一株高产绿原酸的栗褐芽孢杆菌诱变菌株的制作方法

1.本发明涉及微生物技术改造技术领域，具体涉及一株高产绿原酸的栗褐芽孢杆菌诱变菌株。


背景技术：

2.绿原酸(cga，5-o-咖啡酰奎尼酸)是由咖啡酸和奎尼酸组成常见的植物次生代谢产物，保护植物细胞免受环境胁迫中起着重要作用。研究表明，cga具有多种生理功能，例如抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化剂、清除自由基、预防心血管疾病、神经保护作用、解毒功能等，是国际公认的“植物黄金”。近年来，国内外对绿原酸的研究格外关注，对于绿原酸的分布、生物合成途径和生物活性应用等多方面开展了深入研究。而植物内生菌作为一种新型的微生物资源，具有与植物宿主合成相同或者相似活性成份的能力，这为次生代谢产物的发掘提供了新的途径。因此，内生细菌可以用作某些植物中天然代谢产物的潜在替代来源。由于野生菌株合成绿原酸产量低，其在医学或商业中的应用受到限制。因此，有必要采取策略改变菌株合成cga的方式来克服这些缺陷。
3.绿原酸最早在1837年，robiquet等从咖啡豆中分离出一种酸性物质，该物质经氯化铁处理后变成绿色，但是并没有提出该物质的具体概念。直到1846年，payen等在报道绿咖啡豆中的酚类成份时将该酸性物质定义为“绿原酸”。同年，rochlederd进一步研究发现绿原酸在含氨溶液中呈黄色，但暴露在氧气中变为绿色，并提出绿原酸的分子式为c
16
h9o8。随后，gorter等(1908)确认该物质是由奎尼酸和咖啡酸缩合而成的绿原酸，但目前国内外对绿原酸在微生物合成方面的研究仍然相对落后。而当前世界绿原酸的提取源头依然是天然植物，如咖啡豆、金银花、杜仲以及向日葵等。但是，对于任何一种物质而言，单一的来源途径不利于可持续的发展。随着国内外对绿原酸的不断研究，使得绿原酸的应用越来越广泛，然而在有些方面仍然需要我们努力：拓展绿原酸的来源途径；开发高产绿原酸的制备工艺，为大规模工业生产提供了一种有效的策略以及开发和利用绿原酸生产菌株提供理论基础。


技术实现要素：

4.本发明为解决上述技术问题，利用紫外-微波诱变改造现有菌株，得到一株高产绿原酸的菌株。
5.为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
6.一株高产绿原酸的栗褐芽孢杆菌诱变菌株，命名为栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14，于2021年05月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc m 2021547，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
7.一种生产绿原酸的发酵方法，采用如上所述的栗褐芽孢杆菌bacillus badiusuwb19-14为发酵菌。
8.优选的，发酵方法包括摇瓶发酵和发酵罐发酵，所述的摇瓶发酵采用优化培养基，
所述发酵罐发酵采用基础发酵培养基和优化培养基。
9.优选的，所述优化培养基为木薯粉30g
·
l-1
、葡萄糖30g
·
l-1
、酵母提取物30g
·
l-1
、mgso
4 0.2g
·
l-1
、h2o定容至1l；
10.优选的，所述基础发酵培养基为牛肉浸粉5g
·
l-1
、蛋白胨10g
·
l-1
、nacl 5g
·
l-1
、琼脂20g
·
l-1
、h2o定容至1l。
11.优选的，所述摇瓶发酵的发酵温度为32℃，发酵时间为7天。
12.栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14与栗褐芽孢杆菌b19相比，本发明的菌株具有更高的绿原酸发酵能力。
13.本发明的菌株经250ml三角瓶发酵结果显示，突变菌株uwb19-14生产绿原酸达13.78mg
·
l-1
，比出发菌株b19(1.35mg
·
l-1
)提高了9.21倍，且具有良好的遗传稳定性。
14.如上所述栗褐芽孢杆菌诱变菌株在提高绿原酸产量方面的应用。
15.本发明的菌株在优化培养基及培养条件下发酵7天，绿原酸产量最高达到52.93mg
·
l-1
。此发酵条件下，其绿原酸产量比出发菌株b19提高了38.2倍。
16.本发明的菌株利用优化培养基将突变株uwb19-14在5l发酵罐中扩大培养，发现在菌体生长至对数期时绿原酸产量达到最大(61.64mg
·
l-1
)，其绿原酸产量比出发菌株b19提高了44.66倍。
17.与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：
18.本发明栗褐芽孢杆菌uwb19-14是利用现有菌株经过紫外-微波诱变获得的一株突变菌株，通过发酵培养发现uwb19-14发酵绿原酸的能力显著增强，与现有技术的绿原酸产量相比，属于高产绿原酸菌株。
19.保藏信息说明
20.栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14于2021年05月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏号为cctcc m 2021547。
附图说明
21.图1为本发明栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14的紫外诱变时间与致死率曲线。
22.图2为本发明栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14的微波处理时间与致死率曲线。
23.图3为绿原酸的标准曲线(hplc)。
24.图4为绿原酸标准品与本发明栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14的高效液相色谱(hplc)分析。
25.图5为栗褐芽孢杆菌uwb19-14的菌落形态(图5a)和革兰氏染色(图5b)。
26.图6为栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)b19(图a1、b1)与本发明栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14(图a2、b2)的扫描电镜图；a1、a2为10000倍，b1、b2为40000倍。
27.图7为本发明栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14的电泳图。
28.图8为本发明栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14的250ml摇瓶发酵条件优化。
29.图9为本发明栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14的5l发酵罐基础培养基
发酵生产cga过程曲线。
30.图10为本发明栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14的5l发酵罐优化培养基发酵生产cga过程曲线。
具体实施方式
31.下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。菌株b19为发明人之前发现的菌株，经hplc色谱检测其绿原酸产量是9.77含量为1.35mg
·
l-1
。
32.实施例中采用的培养基及配方
33.细菌基础培养基：牛肉膏3g
·
l-1
、蛋白胨10g
·
l-1
、nacl 5g
·
l-1
、琼脂20g
·
l-1
、h2o定容至1l、ph 7.2-7.4。
34.初筛固体培养基：牛肉膏3g
·
l-1
、蛋白胨10g
·
l-1
、nacl 5g
·
l-1
、alcl
3 2.5g
·
l-1
、nano
2 5g
·
l-1
、琼脂20g
·
l-1
、h2o定容至1l、ph 9.0。
35.基础发酵培养基：牛肉浸粉5g
·
l-1
、蛋白胨10g
·
l-1
、nacl 5g
·
l-1
、琼脂20g
·
l-1
、h2o定容至1l、1％的接种量，37℃、ph 7.0、220rpm。
36.实施例1
37.栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14的紫外-微波诱变筛选
38.1.1紫外诱变致死率曲线及最佳剂量
39.将出发菌株b19制备成种子液，用生理盐水将种子液稀释至10-6
倍，分别取稀释后所得种子液100μl于细菌基础培养基和初筛固体培养基中并均匀涂布，倒置于37℃恒温箱中培养3-4小时；然后将上述两个培养基的平板置于功率15w的紫外灯下30cm处进行照射，每个梯度(即照射时间为0、4、8、10、12、14、16、18、20、22、24s)设置三个平行；以15w照明灯照射相应时间作为空白对照组；均放置于37℃恒温箱中培养48h，并分别记录每个平板上的菌落数目，按照公式(1-1)计算诱变致死率，绘制致死率曲线(图1)。
40.致死率＝(对照组菌落数-实验组菌落数)/对照组菌落数
×
100％
ꢀꢀ
(1-1)
41.1.2微波诱变致死率曲线及最佳剂量
42.以紫外诱变获得的正突变菌株中遗传最稳定且活性较高者进行微波诱变，制备该菌株的菌悬液，用无菌生理盐水将其稀释至10-6
，吸取稀释后的1ml菌悬液放入2ml的ep管内，采用高火微波挡(800w、脉冲频率2450mhz)进行诱变，每次微波辐射ep管10s后取出置于冰水混合物中冷却5s(以防诱变时微波热效应导致菌体大量死亡)；对不同时间梯度进行微波辐射(即辐射时间为0、10、30、50、70、90、110、130、150s)，诱变结束后，吸取100μl菌液均匀涂布于细菌基础培养基和初筛固体培养基的平板上，37℃静置培养48h，观察菌株生长情况，统计菌落数，按照公式(1-1)计算致死率，绘制致死率曲线(图2)。
43.1.3初筛方法
44.待“1.2”中诱变处理过微波诱变的菌株在初筛固体培养基上生长48h后，选择菌落周围最先显现出大范围紫红色和紫红色圆圈单菌落作为初筛菌株，并对其进行编号和斜面保藏。
45.1.4复筛方法
46.将挑选出来的初筛菌株接种到细菌基础培养基中生长12h，取1ml菌液于250ml三角瓶中(含50ml基础发酵培养基)发酵3天。液体发酵完成后，取20ml发酵液进行超声破胞(20hz，600w)20min，在常温下，10000rpm离心10min。取上清液加入1:1的75％乙醇静置过夜，调ph为2.0-3.0，45℃真空浓缩至2ml，添加3ml色谱级甲醇溶解。利用高效液相色谱法检测样品中的cga。选择表现出在327nm紫外检测下显著提高的菌株作为复筛菌株。经紫外-微波复合诱变筛选的突变菌株发酵绿原酸产量如表1所示：
47.表1紫外-微波复合诱变所得菌株复筛结果
48.菌株绿原酸产量(mg
·
l-1
)菌株干重(g
·
l-1
)出发菌株b191.35
±
0.131.90
±
0.04uwb19-17.70
±
0.251.85
±
0.04uwb19-23.28
±
0.241.78
±
0.06uwb19-38.42
±
0.111.84
±
0.05uwb19-47.85
±
0.361.79
±
0.04uwb19-56.22
±
0.071.76
±
0.04uwb19-611.88
±
0.081.78
±
0.04uwb19-75.46
±
0.281.85
±
0.04uwb19-86.80
±
0.201.89
±
0.07uwb19-97.23
±
0.131.75
±
0.07uwb19-102.40
±
0.111.91
±
0.07uwb19-116.29
±
0.181.83
±
0.10uwb19-126.15
±
0.161.94
±
0.06uwb19-137.22
±
0.171.82
±
0.05uwb19-1413.78
±
0.212.08
±
0.14uwb19-155.27
±
0.171.97
±
0.03uwb19-166.49
±
0.161.85
±
0.12uwb19-171.01
±
0.081.86
±
0.07uwb19-188.16
±
0.401.82
±
0.09uwb19-199.67
±
0.221.81
±
0.09uwb19-208.35
±
0.221.83
±
0.04
49.1.5 uwb19-14的传代稳定性
50.为了获得高产cga的生产菌株，通过连续多次紫外-微波诱变筛选出性状优良的突变菌株进行传代稳定性试验；在细菌基础培养基上活化并传代5次后，使用250ml三角瓶进行发酵培养，37℃，200rpm，发酵7天，测定发酵液中cga的产量(表2)。
51.表2 uwb19-14菌株遗传稳定性
52.传代次数12345cga含量(mg
·
l-1
)13.16
±
0.0913.99
±
0.2913.35
±
0.4913.5
±
0.1613.82
±
0.27菌株干重(g
·
l-1
)2.01
±
0.051.96
±
0.031.86
±
0.101.95
±
0.052.02
±
0.04
53.实施例2
54.uwb19-14的生长曲线
55.取1ml活化好的出发菌株b19和菌株uwb19-14接种到250ml三角瓶中(含50ml基础发酵培养基)，在37℃、200rpm摇床中培养，每隔2h取一次菌液于酶标仪600nm处测吸光值，每组三个平行，绘制生长曲线(图3)。
56.实施例3
57.uwb19-14的此生代谢产物-绿原酸的定量分析(高效液相色谱，hplc)
58.3.1样品制备方法
59.将uwb19-14在细菌基础培养基中发酵培养(37℃、200rpm条件下培养7天)，发酵完成后取20ml发酵液使用浓度为5mol
·
l-1
的hcl将ph值调至2.0-3.0，超声破碎(25khz，500w)30min释放胞内的物质，10000rpm离心10min，取上清液与体积浓度为75％的乙醇溶液1：1混合超声提取30min，然后避光静置过夜，采用旋转真空浓缩仪45℃下浓缩至干，加入3ml色谱级甲醇溶解，10000rpm离心10min，上清液用有机过滤器(0.22μm)过滤，取10μl样品进行hplc分析(图4)。
60.3.2色谱条件
61.wasters高效液相检测条件：c18柱(echway corporation，china；jade-pakods-aq；250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相为0.5％乙酸a和乙腈b，流动相比例为0min，95％a；5min，92％a；15min，50％a；20min，10％a；21min，95％a；25min，95％a；进样量10μl，柱温35℃，流速为1.0ml
·
min-1
，检测波长为327nm，通过内标法定性分析和外标法定量分析。
62.3.3绿原酸的标准曲线测定
63.将20mg绿原酸标准品全部溶于20ml色谱级甲醇中，得到1g
·
l-1
标准品母液，将1g
·
l-1
母液稀释分别得30、40、50、60、80、100、120、150、200、300mg
·
l-1
的标准品稀释液，使用hplc测定保留时间和峰面积，每组平行3次，以cga浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制cga标准曲线(图5)。
64.实施例4
65.uwb19-14的鉴定
66.4.1菌落形态鉴定
67.挑取甘油保存的uwb19-14在细菌基础培养基上划线，于37℃恒温培养箱培养24h，观察菌落形态；该菌落形状椭圆，边缘整齐，表面光滑、不粘绸、平坦、呈乳白色(图5a)。uwb19-14菌株直径(宽度)较出发菌株缩小了1.45倍(p《0.01)，长度增加了1.05倍(p《0.01)。
68.4.2细胞形态观察
69.挑取活化好的单菌落使用北京索莱宝革兰氏染色试剂盒进行试验，在100倍油镜下观察菌体的形态；经革兰氏染色发现，菌株uwb19-14呈现蓝紫色，属于革兰氏阳性菌，也是一种杆状菌(图5b)。
70.4.3 16s rdna鉴定
71.使用tiangen细菌基因组dna提取试剂盒提取b19菌株的dna，根据前人报道，扩增16s rdna使用通用引物27f和1492r；pcr体系为50μl：通用引物27f和1492各1μl，2
×
es taq master mix(dye)酶25μl，ddh2o 21μl，dna模板2μl；所用到的引物序列如下：
72.表3 16s rdna扩增引物
[0073] 16s rdna扩增引物27f5
′‑
agagtttgatcatggctcag-3
′
1492r5
′‑
tagggttaccttgttacgactt-3
′
[0074]
反应程序：95℃2min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，35cycles，72℃2min，4℃保存；对pcr产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳验证(电泳图如图7所示)，最后送公司进行测序。
[0075]
测序结果如序列表所示，uwb19-14菌株的16s rdna序列的扩增长度为1422bp(序列如seq no.1所示)，提交genbank数据库进行比对，结果显示，该序列与bacillus badius 110(nr 112633)同源性达99％，结合uwb19-14菌株形态学和显微镜观察等特性，菌株鉴定为bacillus badius菌属的一个菌株，命名为栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14。
[0076]
实施例5
[0077]
栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14的出发菌株b19与诱变菌株uwb19-14(即栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14)的扫描电镜观察
[0078]
(1)取样：将实施例1“1.4”中获得的诱变菌株uwb19-14接种于细菌基础培养基中发酵培养3天，取0.5ml发酵液8000rpm离心3min，弃上清，加入0.1mol
·
l-1
磷酸缓冲液1ml，用移液枪吹打，8000rpm离心3min，弃上清，重复3次；
[0079]
(2)固定：加入0.5ml 2.5％戊二醛固定液于4℃冰箱固定2-4h，8000rpm离心3min，弃上清，加入0.1mol
·
l-1
磷酸缓冲液1ml，用移液枪吹打，8000rpm离心3-5min，弃上清，重复3次；加入0.5ml 2.5％甲醇固定4-6h，加入0.1mol
·
l-1
磷酸缓冲液1ml，用移液枪吹打，8000rpm离心3-5min，弃上清，重复3次；
[0080]
(3)脱水：乙醇梯度洗脱，30％、50％、70％、85％、95％各1次，100％乙醇2次，叔丁醇置换2次；15-20min/次，8000rpm，3-5min；
[0081]
(4)干燥：置于40℃烘箱烘干至干燥。
[0082]
通过扫描电镜观察发现紫外-微波处理后的栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14表型发生了显著变化(图6)。出发菌株b19和诱变菌株uwb19-14的菌体形态在10000倍下显微结构差别较大，发现出发菌株b19的菌体形状规则，菌株较短，但较为粗壮；而诱变菌株uwb19-14的直径变小，长度增加。
[0083]
为了更精确的比较菌株在诱变前后的形态变化，通过imagej软件(imagej v1.8.0官方版)测量菌株诱变前后直径的宽度和长度大小，并通过spss statistics 26软件(spss 22.0官方版)进行统计学分析。结果如表4和表5所示，诱变处理后，菌体形态宽度为0.3651μm，较处理前(0.8958μm)缩小了1.45倍(p《0.0001)(表4)；诱变处理后菌体的长度为4.8784μm，是诱变前(2.3772μm)的1.05倍(p《0.001)(表5)；说明菌体形态变化比较显著，紫外-微波复合诱变效果较好。
[0084]
表4出发菌株b19与诱变菌株uwb19-14的菌体宽度的比较
[0085][0086]
表5出发菌株b19与诱变菌株uwb19-14的菌体长度的比较
[0087][0088]
实施例6
[0089]
栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14的250ml摇瓶发酵条件优化
[0090]
6.1培养基及配方
[0091]
优化培养基：木薯粉30g
·
l-1
、葡萄糖30g
·
l-1
、酵母提取物30g
·
l-1
、mgso
4 0.2g
·
l-1
、h2o定容至1l；
[0092]
6.2栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-1的单因素优化
[0093]
通过单因素试验逐次对栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14的发酵条件：温度(25℃、28℃、32℃、37℃、40℃)、接种量(1％、2％、3％、4％、5％，体积百分比)、转速(150、180、200、220、240rpm
·
min-1
)、ph(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)和装液量(0、40、50、60、80、100ml/250ml)进行优化，结果表明在ph 9.0，培养温度32℃、接种量4％、转速220rpm、装液量30ml/250ml条件下，发酵7天时绿原酸产量最高，达到52.93mg
·
l-1
(图8)。
[0094]
实施例7
[0095]
栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14的5l发酵罐扩大生产
[0096]
7.1培养基及配方
[0097]
(1)基础发酵培养基：牛肉浸粉5g
·
l-1
、蛋白胨10g
·
l-1
、nacl 5g
·
l-1
、琼脂20g
·
l-1
、h2o定容至1l、1％的接种量，37℃、ph 7.0、220rpm；
[0098]
(2)优化培养基：木薯粉30g
·
l-1
、葡萄糖30g
·
l-1
、酵母提取物30g
·
l-1
、mgso
4 0.2g
·
l-1
、h2o定容至1l；4％的接种量，32℃、ph 9.0、220rpm。
[0099]
7.2 5l发酵罐放大实验
[0100]
栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14置于5l发酵罐的基础发酵培养基中培养，发现绿原酸含量在1-4天显著增加，发酵培养至第8天获得最高产量13.46mg
·
l-1
(图9)。当栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14置于5l发酵罐的优化培养基中培养时，菌株uwb19-14在培养第一天就开始大量合成cga，cga的最高产量达61.64mg
·
l-1
(图10)。
[0101]
该结果表明，优化培养基中木薯粉具有较高的营养(同时含有淀粉、蛋白质、脂质、纤维、钙和磷等多种营养物质)和功能价值，能够有效促进菌株的营养吸收，以廉价原料木薯粉为碳源，更符合植物内生菌生长的营养物质来源。
[0102]
综上检测表明，栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)uwb19-14经过复合诱变处理后，发酵生产绿原酸的能力显著增强。因经诱变处理后菌株的表型发生显著变化，对菌株进一步优化后获得一株工业化菌株。因此，可应用到实际生产当中，不仅拓展了绿原酸的来源途径，且改善生态环境的可持续发展。
[0103]
发酵工艺放大试验是指在实验室摇瓶基础上已获得高产基因表达的最适条件，再逐步转移至发酵罐中生产，为了更加深入了解诱变菌株uwb19-14的发酵特性和生产cga的能力，以前期在摇瓶中获得的最优发酵条件转移至5l发酵罐中发酵培养，探究放大生产过程中cga产量的变化规律，为将来实现cga的工业化生产打下坚实的基础。
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本发明栗褐芽孢杆菌uwb19-14，后期研究过程通过酶学活性和中间产物分析解析
了绿原酸代谢途径中pal、tal和c3h为该菌株合成绿原酸的关键酶。
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前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。