型的细胞核雄性不育系。洞a细胞核不育系是四川省农业科学院于1972年发现，随后培育出“川杂”系列核不育杂交种，据报道杂种f1代一般可增产10％左右，是棉花杂种优势利用的优良品系(唐雯，2008)。ms5ms6不育系由中国农业科学院棉花研究所引进，通过杂交和回交改良，培育出的中棉所38、南农6号、南农9号和南农98-4等杂交棉品种(石雅丽等，2013)。但细胞核雄性不育系有一个致命的缺陷，就是不育系的繁种过程中存在50％的可育株，需要人工拔除，不仅增加了制种成本，而且往往由于可育株清除不彻底，降低了制种纯度，增加了生产的风险。因此创造出育性稳定可靠的棉花雄性不育系且不育系繁种过程不存在50％的可育株，无需人工拔除，将给杂交棉的生产带来历史性突破。
3.现有的crispr/cas9系统介导的基因编辑在植物不育系的创制上已经得到有效应用。例如：zhou等在水稻中创造了新的不含转基因元件的tms5温敏不育系，建立了tms5ab二元体，可用于水稻籼、粳两个亚种的温敏不育系快速培育(zhou et al.2016)。singh等对小麦ms45的3个同源染色a、b和d的同源基因进行crispr/cas9编辑，得到三个同源位点同时突变的突变体，突变体表现为雄性不育(singh et al.2018)。chen等通过基因编辑技术，对玉米的育性相关基因ms8进行了编辑，得到新的玉米雄性不育系(chen et al.2018)。因此通过基因编辑技术创造棉花雄性不育系是一个便捷有效的手段。
4.到目前为止，尚未见到有关ghaoc4基因与棉花雄性育性有关的报道，也没有利用该基因与crispr/cas9系统在棉花中创制雄性不育系的报道，更没有利用所述基因创制突变体实现棉花“一系两用”创造棉花新种质的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服棉花现有杂交育种中细胞核雄性不育系繁种过程中存在50％的可育株，需要人工拔除的问题，提供一种创造棉花雄性不育和保持两用系的方法，从而实现“一系两用”创制棉花新种质材料的目的。
6.在本发明提出以前，申请人发现敲除棉花丙二烯氧化环化酶基因(ghaoc4)的突变体ghaoc4中花药内源茉莉酸含量降低，在常温下表现出雄性不育表型。为了解决上述技术难题，本发明利用ghaoc4基因被敲除获得一种ghaoc4突变的棉花雄性不育系突变体(ghaoc4)，利用该突变体材料在棉花花蕾的早期通过外施适当浓度的茉莉酸甲酯(meja)，所述ghaoc4的突变体材料的雄性育性可以被恢复，所得的下一代可保持不育性性状，即可以实现不育系与保持系之间的转换，可以克服传统人工去雄方法的缺陷。同时，也克服了传统细胞核不育系繁种过程中需拔除50％的可育株的问题，大大降低了制种成本，增加了制种纯度，对棉花杂种优势的开发利用具有重大意义。
7.本发明的技术方案如下所述：
8.1.敲除ghaoc4基因,创制棉花雄性不育系
9.(1)在陆地棉中筛选得到可以作为分子标记的ghaoc4基因的两个dna片段，其中第一个dna片段被命名为ghir_d08g004260.1，该片段的核苷酸序列如seq id no：1所示，第二个片段被命名为ghir_a08g004050.2，该片段的核苷酸序列如seq id no：2所示。以这两个dna片段的保守区域设计共有的靶位点，即sgrna1，以特异区域设计只靶向ghir_d08g004260.1片段的sgrna2；
10.sgrna1的核苷酸序列如下所示：
11.sgrna1：tcgtttaagtcagaaacc，
12.sgrna2的核苷酸序列如下所示：
13.sgrna2：ccagctgttaagccgctcc；
14.上述两个靶标位点位于seq id no：1所示序列位置的74-97bp处和465-488bp处。在这两条sgrna的引导下，编辑元件可以准确寻找到需要编辑的位置，可对目的基因进行定点突变。
15.(3)利用重叠延伸的pcr方法将sgrna1-guidrna和sgrna2-guidrna串连(串连的方法为本领域通用的重叠延伸pcr方法)起来，形成有两个靶位点信息的功能元件，然后通过常规一步克隆法构建到报道的crispr/cas9载体prgeb32-ghu6.7-nptⅱ上(载体来源：wang et al.2018)，得到转化载体ghu6.7::sgrna1-sgrna2。
16.(4)利用农杆菌介导的遗传转化方法转化棉花(例如可以采用棉花陆地棉品种豫668，但是实施本发明不限于该棉种和品种)，得到一种转基因棉花材料。
17.(5)通过t0代单株高通量测序验证ghaoc4基因产生编辑并无脱靶现象，获得ghaoc4突变体。
18.(6)通过对t0代ghaoc4基因突变体单株进行分析，发现sgrna1位点基因编辑效率在80％以上单株表现为雄性完全败育。
19.(7)通过石蜡切片、扫描电镜和透射电镜发现ghaoc4基因突变体可以正常形成四分体小孢子，但小孢子缺少内容物，并且内容物会逐渐降解，小孢子形成空腔，以致最终皱缩，不能发育成有活性的花粉。
20.(8)将t0代完全不育材料与野生型(即非转基因)陆地棉品种杂交获得杂交f1代，其杂交后代中含有cas9蛋白存在且hi-tom检测sgrna1靶标位点突变率在80％以上的材料表现为雄性完全败育，说明其不育性是可以遗传的。
21.2.含ghaoc4突变基因的棉花雄性不育系与保持系之间的转换
22.(1)通过激素测定发现，含ghaoc4基因的棉花雄性不育系花药内源茉莉酸含量降低。
23.(2)对恢复ghaoc4突变基因的棉花雄性不育系育性的外源茉莉酸甲酯喷施浓度进行摸索，分别将不同质量的茉莉酸甲酯溶解于0.05％吐温20中，配制成0mol/l，5
×
10-6
mol/l，5
×
10-4
mol/l和5
×
10-2
mol/l的茉莉酸甲酯溶液，喷施于ghaoc4突变体早期花蕾上，进行表型观察，确定5
×
10-4
mol/l的茉莉酸甲酯溶液为最适的喷施浓度，可以恢复ghaoc4突变体雄性不育表型且不会造成早期花蕾脱落。
24.(3)获得喷施5
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10-4
mol/l茉莉酸甲酯溶液后雄性育性恢复正常的ghaoc4突变体的自交后代，后代雄性保持不育，不产生可育株，无需拔除可育株。
25.本发明可在棉花杂交种制种中应用。
26.本发明的有益效果如下：
27.(1)本发明利用构建的ghu6.7::sgrna1-sgrna2转化载体同时突变棉花中ghir_d08g004260.1基因片段和ghir_a08g004050.1基因片段，创造出棉花雄性不育系，且雄性不育表型可稳定遗传至下一代，不育性能稳定。
28.(2)本发明确定在突变体早期花蕾期外施5
×
10-4
mol/l的茉莉酸甲酯可恢复ghaoc4不育系的育性，且恢复育性的ghaoc4突变体的自交后代的雄性保持不育，可用作保持系使用，适合进行棉花杂交种的生产。
附图说明
29.图1：本发明中用于创造基因编辑棉花材料的ghu6.7::sgrna1-sgrna2质粒载体图谱。附图标记说明：图1中的左下角sgrna功能元件已用圆角方框标出，ld t-dna和rb t-dna中间的片段为插入到基因组中的t-dna片段。
30.图2：本发明的ghaoc4转基因株系序列编辑图。附图标记说明：图2中的a图第一行为sgrna序列，wt为野生型序列，-1，-2，-3，-4，-5，-6，-7分别代表编辑单株，以上7个单株均存在ghaoc4的编辑，根据图2中的b图中southern结果显示，-2，-7的转基因插入拷贝为单拷贝。图2中的c图显示-2，-3，-6，-7编辑单株的ghaoc4表达水平降低。sgrna靶位点和pam区域分别以绿色和红色背景突出显示，省略的核苷酸以虚线表示。
31.图3：本发明的t0棉花单株表型图。附图标记说明：图3中的a图-c图分别为wt(野生型)、ghaoc4-2、ghaoc4-6单株开花当天的花，图3中的d图-f图分别为wt(野生型)、ghaoc4-2、ghaoc4-6单株开花当天的整个花药；图3中的g图-i图分别为wt(野生型)、ghaoc4-2、ghaoc4-6单株开花当天的单个花药；图3中的j图-l图分别为wt(野生型)、ghaoc4-2、ghaoc4-6单株开花当天花粉ttc(氯化三苯基四氮唑)染色。
32.图4：本发明的ghaoc4编辑t0代与野生型棉花花药石蜡切片。与野生型相比，t0代转基因棉花的花药在绒毡层降解时期和花药开裂时期花粉出现皱缩。附图标记说明：图4中的a图-c图分别为wt(野生型)、ghaoc4-2、ghaoc4-6四分体时期花药切片；图4中的d图-f图
分别为wt(野生型)、ghaoc4-2、ghaoc4-6绒毡层降解时期花药切片；图4中的g图-i图分别为wt(野生型)、ghaoc4-2、ghaoc4-6花药开裂时期花药切片。ts:四分体时期,tds:绒毡层降解时期,ads:花药开裂时期,t:四分体,tp:绒毡层,ms:小孢子,p:花粉,en:内皮层。比例尺：图4中的a图-c图中为20μm，图4中的d图-i图中为50μm。
33.图5：本发明的ghaoc4编辑t0代与野生型扫描电镜观察。与野生型相比，t0代植物在四分体时期的四分体、绒毡层降解时期的小孢子和花药开裂时期的花粉表面附有其他物质，且小孢子和花粉出现皱缩。附图标记说明：图5中的a图-c图分别为wt(野生型)、ghaoc4-2、ghaoc4-6四分体扫描电镜观察；图5中的d图-f图分别为wt(野生型)、ghaoc4-2、ghaoc4-6绒毡层降解时期小孢子观察；图5中的g图-i图分别为图5中的d图-f图的放大图；图5中的j图-l图分别为wt(野生型)、ghaoc4-2、ghaoc4-6花药开裂时期花粉观察；图5中的m图-o图分别为图5中的j图-l图的放大图。ts:四分体时期,tds:绒毡层降解时期,ads:花药开裂时期。比例尺：a-c中为20μm，d-i中为100μm，g-i中为50μm，j-l中为100μm，m-o中为50μm。
34.图6：本发明的ghaoc4编辑t0代与野生型透射电镜观察。与野生型相比，t0代植物的小孢子和花粉细胞缺少内容物，出现皱缩。附图标记说明：图6中的a图-c图分别为wt(野生型)、ghaoc4-2、ghaoc4-6四分体透射电镜观察；图6中的d图-f图分别为wt(野生型)、ghaoc4-2、ghaoc4-6绒毡层降解时期小孢子透射电镜观察；图6中的d-f标记分别为图6中的d图-f图中刺突的放大图；图6中的g图-i图分别为wt(野生型)、ghaoc4-2、ghaoc4-6花药开裂时期花粉透射电镜观察；图6中的g-i标记分别为图6中的g图-i图的放大图。ts:四分体时期,tds:绒毡层降解时期,ads:花药开裂时期，in:内壁，ne:外壁内层，ba:基柱，te:基盖，elw:额外层，s:淀粉，ld:脂滴。比例尺：a-c中为5μm，d-i中为10μm，d-i中为2μm。
35.图7：本发明的ghaoc4编辑f1代不育株与野生型茉莉酸含量测定。ghaoc4编辑t0代完全不育材料与野生型(即非转基因)陆地棉品种的杂交f1代中有cas9蛋白存在且hi-tom检测sgrna1靶标位点突变率在80％以上的材料表现为雄性完全败育，利用此类材料进行茉莉酸含量测定，与野生型相比，f1代花药中茉莉酸含量显著下降。
36.图8：本发明的ghaoc4编辑f1代不育株外源茉莉酸甲酯喷施效果。在常温下向ghaoc4编辑f1代早期花蕾喷施5
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10-4
mol/l茉莉酸甲酯可以恢复ghaoc4编辑后代雄性育性。附图标记说明：图8中的a图为wt(野生型)、ghaoc4-2、ghaoc4-6四分体时期、绒毡层降解时期和花药开裂时期的花药中茉莉酸含量测定；图8中的b图和d图、f图和h图、j图和l图分别为ghaoc4-2和ghaoc4-6编辑f1代常温下早期花蕾喷施0.05％吐温20后开花当天的花、花药、花粉的ttc染色；图8中的c图和e图、g图和i图、k图和m图分别为ghaoc4-2和ghaoc4-6编辑f1代常温下早期花蕾喷施溶于0.05％吐温20的5
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10-4
mol/l茉莉酸甲酯后开花当天的花、花药、花粉的ttc染色。
37.图9：本发明的外源茉莉酸甲酯喷施后雄性育性恢复正常的ghaoc4突变体的自交f1代雄性保持不育。对喷施5
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10-4
mol/l茉莉酸甲酯溶液后雄性育性恢复正常的ghaoc4突变体进行自交，获得f1代种植于常温下，花药开裂期观察发现雄性不育表型与ghaoc4突变体t0代一样，雄性完全不育。附图标记说明：图9中的a图、d图和g图分别为wt(野生型)开花当天的花、花药、花粉ttc染色；图9中的b图、e图和h图分别为ghaoc4-2与wt(野生型)杂交f1代完全不育单株，喷施5
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10-4
mol/l茉莉酸甲酯溶液后雄性育性恢复正常后再进行自交，获得自交f1代种植于常温下开花当天的花、花药、花粉ttc染色。图9中的c图、f图和i图分别为
ghaoc4-6与wt(野生型)杂交f1代完全不育单株，喷施5
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10-4
mol/l茉莉酸甲酯溶液后雄性育性恢复正常后再进行自交，获得自交f1代种植于常温下开花当天的花、花药、花粉ttc染色。
具体实施方式
38.对序列表的说明：
39.序列表seq id no：1是本发明的一个基因片段(命名为ghir_d08g004260.1基因片段)的核苷酸序列。长度为537bp。
40.序列表seq id no：2是本发明的另一个基因片段(命名为ghir_a08g004050.1基因片段)的核苷酸序列。长度为537bp。
41.序列表seq id no：3是ghaoc4基因二个保守区域共同靶位点sgrna1的核苷酸序列。
42.序列表seq id no：4是ghaoc4基因ghir_d08g004260.1特异靶标sgrna2的核苷酸序列。
43.实施例1：ghaoc4基因的sgrna设计
44.选陆地棉ghaoc4(ghir_d08g004260.1和ghir_a08g004050.1)的保守区域设计共有的靶位点sgrna1(其序列如seq id no：3所示)和ghir_d08g004260.1特异靶标sgrna2(其序列如seq id no：4所示。
45.表1 ghaoc4基因的sgrna序列
[0046][0047]
表1说明：加粗处的碱基为pam(前间区序列邻近基序，protospacer adjacent motifs)序列表seq id no：5是ghaoc4基因编辑载体的功能元件序列。
[0048]
aagcatcagatgggcaaacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgcaggtttctgacttaaacgagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcaacaaagcaccagtggtctagtggtagaatagtaccctgccacggtacagacccgggttcgattcccggctggtgcaccagctgttaagccgctcc gttttagagctagaa
[0049]
ghir_d08g004260.1_a as:tcgtttaagtcagaaacctg tgcaccagccgggaat
[0050]
ghir_d08g004260.1_b s:caggtttctgacttaaacga gttttagagctagaaata
[0051]
ghir_d08g004260.1_b as:ggagcggcttcaacagctgg tgcaccagccgggaat
[0052]
inf ghir_d08g004260.1_b as:ttctagctctaaaacggagcggcttcaacagctgg
[0053]
其中两端小写字母序列为infusion一步克隆使用的同源序列，斜体字体为trna，加粗及下划线字体为两条sgrna，这两条sgrna后续构建本发明载体的引物序列。
[0054]
实施例2：crispr/cas9载体的构建
[0055]
利用重叠延伸的pcr方法将两个sgrna与trna、grna进行串连，然后用一步克隆法
构建到crispr/cas9载体prgeb32-ghu6.7-nptⅱ上。具体操作步骤如下：
[0056]
(1)第一次pcr扩增出两个小片段，pcr反应体系如表2所示。
[0057]
表2 pcr反应体系
[0058][0059]
pcr条件：95℃5min，95℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，共3个循环；然后95℃30sec，60℃30sec，72℃20sec，共27个循环，72℃5min，15℃，保存。
[0060]
(2)利用重叠延伸pcr将片段1和2拼接，产生片段3的pcr的反应体系如表3所示。
[0061]
表3 pcr反应体系
[0062][0063]
pcr条件：95℃5min，95℃30sec，59℃30sec，72℃20sec，共28个循环，72℃5min，15
℃保存。
[0064]
(3)载体酶切(bsai购自北京neb公司，货号：r3733l)，酶切体系如表4所示。
[0065]
表4酶切体系
[0066][0067]
37℃下孵育5h。
[0068]
(4)连接(clonexpress entry step cloning kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司)
[0069]
表5连接体系
[0070][0071]
37℃孵育30min，冰上静置5min。
[0072]
(5)转化至gv3101农杆菌感受态，利用常规的卡那霉素进行抗性筛选(见图1所示的载体图：pcr阳性鉴定(为本领域的常规方法，wang et al.,2018)，利用u6-7 f作正向引物测序(gc rich)具体序列如下:
[0073]
u6-7 f:tgtgccactccaaagacatcag
[0074]
实施例3：利用ghaoc4突变体的创制和基因型的鉴定
[0075]
通过农杆菌介导的遗传转化和crispr/cas9系统(wang et al.,2018)在陆地棉品种jin668(棉花品种jin668由河南省农业科学院经济作物研究所惠赠)中对ghaoc4基因进行定点突变。具体过程如下：首先采用带有ghaoc4编辑位点的prgeb32-ghu6.7-nptⅱ载体的农杆菌对棉花品种jin668的下胚轴进行侵染，在侵染转化后，编辑载体将t-dna(图1中t-dna部分)插入到jin668的基因组中。seq id no:5中所述的编辑元件就可以在sgrna的引导下，结合到目的基因(ghaoc4)74bp和465bp的位置，对其进行编辑和突变(wang et al.,2018)。经组织培养(li et al.2019)，最终获得了59株转基因阳性材料。利用hi-tom平台对获得的转基因材料进行crispr/cas9系统诱导的突变类型鉴定。具体实施过程如下：首先提取获得转基因材料的dna样品；其次利用设计好的hi-tom检测引物(正向引物：ggagtgagtacggtgtgccatgtatatgagatgaatgaaagag；反向引物：gagttggatgctggatggttgctaaaagggacaatatcac；序列中小写部分为接头序列)进行两轮pcr，并对pcr产物进行纯化回收。将纯化后的pcr产物送相关商业测序公司进行二代测序，最后在网站上(http://www.hi-tom.net/
hi-tom/)对测序的结果进行分析。分析结果表明有10个单株在sgrna1靶标位点突变率超过60％，其中7个单株突变率超过80％的表现为雄性败育；有3个单株在sgrna2靶标位点突变率超过60％，雄性育性性状正常。对7个在sgrna1靶标位点突变率超过80％表现为雄性败育的单株编辑序列进行展示(图2)，结果显示7个单株在两个位点都有编辑，且sgrna1靶向ghir_d08g004260.1和ghir_a08g004050.1，sgrna2只靶向ghir_d08g004260.1(图2)，说明这两个基因存在功能冗余，只有当这两个基因同时被编辑才会出现雄性不育的表型。
[0076]
实施例4：ghaoc4突变体表型分析
[0077]
从上述7个单株中选择在sgrna1靶标位点编辑率达到100％的两个株系ghaoc4-2和ghaoc4-6进行下一步的表型观察。首先对突变体ghaoc4-2、ghaoc4-6和wt开花当天的花进行形态观察，发现ghaoc4-2和ghaoc4-6相比wt，花更小，花丝较短，花药不能正常开裂，且花粉不能被ttc染色(图3)。其次进行石蜡切片观察，表明在两个突变体植株中四分体能正常形成，但在花药发育的中后期小孢子发育异常(图4)。然后进行扫描电镜观察，表明在两个突变体植株中四分体能正常形成，但四分体上被覆盖上一层物质，且中后期小孢子发育异常，表面刺突缺少(图5)。最后进行透射电镜观察，表明在两个突变体植株中从四分体开始小孢子缺少内容物，中后期花粉皱缩，刺突数目明显减少(图6)。这些结果表明两个突变体材料均表现为雄性败育。
[0078]
ttc花粉活力染色观察具体步骤：
[0079]
取8克ttc(2，3，5-三苯基氯化四氮唑，分子量334.8)溶于1l磷酸缓冲液(三水合磷酸氢二钾26.6g，磷酸氢二钾10.2g)配制成2％的工作液，4℃避光保存。取用时分装于1.5ml离心管中，将花药塞入，37℃培养箱中反应30min后取出在显微镜下观察。
[0080]
石蜡切片具体步骤如下：
[0081]
(1)固定：取转基因材料各个时期的花药置于50％的faa固定液(无水乙醇：冰醋酸：甲醛：蒸馏水＝10：1：2：7)中，固定后抽真空3次，每次15min，换上新的固定液于常温下固定24h以上；
[0082]
(2)脱水：将固定好的样品分别用70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇(含1％伊红)逐级脱水，每级1h。无水乙醇两次，每次1h，每级用量不超过瓶体积的1/2；
[0083]
(3)透明:样品在体积比为1/5、2/5、3/5、4/5氯仿逐级透明，每级1h，纯氯仿两次，每次1h，每级用量不超过瓶体积的1/2；
[0084]
(4)浸蜡:透明完后加等体积碎蜡，并在37℃恒温箱中温育2d以上。后以体积比为50％(石蜡：二甲苯＝1：1)、75％(石蜡：二甲苯＝3：1)的石蜡逐级浸蜡，每级0.5h，纯蜡3次，每次0.5h；
[0085]
(5)包埋修块:浸蜡完毕后用温度适中的纯蜡在折叠好的纸盒中包埋样品，待石蜡凝固后，将蜡块修整为梯形状；
[0086]
(6)切片:用切片机将包埋有样品的石蜡块切成10μm厚度的蜡带，再将蜡带放置于涂抹有10μl多聚赖氨酸和200μl蒸馏水的载玻片上展开。吸去多余的蒸馏水，将其置于37℃展片台上烘干，后置于37℃恒温箱中烘片3d以上；
[0087]
(7)脱蜡染色:脱蜡的基本过程为二甲苯浸泡两次，每次15min，后用100％、95％、85％、70％、50％、30％乙醇、蒸馏水逐级复水，每级10s左右。将载玻片置于0.05％甲苯胺蓝染色5min，染色完后，用蒸馏水、30％、50％、70％、85％、95％的乙醇、无水乙醇、1/2无水乙
醇 1/2二甲苯逐级脱水，每级10s左右，再浸泡在二甲苯中；
[0088]
(8)封片:将切片从二甲苯中取出，用树胶封片，烘片3d以上。后用光学显微镜(zeisshal 100)观察拍照。
[0089]
实施例5：利用外源茉莉酸甲酯喷施实现不育系与保持系之间的转换
[0090]
对wt、ghaoc4-2和ghaoc4-6三个发育时期的花药进行茉莉酸含量测定(min et al.,2013)，发现ghaoc4-2和ghaoc4-6花药中茉莉酸明显降低(图7)。后进行外源茉莉酸甲酯溶液的喷施试验，设定浓度梯度为：0mol/l；5
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mol/l；5
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mol/l；5
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mol/l)，后喷施于ghaoc4突变体早期花蕾上，进行表型观察，最终确定5
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mol/l为最适的喷施浓度，该浓度的茉莉酸甲酯溶液可以恢复ghaoc4突变体雄性不育表型且不会造成早期花蕾脱落(图8)。接着对ghaoc4突变体喷施5
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mol/l茉莉酸甲酯后雄性育性恢复的ghaoc4突变体进行自交，获得的种子种植后植株的雄性性状保持不育(图9)。试验证明外源茉莉酸甲酯溶液喷施可以提高ghaoc4突变体花药中茉莉酸含量，从而恢复其育性，而自交f1代棉花不育性被稳定遗传，从而实现不育系与保持系之间的转换。
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